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青色光作動性Gal4転写因子と近赤外光作動性Tet転写因子の哺乳類細胞における機能向上とその応用長崎, 真治 23 March 2023 (has links)
京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24758号 / 生博第499号 / 新制||生||66(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科高次生命科学専攻 / (主査)教授 今吉 格, 教授 鈴木 淳, 教授 谷口 雄一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DGAM
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Uniform transgene activation in Tet-On systems depends on sustained rtTA expression / Tet-Onシステムにおける均一な遺伝子発現は持続的なrtTA発現に依存するOtomo, Jun 25 March 2024 (has links)
京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第25201号 / 医科博第157号 / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 遊佐 宏介, 教授 近藤 玄, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM
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Aufbau nanoskopischer Netzwerke aus DNA und BindeproteinenBenke, Annegret 12 November 2007 (has links) (PDF)
Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Grundlagenuntersuchungen zum Aufbau von nanoskopischen Netzwerken aus DNA. Dabei werden zwei Wege verfolgt: Das Stempeln von DNA-Molekülen auf ein Substrat und die Herstellung von Verknüpfungen aus DNA mit Hilfe von Bindeproteinen. Stempeln von DNA-Molekülen In dieser Arbeit wurde ein Beitrag zu den materialwissenschaftlichen Grundlagen des Übertragens von DNA mit der Stempel-Technik erbracht. Hierbei wurden sowohl das Beladen des Stempels durch Molecular Combing als auch die Übertragung der Moleküle durch Transfer Printing unter den speziellen Bedingungen der Verwendung von DNA-Molekülen vertieft untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, gestreckte DNA-Moleküle zielgerichtet in eine mikroelektronische Struktur mit Goldkontakten zu übertragen. Dazu wurde ein Verfahren erarbeitet, bei dem die Kontaktstruktur und ein dazu passender, strukturierter PDMS (Polydimethylsiloxan)-Stempel exakt positioniert werden können. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert des Puffers untersucht. Im gesamten pH-Bereich von 4 bis 10 wurde Adsorption mit hoher Belegungsdichte und vollständiger Streckung der Moleküle beobachtet. Diese Beobachtung kann im Rahmen eines phänomenologischen Modells erklärt werden, das auf einer Bilanz der Adsorptionskraft und der für die Streckung der DNA notwendigen Kraft beruht. In der Literatur wird hingegen berichtet, dass bisher nur in einem kleinen pH-Bereich um 5,5 diese hohe Adsorptionsrate gestreckter Moleküle auf einer hydrophoben Oberfläche erreicht werden konnte. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit von der NaCl-Molarität des Puffers untersucht. Es wurde festgestellt, dass mit steigender Salzkonzentration die Belegungsdichte an Molekülen zunimmt und bei ca. 100 mM ein Maximum aufweist. Aus dem Gang der Anzahl der adsorbierten Moleküle mit der Salzkonzentration ist erkennbar, dass dieser Prozess zumindest durch zwei konkurrierende Mechanismen bestimmt ist: der Zunahme der Bindungen zwischen DNA und Substrat aufgrund steigender Adsorption von Na+- Ionen auf der DNA bzw. dem Substrat und von Cl-- Ionen auf dem Substrat (dies führt zu einer Zunahme der Adsorptionsrate) und der Stabilisierung des Doppelstranges (dies führt zu einer Abnahme der Adsorptionsrate). Die hohe Adsorptionsrate geschlossener Plasmide zeigte, dass die Adsorption auf PDMS auch bei DNA-Molekülen möglich ist, die keinen bevorzugten Ort für das Aufschmelzen des Doppelstranges haben. Experimentell konnten die Ergebnisse einer Modellrechnung bestätigt werden, wonach bei doppelsträngiger DNA bereits zwei aufgeschmolzene Basenpaare ausreichen, damit die Adsorption über hydrophobe Wechselwirkungen beginnen kann. Der Nachweis der vollständigen Übertragung der DNA-Moleküle während des Transfers vom Stempel auf das Substrat wurde rasterkraftmikroskopisch geführt. Der Transferprozess wurde experimentell untersucht und daraus resultierend seine Darstellung als zweistufiger Mechanismus vorgeschlagen. Es wurde gezeigt, dass Wassermolekülen beim Übertragungsprozess die entscheidende Rolle zukommt: Wassermoleküle, die sich entlang der DNA befinden, müssen den Kontakt zum Wasserlayer auf dem Glas vermitteln, so dass die DNA nach dem Prinzip des kapillaren Greifens übertragen werden kann. DNA-Verknüpfungen mittels Tet-Repressor-Protein Die aus der bakteriellen Genregulation bekannte sequenzspezifische Bindung zwischen der tetO-Sequenz auf der DNA und dem TetR-Protein wurde genutzt, um definierte Konstrukte aus DNA und Bindeproteinen herzustellen. Mit dem modifizierten Protein scTetRtDL, das zwei Bindedomänen für tetO besitzt, konnten jeweils zwei DNA-Moleküle verknüpft werden. Aus 568 bp-Fragmenten, die leicht außermittig die tetO-Sequenz tragen, wurden durch die Bindung mit scTetRtDL kreuzförmige DNA-Strukturen hergestellt. Das ca. 1 µm lange, linearisierte und tetO-tragende Plasmid pUC19/AV16 wurde verwendet, um größere Strukturen herzustellen. Durch Schneiden des Plasmides mit verschiedenen Restriktionsenzymen und der daraus resultierenden Variation der Position von tetO ist die Konstruktion von unterschiedlichen Strukturen möglich. Mittels Proteinbindung wurden Kreuzungen und aneinander gekettete Moleküle (so genannte Verlängerungen) erzeugt. Die konstruierten DNA-Protein-Komplexe wurden mit dem Rasterkraftmikroskop abgebildet. Mittels Gelelektrophorese wurde der Einfluss der sequenzinduzierten Biegungen im Plasmid pUC19/AV16 auf das Laufverhalten im Gel untersucht.
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Aufbau nanoskopischer Netzwerke aus DNA und BindeproteinenBenke, Annegret 25 October 2007 (has links)
Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Grundlagenuntersuchungen zum Aufbau von nanoskopischen Netzwerken aus DNA. Dabei werden zwei Wege verfolgt: Das Stempeln von DNA-Molekülen auf ein Substrat und die Herstellung von Verknüpfungen aus DNA mit Hilfe von Bindeproteinen. Stempeln von DNA-Molekülen In dieser Arbeit wurde ein Beitrag zu den materialwissenschaftlichen Grundlagen des Übertragens von DNA mit der Stempel-Technik erbracht. Hierbei wurden sowohl das Beladen des Stempels durch Molecular Combing als auch die Übertragung der Moleküle durch Transfer Printing unter den speziellen Bedingungen der Verwendung von DNA-Molekülen vertieft untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, gestreckte DNA-Moleküle zielgerichtet in eine mikroelektronische Struktur mit Goldkontakten zu übertragen. Dazu wurde ein Verfahren erarbeitet, bei dem die Kontaktstruktur und ein dazu passender, strukturierter PDMS (Polydimethylsiloxan)-Stempel exakt positioniert werden können. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert des Puffers untersucht. Im gesamten pH-Bereich von 4 bis 10 wurde Adsorption mit hoher Belegungsdichte und vollständiger Streckung der Moleküle beobachtet. Diese Beobachtung kann im Rahmen eines phänomenologischen Modells erklärt werden, das auf einer Bilanz der Adsorptionskraft und der für die Streckung der DNA notwendigen Kraft beruht. In der Literatur wird hingegen berichtet, dass bisher nur in einem kleinen pH-Bereich um 5,5 diese hohe Adsorptionsrate gestreckter Moleküle auf einer hydrophoben Oberfläche erreicht werden konnte. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit von der NaCl-Molarität des Puffers untersucht. Es wurde festgestellt, dass mit steigender Salzkonzentration die Belegungsdichte an Molekülen zunimmt und bei ca. 100 mM ein Maximum aufweist. Aus dem Gang der Anzahl der adsorbierten Moleküle mit der Salzkonzentration ist erkennbar, dass dieser Prozess zumindest durch zwei konkurrierende Mechanismen bestimmt ist: der Zunahme der Bindungen zwischen DNA und Substrat aufgrund steigender Adsorption von Na+- Ionen auf der DNA bzw. dem Substrat und von Cl-- Ionen auf dem Substrat (dies führt zu einer Zunahme der Adsorptionsrate) und der Stabilisierung des Doppelstranges (dies führt zu einer Abnahme der Adsorptionsrate). Die hohe Adsorptionsrate geschlossener Plasmide zeigte, dass die Adsorption auf PDMS auch bei DNA-Molekülen möglich ist, die keinen bevorzugten Ort für das Aufschmelzen des Doppelstranges haben. Experimentell konnten die Ergebnisse einer Modellrechnung bestätigt werden, wonach bei doppelsträngiger DNA bereits zwei aufgeschmolzene Basenpaare ausreichen, damit die Adsorption über hydrophobe Wechselwirkungen beginnen kann. Der Nachweis der vollständigen Übertragung der DNA-Moleküle während des Transfers vom Stempel auf das Substrat wurde rasterkraftmikroskopisch geführt. Der Transferprozess wurde experimentell untersucht und daraus resultierend seine Darstellung als zweistufiger Mechanismus vorgeschlagen. Es wurde gezeigt, dass Wassermolekülen beim Übertragungsprozess die entscheidende Rolle zukommt: Wassermoleküle, die sich entlang der DNA befinden, müssen den Kontakt zum Wasserlayer auf dem Glas vermitteln, so dass die DNA nach dem Prinzip des kapillaren Greifens übertragen werden kann. DNA-Verknüpfungen mittels Tet-Repressor-Protein Die aus der bakteriellen Genregulation bekannte sequenzspezifische Bindung zwischen der tetO-Sequenz auf der DNA und dem TetR-Protein wurde genutzt, um definierte Konstrukte aus DNA und Bindeproteinen herzustellen. Mit dem modifizierten Protein scTetRtDL, das zwei Bindedomänen für tetO besitzt, konnten jeweils zwei DNA-Moleküle verknüpft werden. Aus 568 bp-Fragmenten, die leicht außermittig die tetO-Sequenz tragen, wurden durch die Bindung mit scTetRtDL kreuzförmige DNA-Strukturen hergestellt. Das ca. 1 µm lange, linearisierte und tetO-tragende Plasmid pUC19/AV16 wurde verwendet, um größere Strukturen herzustellen. Durch Schneiden des Plasmides mit verschiedenen Restriktionsenzymen und der daraus resultierenden Variation der Position von tetO ist die Konstruktion von unterschiedlichen Strukturen möglich. Mittels Proteinbindung wurden Kreuzungen und aneinander gekettete Moleküle (so genannte Verlängerungen) erzeugt. Die konstruierten DNA-Protein-Komplexe wurden mit dem Rasterkraftmikroskop abgebildet. Mittels Gelelektrophorese wurde der Einfluss der sequenzinduzierten Biegungen im Plasmid pUC19/AV16 auf das Laufverhalten im Gel untersucht.
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Tradice a současnost hudebních souborů v Rychnově nad Kněžnou / Tradition and present of musical ensembles in Rychnov nad KněžnouČižinská, Klára January 2019 (has links)
The base theme of diploma thesis is the musical life with a focus on musical ensembles in Rychnov nad Kněžnou. At first the history of the town and its musical evolution is presented. In the next part of the thesis the active musical ensembles in Rychnov nad Kněžnou are discussed. They are for example the Rychnov Children's Choir of Carmina, Praus Choir and the X-tet and the Rychnov Temple Choir. There are also instrumental ensembles working at the ZUŠ of Rychnov nad Kněžnou: Sarabanda Flute ensemble, Orecchie grandi String Orchestra, Orecchie piccole String Orchestra, Nona Band, I flauti Matti Flute ensemble and Dance Orchestra ColorBand. The aim of the thesis is to map the culture of Rychnov in the field of artificial music.
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Etudes structurales et propriétés enzymatiques de deux nouvelles aminopeptidases TETs auto-compartimentées chez les archées / Structural studies and enzymatic properties of two novel self-assembled aminopeptidases TETs from archaea.Basbous, Hind 19 December 2016 (has links)
Les aminopeptidases représentent un groupe d’enzymes qui possèdent une fonction cellulaire clef dans les mécanismes physiologiques et pathologiques. Elles interviennent dans la cascade enzymatique après l’action des endoprotéases, dans l’homéostasie au travers le renouvellement du pool d’acides aminés, dans le métabolisme énergétique, la régulation de l’activité des peptides bioactifs, la présentation antigénique ainsi dans une diversité de mécanismes pathologiques tels que les maladies neurologiques et les infections virales et parasitaires. Les aminopeptidases TETs sont capables de former des macro-assemblages tétraédriques comprenant douze sous-unités. En vue de mieux comprendre leur fonction biologique et leur mode d'action, nous avons étudié les propriétés fonctionnelles et structurales de deux nouveaux complexes TETs issus d'archées hyperthermophiles. L'archée hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii ne possède qu'une version de TET (MjTET) qui a été produite dans Escherichia coli et purifiée sous forme de dodécamère. La recherche de son activité enzymatique et de ses substrats peptidiques par des tests chromogéniques et fluorogéniques, ainsi que des études par HPLC en phase inverse, montre que cette enzyme est une leucine aminopeptidase activée par le cobalt se distinguant des autres aminopeptidases M42 par son très large spectre d'action qui s'étend aux résidus aromatiques. Une structure complète de cette aminopeptidase a été résolue en combinant la cristallographie (2.4 Å) et la cryo-EM (4,1 Å). L'analyse de la poche de spécificité de MjTET permet de mieux comprendre les bases structurales de la discrimination de substrat chez les TETs. De plus, l'analyse de la structure interne de la particule permet de proposer un nouveau mécanisme de navigation des peptides à l’intérieur des particules tétraédriques de la famille TET.L'archée hyperthermophile Pyrococcus horikoshii comporte trois types de complexes TETs. L'étude d'une protéine présentant ~20 % d'identité avec ces systèmes, nous a permis d'identifier une quatrième version du système TET dans cet organisme : PhTET4. La protéine recombinante a été purifiée. Elle forme un complexe dodécamérique tétraédrique. Les études biochimiques révèlent que l'enzyme possède une spécificité très étroite dirigée exclusivement vers l'hydrolyse des résidus glycines de l'extrémité N-terminale des peptides. De plus, elle estactivée par le nickel. Ces caractéristiques permettent de proposer que, chez les archées, la multiplication et la spécialisation des enzymes TETs seraient associées au caractère hétérotrophes alors que le système des archées autotrophes se réduirait à une TET unique apte à assurer une fonction de « ménage ». / Aminopeptidases represent a group of enzymes displaying key cellular function inphysiological and pathological mechanisms. They are involved in the enzymatic cascade beyond the action of endoproteases, in homeostasis through the renewal of the amino acid pool, in the energy metabolism, in the regulation of bioactive peptide activities, in the antigen presentation and in a diversity of pathological mechanisms such as neurological diseases as well as viral and parasitic infections. Aminopeptidases TET are able of forming tetrahedral macro-assemblies built by twelve subunits. In order to better understand their biological function and their mode of action, we studied the functional and structural properties of two novel TET complexes derived from hyperthermophilic archaea. The hyperthermophilic archaeon Methanocaldococcus jannaschii has only one version of TET (MjTET) that was produced in Escherichia coli and purified as dodecameric macromolecule. The search for its enzymatic activity and peptide substrates by using chromogenic/fluorogenic assays and reverse phase HPLC studies, demonstrated that this enzyme is a cobalt-activated leucine aminopeptidase, discriminated from other M42 aminopeptidases by its very broad activity spectrum, that extends to aromatic residues. Complete structure of this aminopeptidase was determined by combining X-ray crystallography (2.4 Å) and cryo-electron microscopy (4.1 Å). Analysis of MjTET specificity pocket indicated possible molecular bases for substrate discrimination in TET peptidases. In depth investigation of the particle internal structure allowed to propose a novel peptide trafficking mechanism for the TET family tetrahedral particles. Three types of TET complexes are present in the hyperthermophilic archaea, Pyrococcus horikoshii. The study of an unassigned protein displaying ~20% identity with the PhTETs systems allowed us to identify a fourth version of TET complex in this organism: PhTET4. The recombinant protein was purified. It formed tetrahedral dodecameric complex. Biochemical studies indicated that the enzyme has a very narrow hydrolytic specificity directed exclusively toward the peptide N-terminal glycine residues. In addition, this enzyme is activated by nickel ions. These features allowed proposing that, in archaea, the multiplicity of specialized TET systems could be associated with heterotrophy while unique TET system displaying “housekeeping” function is present in autotrophic organisms.
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Towards Usable Transparency via IndividualisationMurmann, Patrick January 2019 (has links)
The General Data Protection Regulation grants data subjects the legal rights of transparency and intervenability. Ex post transparency provides users of data services with insight into how their personal data have been processed, and potentially clarifies what consequences will or may arise due to the processing of their data. Technological artefacts, ex post transparency-enhancing tools (TETs) convey such information to data subjects, provided the TETs are designed to suit the predisposition of their audience. Despite being a prerequisite for transparency, however, many of the TETs available to date lack usability in that their capabilities do not reflect the needs of their final users. The objective of this thesis is therefore to systematically apply the concept of human-centred design to ascertain design principles that demonstrably lead to the implementation of a TET that facilitates ex post transparency and supports intervenability. To this end, we classify the state of the art of usable ex post TETs published in the literature and discuss the gaps therein. Contextualising our findings in the domain of fitness tracking, we investigate to what extent individualisation can help accommodate the needs of users of online mobile health services. We introduce the notion of privacy notifications as a means to inform data subjects about incidences worthy of their attention and examine how far privacy personas reflect the preferences of distinctive groups of recipients. We suggest a catalogue of design guidelines that can serve as a basis for specifying context-sensitive requirements for the implementation of a TET that leverages privacy notifications to facilitate ex post transparency, and which also serve as criteria for the evaluation of a future prototype. / <p>Paper 2 ingick som manuskript i avhandlingen, nu publicerad.</p>
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Caractérisation structurale, enzymatique et biophysique d'un complexe peptidase piezo-thermophile issue de l'archaea marine abyssale Pyrococcus horikoshiiRosenbaum, Eva 03 December 2008 (has links) (PDF)
Récemment Franzetti et al. ont découvert un nouveau type de protéases auto-compartimentées indépendantes d'énergie dans les archaeas. Les particules ont été appelées TET pour leurs structures tridimensionnelles tétraédriques. Les TETs forment de grands complexes d'un poids moléculaire d'environ 500kDa. Leur rôle dans l'organisme est pourtant inconnu. Dans P. horikoshii, une Archaea hyperthermophile de la mer profonde, trois protéases TET ont été identifiées (PhTET1, 2 et 3). Nous avons exprimé et purifié PhTET3 recombinante. L'enzyme a été caractérisée biochimiquement et nous avons déterminé la structure d'un complexe de PhTET3 de 12 sous-unités par cristallographie aux rayons X. Afin de mieux comprendre son rôle physiologique potentiel et de s'assurer pourquoi il y a trois protéases TET dans P. horikoshii, la structure et les propriétés enzymatiques de PhTET3 ont été comparées à celles de deux autres protéases TET déjà caractérisées. Puisque l'auto-compartimentage joue un rôle important dans le fonctionnement et la régulation des protéases, les facteurs commandant l'oligomérisation de PhTET3 in vitro ont été étudiés par ultracentrifugation analytique et diffusion de neutrons aux petits angles. Finalement, dans des états physiologiques de mer profonde, l'enzyme est exposée à la haute température (jusqu'à 100°C) et à la haute pression. Afin d'étudier les limites de la stabilité de grands assemblages macromoléculaires, la structure à basse résolution et l'activité enzymatique de PhTET3 ont été mesurées à hautes pressions et à hautes températures en utilisant la diffusion des rayons X aux petits angles et la spectrophotométrie à haute pression. Au total, ces études ont indiqué que les protéases TET de P. horikoshii forment un système intégré de dégradation de peptides et que PhTET3 montre une stabilité exceptionnelle à haute pression et à haute température aussi bien que des propriétés enzymatiques associées aux conditions environnementales.
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Contribution au développement de nouveaux vecteurs inductibles par la tétracycline et basés sur le parvovirus adéno-associé (AAV)Chtarto, Abdelwahed 27 October 2005 (has links)
Le parvovirus adéno-associé (AAV) possède un génome à ADN linéaire simple brin de 4,7kb encadré par deux séquences palindromiques inversées et identiques de 145 nucléotides appelées ITRs, requises en cis pour la réplication et l’encapsidation de l’ADN viral. Dans un AAV recombinant (rAAV), la totalité de la partie codante du génome viral est remplacée par une cassette d’expression et seuls les ITRs sont conservés.<p>\ / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Epigenetická regulace genu PU.1 v rezistenci na léčbu 5-azacytidinem u akutní myeloidní leukémie / Epigenetic control of PU.1 gene transcription during development of 5-Azacytidine resistance in acute myeloid leukemiaKřtěnová, Petra January 2017 (has links)
Hematopoiesis is a highly orchestrated process, in which a single hematopoietic stem cell (HSC) gives a rise to all blood cellular components. For myeloid and lymphoid development precise controlled expression of the PU.1 transcription factor is needed. Deletion of PU.1 gene in mouse is lethal and its dysregulation during hematopoietic differentiation is associated with blood malignancies including acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndromes (MDS). MDS and AML are serious blood disorders characterized by expansion of immature blood cells and lack of differentiated functional cells. Not only genetic but also epigenetic aberrations represent a very important field for studying pathophysiology of leukemia genesis and dysregulation of the PU.1 gene represents intensively studied candidate mechanism. Modern therapy of selected MDS and subset of AML patients is based on treatment with DNA hypomethylating agent Azacytidine (AZA) interfering in PU.1 gene regulatory mechanism. However, poor response or resistance to this therapy often occurs. In this thesis we present data obtained from AZA-resistant clones of MDS/AML cell line OCI-M2. We analysed DNA methylation and DNA hydroxymethylation at the key regulatory element of the PU.1 gene (URE). We found that these epigenetic modifications at URE...
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