La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN. / The regulation of gene expression is what allows our cells to adapt to their environment, to fight infections or, more generally, to express the appropriate level of proteins to meet a specific need. The microRNAs (miRNAs) are among the most important players in the regulation of gene expression. These small RNAs of 22 nucleotides are present in most multicellular species and are responsible for the direct control of more than 30% of protein-expressing genes in vertebrates. The miRNA lethal-7 (let-7) family consist of some of the most studied miRNAs and plays crucial roles in the cell. The appropriate regulation of the let-7 miRNAs level is essential for proper cellular development. The biogenesis of these miRNAs, from the primary transcript to their mature form is mainly regulated by Lin28, a highly-conserved pluripotent protein. This protein is composed of a cold shock domain (CSD) and two zinc-binding domains. These RNA-binding domains allow Lin28 to bind and inhibit the maturation of the let-7 miRNA. The objective of this thesis is to characterize the interaction between the Lin28 protein and the let-7g miRNA precursor to better understand the role of this protein in the inhibition of miARN biogenesis. Using biochemical and biophysical techniques, we first identified the main determinants of the interaction between Lin28 and the terminal loop of the precursor miRNA let-7g (TL-let-7g). We concluded that the C-terminal domain of Lin28, composed of a lysine-rich and arginine-rich motif in addition to two zinc-binding motifs, is sufficient to bind with high affinity a conserved guanine-rich bulge located on the TL-let-7g. In addition, because the sequence and RNA-binding specificity of this C-terminal domain are similar to those of the HIV protein NCp7, we defined this region as the NCp7-like domain of Lin28. Subsequently, we characterized the multimerization of three Lin28 proteins on the terminal loop of pre-let-7g. This study helped to reconcile apparent contradictions found in the current literature regarding the Lin28-binding sites on miRNA precursors. We identified three high-affinity binding sites on TL-let-7g that are bound in a stepwise manner by the three Lin28 proteins. As part of the formation of the multimeric complex, both RNA-binding domains of Lin28 play an important role. The CSD destabilizes the RNA and this exposes several binding sites, whereas the NCp7-like domain allows an orderly protein assembly and facilitates the initial binding of the protein. These results lead us to propose a new model for the interaction between Lin28 and pre-let-7g. In conclusion, these studies provide a better understanding of the molecular mechanisms involved in the post-transcriptional regulation of an important family of miRNAs and will help guide future projects in the expanding research area of miRNA biogenesis.

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Ce mémoire est consacré à l'élaboration et à l'étude physico-chimique de nouveaux catalyseurs bifonctionnels pour l'électroréduction du CO2. Dans ce contexte, une approche dite « moléculaire » et une dite « inorganique » ont été développées.<br />Pour l'approche « moléculaire », des catalyseurs bifonctionnels, nouveaux complexes hétérobimétalliques du type [Cl(CO)3Re(L)M(Cp*)Cl]+ (L = ligand bisdiimine ; M = Ir, Rh ; Cp* = η5-pentaméthyl-cyclopentadiényle) ont été synthétisés, et les interactions intramoléculaires entre les centres métalliques ont été étudiées. Des électrocatalyses préparatives de réduction du CO2 ont été conduites avec ces complexes en solution homogène mais aussi avec des électrodes modifiées obtenues par électropolymérisation anodique des pyrrole fonctionnalisés par ces mêmes complexes en milieu hydro-organique ou aqueux.<br />Pour la deuxième approche « inorganique », nous avons mis au point la synthèse des précurseurs adéquats pour élaborer des films fonctionnalisés par des complexes carbonyle de ruthénium cationiques [Ru(L)(CO)2(MeCN)2]2+ et [Ru(L)(CO)2(MeCN)]22+ (L = bipyridine substituée par des pyrroles), substrats nécessaires à la préparation de matériaux composites associant des nanoparticules métalliques et un polymère rédox. Ces complexes ont été déposés à la surface d'électrodes par électropolymérisation anodique des pyrroles et ont ainsi permis d'obtenir des films cationiques précurseurs de catalyseurs bifonctionnels.<br />Les résultats des électrocatalyses de réduction du CO2 avec les composés issus des deux approches montrent qu'il existe des effets coopératifs au sein des catalyseurs bifonctionnels.

Parmi les disciplines représentatives de la biostructure, la cryomicroscopie électronique permet, au travers de techniques adaptées, d'atteindre de hautes résolutions. Mon travail a porté sur l'étude d'une catégorie de molécules, les particules isolées à faible degré de symétrie et entre autres sur les pigments respiratoires extracellulaires tels que les hémocyanines de céphalopodes (Vampyroteuthis infernalis, Benthoctopus species, Sepia officinalis) et une hémoglobine d'annélide (Lumbricus terrestris). Une approche empirique a été retenue, et nous a permis de différencier les informations techniques et les données biologiques. Le premier but, basé sur l'utilisation d'un matériel biologique connu, était de travailler sur les techniques d'observation de l'échantillon, d'analyse des images, de reconstruction et de correction des structures. Le deuxième but était d'apporter des réponses de type biologique, par le biais de ces améliorations techniques. Le début de ma thèse fut lié à l'utilisation d'un microscope équipé d'un cristal de LaB6, ne permettant pas de descendre significativement sous la barre des 20 Å. Néanmoins, il nous a permis de répondre à une question de type phylogénétique (Benthoctopus species et Vampyroteuthis infernalis appartiennent à des ordres frères), et de démontrer l'importance du type de microscope et de la source électronique associée. Naturellement, l'étape suivante fut d'accéder à un microscope équipé d'un canon à émission de champ. L'accès sporadique et sur de courtes périodes à ce type de microscope, dont les premiers exemplaires sont arrivés en France en 2000, ne m'ont pas permis de tester systématiquement tous les modes d'utilisation. Malgré tout, les résultats que nous avons obtenu ont validé les avantages de l'émission de champ. Certes, la barre des 6-7 Å de résolution, donnant partiellement accès aux informations relatives à la structure secondaire des protéines, n'a pas encore été atteinte, mais il apparaît que les progrès que nous avons effectués tendent vers cette valeur. Cette progression repose en partie sur l'amélioration des méthodes de collecte des images, de reconstruction et de correction de la fonction de transfert de contraste.

Récemment Franzetti et al. ont découvert un nouveau type de protéases auto-compartimentées indépendantes d'énergie dans les archaeas. Les particules ont été appelées TET pour leurs structures tridimensionnelles tétraédriques. Les TETs forment de grands complexes d'un poids moléculaire d'environ 500kDa. Leur rôle dans l'organisme est pourtant inconnu. Dans P. horikoshii, une Archaea hyperthermophile de la mer profonde, trois protéases TET ont été identifiées (PhTET1, 2 et 3). Nous avons exprimé et purifié PhTET3 recombinante. L'enzyme a été caractérisée biochimiquement et nous avons déterminé la structure d'un complexe de PhTET3 de 12 sous-unités par cristallographie aux rayons X. Afin de mieux comprendre son rôle physiologique potentiel et de s'assurer pourquoi il y a trois protéases TET dans P. horikoshii, la structure et les propriétés enzymatiques de PhTET3 ont été comparées à celles de deux autres protéases TET déjà caractérisées. Puisque l'auto-compartimentage joue un rôle important dans le fonctionnement et la régulation des protéases, les facteurs commandant l'oligomérisation de PhTET3 in vitro ont été étudiés par ultracentrifugation analytique et diffusion de neutrons aux petits angles. Finalement, dans des états physiologiques de mer profonde, l'enzyme est exposée à la haute température (jusqu'à 100°C) et à la haute pression. Afin d'étudier les limites de la stabilité de grands assemblages macromoléculaires, la structure à basse résolution et l'activité enzymatique de PhTET3 ont été mesurées à hautes pressions et à hautes températures en utilisant la diffusion des rayons X aux petits angles et la spectrophotométrie à haute pression. Au total, ces études ont indiqué que les protéases TET de P. horikoshii forment un système intégré de dégradation de peptides et que PhTET3 montre une stabilité exceptionnelle à haute pression et à haute température aussi bien que des propriétés enzymatiques associées aux conditions environnementales.