No description available.

El tema d'estudi d'aquesta tesi és l'eliminació biològica de nitrogen d'aigües amb alta càrrega d'amoníac, més concretament, el procés de nitrificació (l'oxidació de l'amoni a nitrat). Aquesta reacció en dos passos, catalitzada per dos tipus de microorganismes (AOB i NOB), pot patir problemes d'inhibicions per amoníac i àcid nitrós. Això és especialment important quan es tracta aigua amb alta concentració d'amoni i per tant, es necessita un control del procés adequat. Tot i així, aquestes inhibicions es poden utilitzar per a aconseguir nitrificació parcial (l'oxidació de l'amoni a nitrit), la qual combinada amb el procés de desnitrificació, aporta beneficis importants pel què fa a la utilització dels recursos.En aquesta tesi es mostra el desenvolupament i calibratge d'un model matemàtic per a descriure la cinètica i l'estequiometria de la nitrificació considerant les inhibicions mencionades anteriorment i tenint en compte els dos tipus de bacteris nitrificants i també els bacteris heteròtrofs. Es varen dissenyar experiments específics per a l'optimització dels paràmetres del model i amb l'ajuda d'eines d'identificabilitat de paràmetres, aquests experiments es van analitzar i millorar. Les constants d'afinitat pel substrat i els coeficients d'inhibició per substrat es van determinar dues vegades utilitzant biomasses diferents i es van obtenir resultats diferents. Això indicà que aquests paràmetres són variables i depenen de l'aclimatació de la biomassa. Es va utilitzar la tècnica d'hibridació fluorescent in situ (FISH) per a la detecció i quantificació de les fraccions bacterianes. Per a la detecció de la fluorescència es van utilitzar un microscopi d'epifluorescència, un microscopi confocal i un citòmetre de flux. Els resultats obtinguts es van comparar entre ells i es van discutir els seus avantatges i inconvenients tenint en compte la precisió dels resultats, la velocitat de l'anàlisi i la disponibilitat de l'equip. La millor metodologia va resultar ser l'observació del FISH amb el microscopi confocal encara que la citometria de flux no es va poder investigar prou a fons. El model matemàtic desenvolupat i calibrat en aquesta tesi es va utilitzar per a l'optimització de la posada en marxa d'un sistema de nitrificació completa. Es van optimitzar dues estratègies de control que posteriorment es van implementar experimentalment partint d'un inòcul procedent dels llots d'una estació de tractament d'aigües residuals urbanes. El controlador dissenyat es basava en la mesura de la velocitat del consum d'oxigen (OUR) en l'últim reactor del sistema i actuava sobre la càrrega d'entrada. Els resultats obtinguts es van comparar amb els resultats d'una posada en marxa amb control manual i es va demostrar que el control automàtic permet disminuir el temps de posada en marxa i augmentar l'estabilitat del procés. Posteriorment, els resultats experimentals es van simular amb el model matemàtic obtenint un bon ajust. Finalment, el nou model es va utilitzar per a fer prediccions del comportament del sistema a curt i llarg termini. L'enriquiment de la biomassa en microorganismes nitrificants es va comprovar mitjançant el FISH i la microscòpia confocal. La biomassa que es va obtenir després de la última posada en marxa del sistema es va utilitzar per a aconseguir la nitrificació parcial treballant a 25 ºC, 1.1 mg O2 L-1, pH de 8.3 i amb un set point d'OUR apropiat en el control automàtic. La nitrificació parcial es va mantenir de forma estable durant uns 120 dies amb una càrrega mitjana de 0.5 g N g-1 SSV d-1. L'anàlisi microbiològic amb FISH va demostrar que la població de NOB havia estat eliminada del sistema. Posteriorment, el sistema de control es va millorar amb l'adició de dues regles de control expert que van permetre l'operació estable del sistema davant d'importants pertorbacions externes. / Biological nitrogen removal of high-strength ammonium wastewater was studied in this thesis, particularly, the nitrification process (the oxidation of ammonium to nitrate). This two-step reaction, catalyzed by two kinds of bacteria (AOB and NOB), can suffer serious inhibition problems due to ammonia and nitrous acid when dealing with highly concentrated ammonium wastewater and therefore it requires adequate process control. However, these inhibitions can be used to achieve partial nitrification (the oxidation of ammonium to nitrite), which coupled to a denitrifying process leads to significant benefits in terms of use of resources.A mathematical model describing the kinetics and the stoichiometry of the nitrification process was developed and calibrated. It considered the aforementioned inhibitions and took into account both kinds of nitrifying bacteria and also heterotrophic bacteria. Specific experiments were designed for parameter estimation and parameter identifiability tools were used to analyze and improve them. Optimal experimental designs were used to calibrate most of the model parameters and the obtained values were compared with values found in the literature. Affinity constants for substrate and substrate inhibition coefficients were estimated twice using different sludges and, as a result, different values were found indicating that they change depending on the biomass acclimation. This model was coupled to the hydraulic model of the experimental system (pilot plant) and was implemented in Matlab ®. Fluorescence in situ hybridization (FISH) was used for bacterial fractions detection and quantification. Several equipments were used for fluorescence detection: an epifluorescence microscope, a confocal microscope and a flow cytometer. Biomass fractions were determined with each of the equipment and also with simulations. Obtained results were compared and the advantages and disadvantages of the tested methodologies were discussed considering the accuracy of the results, the speed of the analysis and the availability of the equipment. FISH combined with confocal microscopy turned out to be the best technique for nitrifying biomass quantification although flow cytometry could not be extensively investigated.The start-up of a complete nitrification system was optimized by means of mathematical simulation using the previously developed and calibrated method. Two automatic control strategies were optimized and implemented in the experimental system by using sludge from a municipal wastewater treatment plant as inoculum. The controller was based on the measurement of the oxygen uptake rate (OUR) in the last reactor of the system and actuated over the nitrogen loading rate. Results were compared with a start-up performed with manual control and it was demonstrated that automatic control decreased the length of the start-up and increased its stability. Then, experimental results were simulated with the nitrification model. Model predictions agreed well with experimental data. The final model was useful for both long- and short-term prediction. The sludge enrichment in nitrifying bacteria was checked with FISH and confocal microcopy.The nitrifying sludge obtained after the last start-up contained both AOB an NOB and was used to achieve partial nitrification. Some environmental conditions and the automatic control strategy were changed in order to inhibit NOB and wash them out of the system. Partial nitrification with an effluent devoid of nitrate was achieved at 25 ºC, 1.1 mg O2 L-1 and pH of 8.3 using the appropriate OUR set point for the automatic controller. Partial nitrification was run for 120 days with an averaged nitrogen loading rate of 0.5 g N g-1 VSS d-1. FISH analysis demonstrated that NOB were completely washed out. The control strategy was improved by the addition of two expert rules and stable operation was maintained even when external disturbances were provoked. Finally, a model-based study was performed to test the partial nitrification start-up strategy under different conditions and system configurations.

El present treball estudia el desenvolupament d'un procés per a l'obtenció d'una vacuna recombinant per a la protecció de les aus de les explotacions agropecuàries de la malaltia de Gumboro o IBD (Infectal Bursal Disease). El treball planteja estudiar diferents sistemes alternatius, fonamentalment dissenyats al voltant de diferents sistemes biològics, per tal de poder-ne fer, al final del mateix, una comparació en termes de valoració econòmica i en termes de viabilitat tecnològica, donat que aquests dos tipus d'estudis són els elements essencials a l'hora d'establir un bioprocés.El primer sistema analitzat consisteix en l'obtenció del virus IBD a partir de la infecció de cèl·lules Vero. Es tracta d'un sistema de producció d'una vacuna convencional, i que normalment requereix d'una posterior atenuació dels virus obtinguts per a la seva preparació. Aquesta aproximació està relativament estandarditzada, ja que s'aplica per a la producció de diferents tipus de vacunes, i de cara a aquest treball esdevé el sistema de referència. En els capítols següents, s'analitzen tres alternatives al procés anterior per a la producció de vacunes recombinants,en que l'agent vacunal ja no consisteix en el propi virus, sinó en una proteïna de l'embolcall del mateix virus, VP2, que ha estat identificada com a responsable de provocar una resposta immunològica adequada en els animals. S'analitza doncs, la possibilitat d'obtenir VP2 recombinant, fet que permetria desenvolupar vacunes més segures tant en la manipulació del procés com del producte en sí, i en la seva aplicació. El Capítol 5 es dedica a l'expressió de VP2 mitjançant un baculovirus recombinant mitjançant la infecció de cultius de cèl·lules d'insecte (Sf9).En el Capítol 6, s'estudia l'expressió de VP2 en cèl·lules bacterianes (Escherichia coli) i en llevats (Pichia pastoris). Tot i els esforços que s'han dut a terme en aquests sistemes només han permès expressar VP2 en E.coli mitjançant una proteïna de fusió, però sense aconseguir obtenir clons estables. Així doncs, per tal de poder valorar el potencial que podria oferir aquestes opcions, i fins i tot ajudar a valorar la necessitat de treballar-hi en més profunditat, el treball analitza i desenvolupa el sistema d'expressió basat en E.coli i P.pastoris emprant una altra proteïna recombinant com a model, ?-galactosidasa. Els sistemes de cultiu per a l'obtenció de ?-galactosidasa s'analitzen en els Capítol 7 (P.pastoris) i el Capítol 8 (E.coli). Encara que no s'hagi pogut expressar la proteïna inicialment desitjada, les dades obtingudes en aquests capítols permeten obtenir informació rellevant sobre aquests tipus de cultius, permetent realitzar l'estudi d'alternatives de bioprocés plantejat com a objectiu principal del treball.Finalment, el Capítol 9 planteja una síntesi de tot el treball, comparant les quatre alternatives de producció. La comparació és duu a terme mitjançant el plantejament d'un bioprocés a escala industrial per cada cas, dimensionant-lo en funció d'un escenari de producció comú i emprant les dades experimentals obtingudes en els respectius capítols pels diferents sistemes, i per acabar, la seva conseqüent valoració en termes econòmics. La vàlua d'aquesta anàlisi és permetre identificar la potencialitat de cadascun dels quatre bioprocessos, aportant elements molt interessants de cara a possibles preses de decisió sobre la seva possibilitat d'implementació. / In the present work, the development of a production process for a recombinant vaccine against IBD (Infectal Bursal Disease), a disease that affects industrial hens and chickens, has been studied. Based on different biological systems we investigated alternative systems in order to compare them in terms of economical valuation and technical viability, two important criteria that have to be considered when establishing a bioprocess in industrial scale. The first approach undertaken was the propagation of the IBD virus by infection of Vero cells, a conventional method for vaccine production that usually requires a subsequent attenuation of the virus obtained. Since this kind of system is a relatively standardised one and already applied to the production of many different types of viruses in industrial scale, it was chosen as a reference system. The following chapters deal with the analysis of three alternative processes of recombinant vaccine production compared to the reference system. In these alternative systems the viral agent is not the virus itself, but one of its capsid proteins, VP2, that has been identified to evoke an adequate immunological response in animals. For this reason obtaining a recombinant VP2 protein would permit the development of vaccines with enhanced safety regarding process manipulation, the protein itself and its application. Chapter 5 describes the production of VP2 in the baculovirus and insect cell (Sf9) expression system.In Chapter 6, the expression of VP2 in both bacteria (E. coli) and yeast (P. pastoris) was studied. In spite of efforts to produce VP2 in both systems, it was only shown to be produced in E.coli with the help of a fusion protein. However, this was without obtaining stable clones. In order to analyse the production potential of using these expression systems, a new strategy was developed utilising ?-galactosidase as a model protein instead. The cultivation systems for the expression of ?-galactosidase are described in Chapter 7 (P. pastoris) and Chapter 8 (E.coli). Although expression of the primary desired protein was not possible, , the data obtained gave relevant information regarding this kind of production bioprocesses and may facilitate in establishing a comparative analysis of these alternative expression systems.Finally, Chapter 9 gives an overview of the study by comparing the four production strategies previously described. The comparative study was based on a large scale industrial bioprocess design. To define the industrial facility dimension, 10% of the annual demand of this vaccine in Europe was assumed in the implemention of our experimental data. The economical analysis of the feasibility ought to permit to describe the hotspots and the advantages of each alternative production system, and to overcome bottlenecks in further studies.

En la presente tesis se desarrolla y optimiza un conjunto de metodologias que permiten la construccion de un sistema de control supervisor basado en el conocimiento, para la gestión y control de Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales(EDAR). Para demostrar la aplicabilidad de este tipo de tecnicas, asi como incrementar el conocimiento del proceso y desarrollar nuevas tecnicas de control, se ha aplicado el sistema desarrollado a una planta piloto y a una EDAR real. En estas aplicaciones, se ha demostrado como una herramienta valida para el control y gestion en tiempo real de plantas depuradoras, que permite la mejora de los procesos de depuracion biologica, en cuanto a fiabilidad de operación, mejora del rendimiento de eliminacion y reducción del coste energetico necesario para obtener un determinado grado de depuración. Para la implementación del sistema, se ha construido una planta piloto altamente instrumentalizada y con gran versatilidad, que permite la eliminación simultanea de carbono, nitrogeno y fosforo. Toda la instrumentación disponible esta gestionada por un sistema de control y adquisición de datos (SCADA), diseñado siguiendo un esquema distribuido. Este sistema desarrollado e implementado en la planta piloto, ha permitido el funcionamiento autonomo de un proceso de depuracion biologica con eliminacion de nutrientes durante más de cuatro años. Por encima del sistema SCADA se ha implementado un Sistema Basado en el Conocimiento(SBC) que hace posible el control del rendimiento del proceso en conjunto. Este sistema permite el control de situaciones anormales y el cumplimiento de restricciones legales en el efluente en una planta depuradora(piloto o real). Para la validación de todo el sistema supervisor se han realizado una serie de experimentos en planta piloto para optimizar la eliminación de nitrogeno en condiciones de entrada constante y dinamicas. Los objetivos principales han sido la obtención de la eliminación de nitrogeno prefijada y la utilización de los minimos recursos posibles, manteniendo, a su vez, una adecuada eliminación de materia organica y fosforo. Utilizando distintas estrategias de operación se han obtenido mejoras en el proceso: un aumento de eliminacion por unidad de biomasa superior al 16% y una disminución en el vertido de nitrogeno superior al 46%.

El consum energètic representa un 30 % dels costos d'operació en sistemes intensius de tractament d'aigües residuals urbanes. En depuradores convencionals que utilitzin un sistema de fangs activats, entorn al 15-20 % de l'energia és consumida en la línia dels fangs, que inclou el bombeig, l'espessiment, l'estabilització i la deshidratació. Per tant, la optimització de la gestió dels fangs pot contribuir substancialment en la reducció dels costos de tractament d'aigües residuals. La digestió anaeròbia termofílica és més eficient que la mesofílica i pscicrofílica, en termes de producció de biogàs i metà, eliminació de sòlids volàtils (SV) i destrucció de patògens. El procés es pot accelerar mitjançant el pre¬tractament dels fangs, afavorint la seva solubilització i hidròlisi. L'objecte d'aquesta Tesi Doctoral fou estudiar l'impacte dels paràmetres del procés en la digestió anaeròbia termofílica dels fangs de depuradora urbana, avaluar l'efecte del pre-tractament tèrmic dels fangs a baixa temperatura, i valorar processos alternatius des del punt de vista energètic. Els resultats experimentals presentats s'obtingueren mitjançant l'operació de dos reactors de laboratori durant prop de dos anys. En aquest període es va estudiar l'efecte de la temperatura del procés, del temps de retenció dels fangs (TRF), de la velocitat de càrrega orgànica (VCO) i del pre-tractament a 70 ºC en la digestió anaeròbia dels fangs de depuradora. El procés fou avaluat en termes de la producció d'energia (biogàs i metà) i de la qualitat del fang digerit (contingut de SV i d'àcids grassos volàtils (AGV), facilitat de deshidratació i higienització). S'analitzà l'estabilitat del procés a mesura que es reduïa el TRF i s'incrementava la VCO, i es comparà l'eficiència en períodes d'estabilitat corresponents a les diferents condicions operacionals. Finalment, s'avaluaren els resultats des del punt de vista energètic, mitjançant el càlcul de balanços i ratis energètics teòrics, que es compararen amb els resultats obtinguts a partir de dades experimentals d'altres estudis. També s'utilitzà un model cinètic de primer ordre. Les conclusions que es desprenen d'aquest treball es resumeixen a continuació: Durant la digestió anaeròbia dels fangs, la transició d'un reactor mesophilic (43 ºC) a termofílic (50 ºC) es podria dur a terme sense alterar el procés, treballant a TRF elevats (≥ 30 dies) i VCO baixes (≤ 0.5 kg SV m-3reactor d-1). En aquestes condicions, les principals diferències entre reactors termofílics (50-55 ºC) i mesofílics (38-43 ºC) fan referència a una certa acumulació d'AGV (0.5-2.5 g L-1) i millora de la destrucció de patògens (E. coli ≤ 102 UFC mL-1). La digestió termofílica a 50 ºC i 55 ºC dóna lloc a resultats similars pel que fa a la producció de biogàs, estabilització, higienització i facilitat de deshidratació de l'efluent, si no varien els altres paràmetres operacionals. La producció de metà tendeix a incrementar proporcionalment a la VCO, és a dir al TRF i el contingut de SV als fangs alimentats. Així mateix, la qualitat de l'efluent (contingut de SV i AGV, facilitat de deshidratació dels fangs) també depèn de la VCO. D'acord amb els resultats obtinguts a 55 ºC, la producció de metà s'incrementà 2-3 vegades (de 0.2 a 0.4-0.6 m3CH4 m3reactor d-1) en disminuir el TRF de 30 a 15-10 dies, incrementant la VCO de 0.5 a 2.5-3.5 kg SV m3reactor d-1. En canvi, el procés es desestabilitzà amb la reducció del TRF a 6 dies i VCO per sobre de 5 kg SV m3reactor d-1. Les següents concentracions poden ser útils per detectar i prevenir la desestabilització d'un digestor termofílic de fangs: AGV totals (2.5 g L-1), acetat (0.5 g L-1), rati acetat/propionat (0.5), alcalinitat intermèdia (1.8 g CaCO3 L-1), rati alcalinitat intermèdia/alcalinitat parcial (0.9), rati alcalinitat intermèdia/alcalinitat total (0.5), contingut de metà al biogàs (55 %). El pre-tractament a 70 ºC afavoreix la solubilització dels fangs, incrementant la proporció de matèria orgànica soluble respecte la matèria orgànica total del 5 % al 50 % en 9-24 h; seguit d'una progressiva generació d'AGV després de 24h. Durant la subseqüent digestió anaeròbia de fangs pre¬tractats (9-48 h), s'incremetà la producció de biogàs en un 30-40 %, treballant a 55 ºC i 10 dies de TRF. El rendiment de producció de biogàs fou un 30 % superior amb fangs pre-tractats (0.28-0.30 vs. 0.22 L·gVS¬1) i el contingut de metà al biogàs també fou superior (69 % vs. 64 %). La digestió anaeròbia termofílica de fangs pot donar lloc a una producció neta d'energia, durant estacions fredes i càlides, si s'utilitzen reactors amb aïllament tèrmic de les parets i amb recuperació energètica a partir del biogàs i dels fangs digerits. En aquest cas, l'eficiència energètica de reactors termofílics treballant a la meitat de TRF (10-15 dies) que reactors mesofílics (20-30 dies) seria similar, per la qual cosa el cabal diari podria ser doblat, o el volum del reactor reduït, amb el conseqüent estalvi en el cost de tractament dels fangs. A més, un sistema en dues etapes (70/55 ºC) produiria més energia neta que un sistema en una sola etapa (55 ºC) amb un TRF de 10 dies. De totes maneres, la quantitat d'energia neta generada augmenta amb el volum del digestor donat que, malgrat la disminució en la producció de metà a TRF creixents, la producció d'energia segueix essent superior al consum, i per tant com més quantitat de fangs hi hagi al digestor, més energia es produirà. / Energy consumption accounts for some 30 % of the total operating costs of intensive sewage treatment systems. In conventional wastewater treatment plants employing an activated sludge process, around 15-20 % of this energy is used in the sludge treatment line, including sludge pumping, thickening, stabilisation and dewatering. Therefore, optimisation of sludge management can substantially contribute in the reduction of wastewater treatment costs. Thermophilic anaerobic digestion is more efficient than mesophilic anaerobic digestion, in terms of biogas production, volatile solids (VS) removal and pathogens destruction. The process might be further accelerated by sludge pre-treatment, promoting sludge solubilization and hydrolysis. The aim of this PhD Thesis was to study the impact of process parameters on the thermophilic anaerobic digestion of sewage sludge, to evaluate the effect of implementing a low temperature pre¬treatment step, and to assess alternative processes from an energy perspective. The experimental results presented were obtained by operating two lab-scale reactors for almost two years. During this period, the effect of process temperature, sludge retention time (SRT), organic loading rate (OLR) and 70 ºC sludge pre-treatment on the anaerobic digestion of sewage sludge was studied. The process was evaluated in terms of energy production (i.e. biogas and methane production) and the quality of the effluent sludge (i.e. VS and volatile fatty acids (VFA) content, sludge dewaterability and hygienisation). Focus was put on the stability of the process at decreasing SRT and increasing OLR. Process efficiency during stable performance under each operating condition assayed was compared. Finally, the results were assessed from an energy perspective, by means of theoretical energy balances and ratios; and compared to the results obtained with experimental data from other studies. A first order kinetic model was also used. The conclusions drawn from the different issues dealt in this work are summarised as follows: During anaerobic sludge digestion, the transition from a mesophilic (43 ºC) to a thermophilic operation (50 ºC) may be carried out without disturbing the process, by operating the reactors at high SRT ( ≥ 30 days) and low OLR (≤ 0.5 kg VS m-3reactor d-1). Under such conditions, some VFA accumulation (0.5-2.5 g L-1) and enhanced pathogen destruction (residual E. coli ≤ 102 CFU mL-1) would be the main differences of thermophilic (50-55 ºC) compared to mesophilic (38-43 ºC) reactors. Thermophilic sludge digestion at 50 ºC and 55 ºC should be similar in terms of biogas production and effluent stabilisation, hygienisation and dewaterability; provided that other process parameters are the same. Methane production rate tends to increase proportionally to the OLR, thus to the SRT and VS concentration in the feed sludge. Similarly, the quality of the effluent sludge (VS content, VFA content and sludge dewaterability) is also affected by the OLR. According to the results obtained at 55 ºC, methane production rate increased by 2-3 times (from 0.2 to 0.4-0.6 m3CH4 m3reactor d-1) by decreasing the SRT from 30 to 15-10 days; increasing the OLR from 0.5 to 2.5-3.5 kg VS m3reactor d-1. However, process unbalance resulted from SRT reduction to 6 days, with OLR above 5 kg VS m3reactor d-1. The following concentrations might be useful to detect and prevent digester failure during thermophilic sludge digestion: total VFA (2.5 g L-1), acetate (0.5 g L-1), acetate/propionate ratio (0.5), intermediate alkalinity (1.8 g CaCO3 L-1), intermediate alkalinity/partial alkalinity ratio (0.9), intermediate alkalinity/total alkalinity ratio (0.5), methane content in biogas (55 %). The 70 ºC sludge pre-treatment may initially promote sludge solubilization, increasing the concentration of soluble to total organic matter from 5 to 50 % within 9-24 h; which is followed by a progressive VFA generation after 24 h. Subsequent anaerobic digestion of pre-treated sludge samples (9¬48 h) could increase biogas production by 30-40 % working at 55 ºC with a SRT of 10 days. Biogas yield is some 30 % higher with pre-treated sludge (0.28-0.30 vs. 0.22 L·gVSfed-1) and methane content in biogas is also higher with pre-treated sludge (69 vs. 64 %). Thermophilic anaerobic sludge digestion would result in net energy production, during cold and warm seasons, provided that digesters with wall insulation and with energy recovery from both the biogas produced and the effluent sludge are used. In this case, the energetic efficiency would be similar for thermophilic digesters working at half the SRT (10-15 days) of mesophilic digesters (20-30 days), meaning that the sludge daily flow rate could be doubled, or the reactor volume reduced, with subsequent savings in terms of sludge treatment costs. Furthermore, two-stage systems (70/55 ºC) may result in higher net energy production compared to single-stage systems (55 ºC) at 10 days SRT. However, the amount of surplus energy generated increases with digester volume. In spite of the decrease in methane production rate at increasing SRT, energy production is still higher than energy consumption, and therefore the bigger the amount of sludge in the digester, the higher the energy production.

El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris. Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.Paraules clauDiscontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS / El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris. Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.Palabras ClaveDiscontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS / The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins. Key wordsFed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.

MELiSSA (Micro Ecological Life Support System Alternative) és el sistema desenvolupat per l'Agència Espacial Europea (ESA) i el consorci MELiSSA en el camp del suport de vida durant missions de llarga durada a l'espai. Basat en un ecosistema aquàtic, MELiSSA va ser concebut com una eina per desenvolupar la tecnologia necessària per a un sistema de suport de vida biològic que en un futur ha de permetre la producció d'aliment, aigua i oxigen a partir dels residus orgànics generats per una tripulació. Per assolir aquest objectiu, el concepte MELiSSA compta amb l'activitat combinada de cinc compartiments colonitzats per diferents microorganismes i plantes superiors, interconnectats entre ells. Aquesta tesi es centra en el tercer compartiment del bucle MELiSSA, en el qual l'amoni és convertit a nitrat, que és la font de nitrogen més adequada per al creixement dels cianobacteris i plantes superiors que colonitzen els compartiments fotosintètics. L'oxidació biològica d'amoni a nitrat té lloc en dues etapes successives que porten a terme dos tipus de soques bacterianes. En el projecte MELiSSA aquest procés es porta a terme en una columna de llit fix mitjançant Nitrosomonas europaea i Nitrobacter winogradkyi immobilitzats sobre un suport polimèric, i amb aportació d'aire en el mateix sentit de circulació que el medi líquid. El reactor pilot del tercer compartiment ha estat operant a la planta pilot del projecte MELiSSA durant períodes prolongats de temps abans de l'inici del treball realitzat en aquesta tesi. La principal aportació d'aquesta tesi es troba en l'obtenció de nova informació sobre el funcionament del reactor a través d'un estudi detallat de la biopel·lícula i també mitjançant el desenvolupament d'un model matemàtic que ens permetrà estudiar els efectes de diferents paràmetres d'operació sobre el procés i l'estructura de la biopel·lícula. S'implementaran també els aparells de mesura necessaris per millorar la qualitat de la monitorització de les diferents espècies de nitrogen a la fase líquida. Els coneixements adquirits en la realització d'aquest treball seran utilitzats per portar a terme el re-disseny del reactor per tal de millorar-ne el funcionament dins de la planta pilot del projecte MELiSSA. / MELiSSA (Micro Ecological Life Support System Alternative) is the system developed by the European Space Agency (ESA) and the MELiSSA consortium in the field of life support for long term manned missions in Space. Based on the principle of an aquatic ecosystem, MELiSSA was conceived as a tool to develop the required technology for a future biological life support system. Its final aim is the production of food, fresh water and oxygen from the organic wastes of a crew. To achieve this goal, the MELiSSA concept is based on the use of five interconnected compartments colonised by several microorganisms and higher plants. This thesis is focused on the third compartment of the MELiSSA loop, in which ammonium is converted to nitrate, the most suitable nitrogen source for the growth of the bacteria and higher plants colonising the photosynthetic compartment. The biological oxidation of ammonium to nitrate, which consists of two successive reactions carried out by two different bacterial strains, takes place in a packed bed biofilm reactor. Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi are immobilised on a polymeric support, with air flowing cocurrently with the feed medium. The pilot-scale reactor of compartment III (CIII) had been in operation in the MELiSSA pilot plant for several years before the start of the present work. The main contributions of this thesis are in increasing the understanding of the reactor performance by studying the nitrifying biofilm in depth, and by developing a mathematical model that allows the effects of different operational parameters on the process and on the biofilm structure, to be studied. Moreover, continuous monitoring of the nitrifying efficiency will be improved by installing the necessary on-line equipment to experimentally measure the concentrations of all the nitrogen species in the liquid phase. The additional knowledge achieved on the reactor performance via this work will finally lead to re-design the reactor hardware for optimal performance in the MELiSSA pilot plant. The knowledge acquired in this thesis was finally used to define the main features of the re-design of the pilot reactor of the MELiSSA compartment III.

En aquest treball s'exposen dues línies de recerca centrades en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) en Pichia pastoris: la utilització de diferents tècniques de monitoratge i l'aplicació d'estratègies de cultiu que permetin millorar la producció de la ROL en una soca Mut+ d'aquest sistema d'expressió. En els cultius discontinus alimentats amb P. pastoris cal disposar d'una mesura en línia i en temps real de la concentració de substrat, el metanol. Per això es va desenvolupar un analitzador d'injecció seqüencial. Es va comprovar que aquest té una freqüència d'anàlisi òptima per a cultius amb la soca Muts però baixa per a la soca Mut+. Amb aquesta última soca, es van utilitzar i comparar dos mesuradors comercials en fase gas. Es va avaluar també la fluorimetria com a tècnica de monitoratge per a la determinació de tres variables clau: la biomassa, el substrat (glicerol/metanol) i la proteïna recombinant.Inicialment es va fer un seguiment de l'evolució de la biomassa a partir del senyal de fluorescència off-line del triptòfan. Es pot predir la biomassa correctament però es van evidenciar diferents desavantatges: la necessitat de dilució de les mostres i d'un sistema de presa de mostra específic. Per això es va decidir aplicar i avaluar la fluorimetria multivariable in situ. Amb la utilització d'una sonda fluorimètrica in situ, combinada amb mètodes quimiomètrics de tractament de dades multivariables, es va aconseguir predir la biomassa i el substrat a partir de la determinació del senyal de diversos fluoròfors. No es va aconseguir una bona predicció de la producció de ROL. Per millorar el seguiment de la proteïna, es va fusionar a la GFP. Es van detectar dos inconvenients: els nivells de producció disminuïen respecte a la producció de ROL únicament i la riboflavina, que Pichia excreta al medi, interferia amb el senyal de fluorescència del mutant de GFP escollit. Tant amb la filtració de la mostra abans de la determinació del senyal de GFP com si s'hagués escollit un mutant de GFP amb emissió més allunyada de la riboflavina es podria haver evitat aquest inconvenient i fer un seguiment de la ROL excretada. Es pot seguir la ROL intracel·lular.Quant a la producció de la ROL, es va estudiar l'efecte del nivell de metanol residual en cultius discontinus alimentats amb la soca Mut+. Existeix una concentració òptima entorn els 2.5 g·l-1 de metanol al medi. A concentracions superiors es va apreciar inhibició per substrat. Es va observar un fenomen de limitació per transferència d'oxigen al final del cultiu i una important disminució de la viabilitat cel·lular.Per això, es van avaluar estratègies de cultiu alternatives. Primer es va aplicar una estratègia de metanol limitant (MLFB) per evitar la limitació d'oxigen al final d'un cultiu a 2.5 g·l-1 de metanol residual (MNLFB). Es va millorar la productivitat un 40%. En segon lloc, es va aplicar una estratègia de temperatura limitant per avaluar el seu efecte sobre la producció. No es van millorar els resultats. Finalment, es va aplicar una estratègia MNLFB a 2.5 g·l-1 de metanol però amb un medi amb una menor osmolaritat i una fase final amb limitació de temperatura per evitar la limitació d'oxigen. Es va aconseguir reduir la mortalitat cel·lular però la productivitat disminuïa respecte el cultiu on s'aplica una fase de MLFB al final de la inducció. Tot i això, es va obtenir un producte final un 30% més pur en quant a activitat lipolítica respecte la proteïna total. Posteriorment es va procedir a escalar la producció en planta pilot. Es va observar limitació en la transferència d'oxigen en fases inicials de la inducció. Això va originar l'aparició d'un subproducte, associat a una reducció en la producció de ROL extracel·lular. En millorar la transferència d'oxigen es va minimitzar aquesta limitació i va millorar la producció. No es van aconseguir els mateixos nivells de productivitat que a escala laboratori però es continua treballant en la millora de la transferència de matèria per assolir-los. / In this work two research lines, applied to the production of a Rhizopus oryzae lipase (ROL) in Pichia pastoris, are shown: the application of different monitoring and cultivation techniques to improve ROL production in a P. pastoris Mut+ strain.During P. pastoris fed-batch cultures, methanol needs to be on line measured and monitored in real time. For this purpose, a sequential injection analyzer was developed. Although it presented a suitable analysis frequency for a Muts strain it was too low for a Mut+ strain. When the later was used, two different methanol commercial sensors in the outlet gas steams were utilized and compared. Fluorometry was also evaluated as a monitoring technique for three key variables: biomass, substrate (glycerol/methanol) and recombinant protein. Initially, biomass was followed by the off-line determination of tryptophan's fluorescence. Biomass was correctly predicted with this system but different disadvantages appeared: the need of a sample dilution procedure and a specific sampling device. Therefore, multivariable in situ fluorometry was subsequently evaluated. By means of an in situ multivariable fluorimetric probe, combined with chemometric methods to data processing, biomass and substrate prediction was properly achieved. ROL production could not be satisfactorily estimated.To improve ROL monitoring, it was fusioned to the green fluorescent protein (GFP). Two main disadvantages were found: production levels were lower when compared to solely ROL expression and riboflavin, naturally excreted by the yeast, interfered to GFP's signal. This problem could be solved with sample filtration prior to GFP's measurement and also if a different GFP mutant had been chosen with emission signal further to riboflavin's.With respect to ROL production, the effect of methanol concentration was studied in Mut+ fed-batch cultures. There is an optimal methanol concentration about 2.5 g·l-1. Substrate inhibition was observed at higher methanol levels. Oxygen transfer limitation at the end of the induction phase and an important cell viability decrease were also found. Therefore, alternative culture techniques were evaluated. First a methanol limited fed-batch phase (MLFB) was applied when oxygen limitations appeared at the end of a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch phase (MNLFB). Productivity increased up to 40% with this strategy. Secondly, a temperature limited fed-batch was applied. No better results were obtained compared to the reference MNLFB culture. Finally, a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch was applied with a lower salt content medium and a final temperature limited phase when oxygen limitation appeared. Cell death was reduced but productivity decreased with respect to the reference MNLFB culture. However, a 30% purer lipase was obtained in terms of lipase activity to total protein.Thereafter, the scaling of the production process in a pilot plant was evaluated. Oxygen limitation was found in the early induction phase. This caused a byproduct secretion associated to a ROL production decrease. When oxygen transfer was enhanced, byproduct secretion was reduced and ROL production improved. Similar laboratory scale productivities were not achieved but oxygen mass transfer is being further enhanced to reach the objective levels.

En les últimes dues dècades, la teràpia gènica ha permès plantejar noves aproximacions en l'àmbit de la medicina personalitzada. Es troba orientada a guarir malalties actualment incurables i/o a millorar ostensiblement la qualitat de vida dels pacients, gràcies a la introducció de material genètic al nucli de la cèl·lula diana per permetre, augmentar o suprimir l'expressió d'un gen específic amb finalitat terapèutica. El vector és l'agent que juga el paper cabdal en aquest mecanisme. D'entre els possibles tipus (virals i no virals), destaca el vector adenoviral per la seva preeminència en els actuals assajos preclínics amb humans i per la necessitat de proveir demandes de mercat importants. El present treball aborda el desenvolupament complet d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica: estudia els diferents aspectes que conformen el bioprocés, i analitza la implementació a escala industrial de la millor alternativa possible. Com a punt de partida, es realitzen estudis previs per conèixer la interacció dels vectors adenovirals amb les línies cel·lulars productores existents. S'aprofundeix en les tècniques de cultiu de dos candidats cel·lulars concrets: HEK293 (adherent) i HEK293S (no adherent). A partir de la infecció d'ambdós amb el vector adenoviral, es caracteritzen els principals paràmetres del cicle infectiu, els quals permeten concloure que la línia cel·lular HEK293S resulta més apropiada en base a una major productivitat. Aquestes dades proporcionen la base per desenvolupar l'etapa de producció del bioprocés. Aquesta s'estructura entorn als tres factors fonamentals que descriuen la bioreacció (el monitoratge, l'estratègia i el sistema de producció), els quals s'analitzen en profunditat. Es demostra la validesa del mètode de la velocitat de consum d'oxigen (OUR) per realitzar el monitoratge en línia de l'activitat cel·lular durant les fases de creixement i d'infecció. Posteriorment, es decideix avaluar dues estratègies de producció: l'estratègia en discontinu (estratègia de referència) i l'estratègia en continu amb perfusió (estratègia que proporciona les condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo). Finalment, s'apliquen els anteriors factors en l'anàlisi del sistema de producció, en concret, amb la utilització de dues alternatives: l'anomenat sistema convencional (bioreactor de tanc agitat Biostat Bplus) i el sistema no convencional (bioreactor basat en tecnologia d'un sol ús Wave Bioreactor). A partir dels resultats obtinguts, es pot constatar que l'estratègia de producció en continu amb perfusió proporciona elevades concentracions cel·lulars, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració vírica final. D'altra banda, també es posen de manifest els avantatges operacionals del sistema de cultiu no convencional, encara que sacrificant la possibilitat d'utilitzar la mesura de la velocitat de consum d'oxigen (OUR). Per tal de completar el treball, es desenvolupa l'etapa de purificació del bioprocés. En aquesta s'analitzen les propietats del producte i del brou de cultiu, i s'avaluen dues estratègies de purificació. Aquestes es diferencien fonamentalment per la seva possibilitat de facilitar el canvi d'escala, de manera que es designen com a estratègia de purificació no escalable (basada en la ultracentrifugació) i escalable (basada en la cromatografia). La primera és comunament emprada a escala de laboratori; donat que es recull específicament la banda de densitat que conté el vector adenoviral, s'implementa per obtenir material amb una elevada puresa que serveixi com a referència a l'hora de comparar els resultats obtinguts amb l'estratègia escalable. Per portar a terme aquesta última, es dissenyen les operacions que la integren, i es determinen els paràmetres de purificació, entre ells el rendiment global de recuperació del producte final. Posteriorment, es realitza la caracterització del producte per determinar el seu grau de puresa. Els resultats obtinguts deixen palès que l'estratègia escalable presenta un rendiment global superior al de la no escalable, tot i que el grau de puresa aconseguit és inferior. Les dades experimentals, tant de la producció com de la purificació, permeten disposar de quatre alternatives amb l'objectiu d'analitzar la potencial implantació del bioprocés a escala industrial. El disseny i la comparació de les mateixes es realitza d'acord amb el seu dimensionament seguint unes bases de disseny comunes, i la seva valoració final es projecta en termes econòmics. A partir dels resultats obtinguts, l'alternativa més aconsellable d'ésser portada a la pràctica és la basada en el bioprocés integrat pel sistema de producció no convencional operant en continu amb perfusió. Aquesta memòria s'estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 2), on es revisen les característiques de la teràpia gènica, dels vectors adenovirals i de les línies cel·lulars productores, així com del bioprocés i de l'estricta normativa de producció GMP que el regeix. Seguidament (capítol 3), es plantegen els principals objectius del treball. A continuació (capítol 4), es concentren els estudis previs que caracteritzen tant la línia cel·lular productora com la infecció amb el vector adenoviral. Al capítol 5, es presenta el desenvolupament de l'etapa de producció del bioprocés. Anàlogament, en el capítol 6, es desenvolupa l'etapa de purificació del mateix. En el capítol 7, es realitza l'anàlisi de procés de les alternatives sorgides. En el capítol 8, s'exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 9), i s'afegeix l'apèndix (capítol 10), on es complementen alguns aspectes concrets d'aquest treball. / For the last two decades, gene therapy has allowed to bring up new approaches in personal medicine. Its goal is to cure illnesses through the introduction of genetic material to the nucleus of a target cell in order to allow, increase or suppress the expression of a specific gene with therapeutic purpose. The vector is the agent that plays the principal role in this mechanism. Among the possible types (viral and non viral), the adenoviral vector is one of the most important due to its pre-eminence in the current preclinical human assays. The present work achieves the complete development of a bioprocess for the obtention of adenoviral vectors for gene therapy: it studies the different aspects that conform the bioprocess, and analyzes the industrial implementation of the best alternative. As a starting point, previous studies are carried out for knowing the interaction of the adenoviral vectors with the existing producing cellular lines. Techniques are studied for culturing two cellular candidates: HEK293 (adherent) and HEK293S (non adherent). From the infection of both with the adenoviral vector, main parameters of the infective cycle are characterized, which allow to conclude that the cellular line HEK293S is more appropriate due to its higher productivity. These data provide the basis to develop the production of the bioprocess. This stage is based on the study of three fundamental factors that describe bioreaction (monitoring, culture strategy and production system), which are deeply analyzed. The oxygen uptake rate (OUR) method is developed to monitor the cellular activity during the phases of growth and infection. Later on, two culture strategies are evaluated: batch (reference stretegy) and perfusion (strategy that provides most similar conditions to those in vivo). Finally, the former factors apply to the analysis of the production system, in particular, with the utilization of two alternatives: the so called conventional system (stirred tank bioreactor Biostat Bplus) and the non conventional system (single use technology based Wave Bioreactor). From the results, it can be concluded that the perfusion strategy provides high cellular densities, increasing the productivity as well as the final viral concentration. On the other hand, some operational advantages of the non conventional system are outlined, in spite of losing the OUR measure. In order to complete the work, the purification stage of the bioprocess is developed. The properties of the product and the culture broth are analyzed, and two strategies of purification are evaluated. These differ in the possibility of increasing scale, so they are designated as non scalable strategy (based on ultracentrifugation) and scalable strategy (based on filtration and chromatography). The first one is commonly used at laboratory scale; given that the final product contains specifically the adenoviral vector, it is implemented to obtain referencie material with high purity when comparing the obtained results with the scalable strategy. The last one is developed based on the design of several operations. The characterization of the final product is carried out to determined its purity. The obtained results conclude that the scalable strategy shows higher global yield than the non scalable one, even though the degree of purity achieved is lower. The production and purification data allow to have four alternatives in order to analyze the potential implantation of the industrial bioprocess. The design and the comparison of these are carried out according to the same bases of design, and the final discussion is based on economical terms. From the results, the most advisable alternative of being brought to practice is the one based on the bioprocess operating in perfusion using the non conventional system. This memory is structured so it initially contains an introduction (chapter 2), where the characteristics of gene therapy, adenoviral vectors and the producing cellular lines, as well as the bioprocess are outlined. Next (chapter 3), the main objectives of the work are described. Next (chapter 4), the previous studies that characterize the producing cellular line as well as the infection with the adenoviral vector are concentrated. In chapter 5, the development of the production stage is presented. Analogously, in chapter 6, the purification stage is developed. In chapter 7, the process analysis of the alternatives is carried out. In chapter 8, main conclusions extracted from the work are set forth. Finally, the materials and methods used (chapter 9) are shown, and the appendix (chapter 10) is added, where some aspects of this work are complemented.

L'objectiu principal d'aquesta tesi és el desenvolupament d'una nova eina de caracterització local, basada en tècniques de microscòpia d'escombrat, que permeti estudiar la propagació de la llum en medis de guiat òptic. Aquest nou microscopi s'anomena microscopi òptic de camp proper (SNOM). L'aplicació d'aquest nou instrument a diferents estructures i dispositius òptics integrats ha permès obtenir informació del comportament de la propagació de la llum en funció dels paràmetres del procés tecnològic. La informació que és pot obternir es pot separar en dues parts: una caracterització topogràfica que permet estudiar l'estructura morfològica del dispositiu (rugositat de la superfície, dimensions geomètriques dels dispositius, etc) amb gran resolució (~nm), i sense malmetre la mostra; per altra banda, capturant les ones evanescents presents a la superfície de l'estructura, s'estudia la propagació modal de la llum a través del dispositiu, amb una resolució per sota del límit de difracció, essent l'única tècnica que permet aquest tipus de caracterització. Addicionalment s'obté la l'índex de refracció efectiu de propagació per la guia, i la mesura del paràmetre de decaïment del camp evanescent. El microscopi s'ha construït al propi laboratori, i és del tipus "stand-alone", perfectament compatible amb un banc òptic de mesura. Els rangs del microscopi són de 300mmx150mm en el pla de la mostra, i de 5mm verticalment. El control de la distància punta-mostra és del tipus "tuning fork shear force control".El tipus de mostres estudiades es basen en la tecnologia de silici. Primer s'han estudiat dispositius basats en guies de nitrur de silici d'estructura en esglaó, amb un nucli de 200nm. S'ha estudiat la distribució modal en funció de l'amplada de la guia, i s'ha determinat l'índex efectiu de propagació. Finalment s'ha caracteritzat l'atac Reactive Ion Etching per obtenir esglaons < 10nm.A continuació s'han estudiat dispositius basats en l'estructura ARROW, del tipus multicapa, amb un nucli ~3mm. S'ha determinat la condició de propagació monomode, s'ha avaluat el camp evanescent vertical i lateral de guies rectes, s'ha estudiat la unió en Y d'un interferòmetre Mach-Zehnder, i finalment s'ha mesurat a través del camp evanescent, la longitud d'acoblament d'un acoblador direccional.Finalment, la última part de la tesi s'ha dedicat a explorar l'ús de diferents tècniques litogràfiques per modificar guies microfabricades de forma estàndard, per tal d'obtenir dispositius nous i de menors dimensions. Les guies modificades són guies de nitrur de silici. La primera tècnica estudiada és una combinació de litografia Làser i atac químic, i s'ha aconseguit visualtizar un nou comportament en aquestes guies, la conversió de mode TE a TM. La segona tècnica estudiada és una combinació de litografia AFM i atac RIE, i s'ha determinat les condicions d'atac per provocar canvis significatius en la propagació de la llum / The main objective of this thesis is to develop a new instrument, a Scanning Near-Field Optical Microscope (SNOM), based on scanning microscopy techniques, for the characteritzation of optical guiding devices. Applied to different integrated optical structures and devices, information on the light propagation as a function of technological parameters will be obtained.The obtained information can be separated in two branches: first, a topographic characterization, which allows to study the morphology of the structure (surface roughness, geometric dimensions, etc) with a resolution below 1nm without any special preparation of the sample; and second, an optical characterization which allows to study the light propagation with a resolution below the classical diffraction limit. By picking up the evanescent waves presents on the surface of the optical guiding devices the modal propagation is visualized, being the unique technique allowing such measurement. Also the decay length of the evanescent field is characterized, as well as the effective refractive index of the structure. The home-made built microscope is a stand-alone design, fully compatible with a standard optical bench for the characterization of optical waveguiding devices. The ranges of the microscope are 300mmx150mm in the plane and 5mm vertical, and the tip-sample distance control is based on tuning fork shear force control. Based on silicon technology, two different waveguide structures has been studied. The first one is a silicon nitride based rib waveguides, with a thin core of about 200nm The modal propagation depending on the width of the structure is characterized, as well as the evanescent field. Finally, the Reactive Ion Etching used to make the rib has been teste to produce steps below 10nm. The second structure is known as ARROW structure, which is a multilayer structure with a core similar to that of a fiber (~3mm). In this case the single mode propagation condition has been determined, and the vertical and lateral evanescent field have been measured. A Y-branch of an interferometer has been also studied, and finally the coupling length of a directional coupler has been experimentally determined.The last part of the thesis is devoted to the modification of standard microfabricated optical waveguides by new lithographic techniques, in order to obtain new and smaller devices. The first technique is a combination of laser lithography and chemical etching, and by modifying a standard rib silicon nitride waveguide is has been observed a polarization conversion (TE-TM conversion). The second technique is a combination of AFM-lithography and RIE, which allows nanometer-scale modifications. The results of this new technique shows whether the modification can significantly changes the propagation conditions or not