La thérapie génique de myopathies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne nécessite une approche systémique afin de traiter l'ensemble de la musculature. Le vecteur AAV est actuellement le plus efficace pour transduire le muscle. Nous montrons que la biodistribution du vecteur AAV administré par voie veineuse peut être modifiée en utilisant diverses stratégies adjuvantes chez la souris saine. La pré-injection de polymères permet ainsi d'améliorer la transduction des muscles par le vecteur AAV, ou encore de baisser la réponse immune neutralisante induite par l'injection intraveineuse du vecteur. Nous abordons également l'impact de facteurs modulateurs exogènes ou endogènes – tels que la procédure d'administration ou certains facteurs sanguins – sur la transduction systémique de l'AAV. Dans une seconde approche, nous avons évalué le transfert de gènes dans le muscle dystrophique afin de sécréter dans la circulation sanguine une protéine transgénique fusionnant le récepteur soluble I du TNF-α avec le fragment constant d'une immunoglobuline (TNFR-Is/mIgG1). La comparaison des cinétiques de sécrétion obtenu après le transfert de gène dans le muscle de souris saines ou de souris dystrophiques mdx indique que le contexte inflammatoire du muscle dystrophique favorise une réponse immune contre le transgène. Nous montrons que l'expression et la sécrétion d'un variant murin peu immunogène du TNFR-Is/mIgG1 améliore la fonction musculaire de la souris mdx sans toutefois conférer un avantage sélectif aux fibres musculaires dystrophiques qui continuent leur cycle de nécrose et de régénération.

Résumé Dendritic cells (DCs) are professional APCs that have a unique capacity to initiate primary immune responses, including tolerogenic responses. We have genetically engineered bone marrow-derived DCs to express the immunosuppressive cytokine IL-10 and tested the ability of these cells to control experimental asthma. A single intratracheal injection of OVA-pulsed IL-10-transduced DCs (OVA-IL-10-DCs) to naive mice prior to OVA sensitization and challenge prevented all the cardinal features of airway allergy, namely eosinophilic airway inflammation, airway hyperreactivity, and production of mucus, Ag-specific Igs and IL-4. OVA-IL-10-DCs also reversed established experimental asthma and had long-lasting and Ag-specific effects. We furthermore showed, by using IL-10-deficient mice, that host IL-10 is required for mediating the immunomodulatory effects of OVA-IL-10-DCs and demonstrated a significant increase in the percentage of OVA-specific CD4+CD25+Foxp3+IL-10+ regulatory T cells in the mediastinal lymph nodes (MLNs) of OVA-IL-10-DC-injected mice. Finally, adoptive transfer of CD4+ MLN T cells from mice injected with OVA-IL-10-DCs protected OVA-sensitized recipients from airway eosinophilia upon OVA provocation. Our study describes a promising strategy to induce long-lasting Ag-specific tolerance in airway allergy./L’asthme atteint des proportions épidémiques dans les pays développés et a un impact négatif sur la qualité de vie. De plus les coûts des soins de santé relatifs à cette maladie ne cessent d’augmenter. La nette augmentation de l’incidence durant ces dernières décennies reste une énigme, les facteurs environnementaux ayant probablement contribués pour une large part dans ce processus. Bien que le traitement actuel de l’asthme avec des corticostéroïdes inhalés et des agonistes β2 à longue durée d’action est satisfaisant et sans danger, des inquiétudes restent sur les effets à long terme des corticostéroïdes, en particulier lorsqu’on voit que les traitements commencent parfois très tôt dans l’enfance. De plus, la thérapie actuelle ne semble pas inhiber le TGF-β ni les dépôts de collagène, importants dans le remodelage des voies aériennes qui, au final, contribue à augmenter l’HRB des voies respiratoires. La prévalence et la sévérité de l’asthme atopique augmentent de façon alarmante partout dans le monde depuis ces vingt dernières années {Eder, 2006 #2}. Les traits pathophysiologiques de l’asthme allergique, à savoir l’éosinophilie pulmonaire chronique, l’hyperréactivité bronchique des voies aériennes (HRB) à une variété de stimuli non spécifiques, la production excessive de mucus dans les voies aériennes et les niveaux élevés d’IgE dans le sérum, sont tous étroitement liés à une réponse immune de type Th2 aberrante envers des antigènes habituellement inhalés (Ag) {Busse, 2001 #466; Larche, 2003 #467; Ray, 1999 #465; Wills-Karp, 1999 #464}. Les lymphocytes Th2 spécifiques de l’antigène exercent des fonctions effectrices cruciales en produisant un répertoire propre de cytokines, les plus importantes d’entre-elles étant l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-13 {Busse, 2001 #466; Larche, 2003 #467; Ray, 1999 #465; Wills-Karp, 1999 #464}. Essentiellement, l’asthme atopique est la manifestation d’une réponse immune Th2 aberrante envers un aéroallergène inoffensif. La condition requise pour développer une réponse immune Th2 est la participation de cellules présentatrices d’antigènes pour les réponses primaires et secondaires à un allergène. Les CDs sont les principales cellules pour activer et différencier les lymphocytes T CD4+ naïfs en sous-groupes distincts. De plus, la délétion des CDs durant la réponse immune primaire et secondaire de l’inflammation allergique des voies respiratoires dans les modèles animaux ont montré que ces cellules devaient absolument être présente au cours de ces deux phases. Les cellules dendritiques (CDs) sont des cellules présentatrices d’antigène professionnelles qui ont la capacité unique d’initier les réponses immunes primaires, incluant les réponses tolérogéniques. Nous avons génétiquement généré des CDs dérivés de cellules de la moëlle osseuse capables d’exprimer une cytokine immunosuppressive, l’IL-10. Nous avons testé leur capacité à contrôler un asthme expéritalement induit. Une simple injection par voie intra-trachéale de CDs transduites avec des lentivirus porteurs du gène codant l’IL-10 et chargées avec la protéine OVA (OVA-IL-10-DCs) à des souris naïves avant de les sensibiliser à l’OVA et de les provoquer à l’OVA prévient tous les traits caractéristiques de l’alargie des voies respiratoires, à savoir l’inflammation éosinophiliques des voies aériennes, l’hyperréactivité bronchique et la production de mucus, d’immunoglobulines spécifiques de l’antigène et d’IL-4. Les cellules OVA-IL-10-DCs réversent ausi l’asthme exprimental établi et ont des effets spécifiques de l’antigène, et ce, à long terme. Nous avons ensuite montré, en utilisant des souris déficientes pour l’IL-10, que l’IL-10 produit par l’hôte est nécessaire pour contrôler les effets immunomodulateurs des cellules OVA-IL-10-DCs. De plus, nous avons enfin une augmentation significative du pourcentage des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+IL-10+ spécifiques de l’OVA dans les ganglions médiastinaux (MLNs) des souris injectées avec les cellules OVA-IL-10-DC. Enfin, le transfert adoptif des lymphocytes CD4+ isolés des cellules de ganglions médiastinaux de souris injectées avec les cellules OVA-IL-10-DCs protège les souris receveuses, préalablement sensibilisées à l’OVA, d’une éosinophilie des voies aériennes suite à une provocation à l’OVA. Notre étude décrit une stratégie prometteuse pour induire une tolérance spécifique de l’antigène à long terme dans le cadre d’une allergie des voies aériennes.

La thérapie génique est envisagée pour le traitement de nombreuses maladies du <br />système nerveux. Le transfert de gène peut être utilisé pour compenser l'absence ou le <br />dysfonctionnement d'un gène déficient, coder une protéine thérapeutique, ou inhiber un <br />gène par ARN interférence. L'utilisation de vecteurs lentiviraux pour transférer un gène <br />thérapeutique, est une approche prometteuse pour de futures applications thérapeutiques. <br />Cependant, pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs, il est nécessaire de contrôler <br />l'expression des gènes thérapeutiques. Ceci permettra d'adapter le traitement aux besoins <br />du patient ou de l'arrêter en cas de complications graves. Dans ce contexte, mon travail a <br />porté sur la mise au point de systèmes de régulation de l'expression de gènes thérapeutiques <br />inductibles par la tétracycline (Tet-on) au sein d'un seul vecteur lentiviral. <br /><br />Dans une première approche, le système Tet-on a été incorporé au sein d'un vecteur <br />lentiviral unique. Des vecteurs codant la luciférase et la tyrosine hydroxylase (TH) ont été <br />produits et caractérisés in vitro et in vivo. Ces vecteurs ont permis d'exprimer de façon <br />régulée les transgènes avec une expression induite d'un facteur 100 en présence de <br />doxycycline. Le vecteur TH inductible a été par la suite validé dans un modèle de rat de la <br />maladie de Parkinson pour démontrer son efficacité et la possibilité de réguler un gène <br />thérapeutique in vivo. <br /><br />Le deuxième volet de mon travail a porté sur le développement d'un système <br />inductible d'expression des shARN utilisant un nouveau transactivateur dépendant de la <br />doxycycline capable d'induire la transcription de shARN à partir d'un promoteur d'ARN <br />polymérase III minimal. Après intégration dans un vecteur lentiviral, ce système a permis <br />de contrôler efficacement et de manière réversible l'expression de la GFP et de la protéine <br />p53 in vitro. En présence de doxycycline, une extinction de 90 % de l'expression des deux <br />gènes cibles a été obtenue. Cette expression a été réinduite après retrait de la doxycycline. <br />L'efficacité de ce système est dépendante de la dose et du temps de traitement avec la <br />doxycycline. <br /><br />L'intégration de systèmes de régulations efficaces au sein d'un vecteur lentiviral <br />unique constitue une étape cruciale pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en <br />thérapeutique humaine.

L'électrotransfert est une solution prometteuse aux problèmes posés par les méthodes de transfert virales, aussi bien en termes d'applications thérapeutiques qu'en tant qu'outil de recherche. Cependant des progrès doivent encore être réalisés pour augmenter l'efficacité de transfection dans les divers types cellulaires, pour améliorer la connaissance des mécanismes impliqués ainsi que pour confirmer l'innocuité de l'électrotransfert. Dans une étude préliminaire, nous avons démontré que l'efficacité de transfert par injection locale d'ADN seule augmentait avec la vitesse d'injection, impliquant probablement de l'endocytose médiée par récepteur, mais aussi une faible perméabilisation membranaire. Nous avons ensuite confirmé in vivo le rôle perméabilisant des impulsions courtes de fort voltage (HVs) et le rôle électrophorétique des impulsions longues de bas voltage (LVs), lors de l'électrotransfert. Nous avons aussi montré l'influence d'un délai entre le HV et le LV sur l'efficacité et la toxicité des impulsions électriques appliquées. Notre étude de l'impulsion HV semble montrer également que le tissu n'a pas besoin d'être complètement perméabilisé dans le cadre de l'électrotransfert. Nous avons aussi pu confirmer in vivo que plus les cellules du tissu étaient petites, plus le champ électrique à appliquer pour le HV devait être fort, conformément à l'équation de Schwan :

L'infertilité masculine est une préoccupation croissante dans les sociétés modernes. Parmi les différentes causes d'infertilités masculines, certaines ont une origine génétique. C'est le cas de la globozoospermie de type I, une infertilité sévère caractérisée par la production exclusive des spermatozoïdes ayant une tête ronde et sans acrosome. Cette pathologie présente un phénotype complexe associant à l'absence de l'acrosome, des défauts de compaction nucléaire, des lésions de l'ADN et une déficience d'activation ovocytaire.Récemment notre équipe a montré que le gène DPY19L2 est impliqué dans 60 à 80% des cas de globozoospermie de type I et représente donc la cause majeure de la globozoospermie de type I chez l'homme. La fonction de la protéine étant complètement inconnue au moment de l'identification du gène DPY19L2, nous avons alors réalisée une étude fondamentale sur les mécanismes moléculaires expliquant la pathogénie moléculaire de cette maladie et avons démontré, grâce à l'utilisation du modèle des souris KO pour le gène Dpy19l2, que la protéine est localisée dans la membrane nucléaire interne et est nécessaire à l'ancrage de l'acrosome sur l'enveloppe nucléaire. Dans le but d'identifier d'autres acteurs impliqués dans l'attachement de l'acrosome au noyau spermatique, nous nous sommes intéressés à l'étude de la protéine Sun5 de l'enveloppe nucléaire interne située en regard de l'acrosome qui pouvait être un partenaire de Dpy19l2. On a trouvé que les deux protéines n'étaient pas des partenaires puisque Sun5 était, contrairement à ce qui a été décrit dans la littérature, du côté postérieur opposé à l'acrosome. En deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la compréhension des principales causes moléculaires de l'absence de fécondation ou du très faible taux de réussite lors d'ICSI réalisées avec des spermatozoïdes globozoospermiques.Pour ce faire, nous avons recherché la protéine PLC ζ, le principal facteur spermatique activateur de l'ovocyte, dans les spermatozoïdes humains provenant de patients délétés pour le gène DPY19L2 et murins (de souris KO Dpy19l2-/-) et avons montré qu'effectivement cette protéine est absente tant chez les patients que dans le modèle d'étude murin. Nous avons également réalisé une étude comparative des principales étapes de la compaction du génome spermatique entre les souris mâles WT et Dpy19l2-/- et nous avons montré que la compaction du génome des spermatozoïdes globozoospermiques était défectueuse avec un défaut de protamination et une rétention des histones. Ainsi, la déficience en PLC ζ, les défauts de compaction et le taux élevé de fragmentation de l'ADN sont susceptibles d'expliquer l'échec de la fécondation après ICSI, et le développement très réduit des embryons issus des patients déficients pour le gène DPY19L2 ainsi que des souris Dpy19l2-/-. La compréhension de cette physiopathologie devrait permettre la proposition de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d'améliorer le taux du développement embryonnaire en AMP. / Male infertility is a growing concern in modern societies. Among the various causes of male factor infertility, some have a genetic origin. This is the case of type I globozoospermia, a severe infertility characterized by the presence in the ejaculate of a majority of round spermatozoa devoid of acrosome. This pathology presents a complex phenotype associating to the absence of the acrosome, sperm nuclear compaction defects, DNA damage and failure in egg activation.Recently our team identified the DPY19L2 gene as responsible for a large majority of pure globozoospermia cases (>80%) and therefore represents the major cause of type I globozoospermia in humans. The function of the protein was completely unknown at the time of identification of DPY19L2 gene, we then performed a fundamental study of the molecular mechanisms underlying the molecular pathogenesis of the disease and have shown, through the use of knockout mice model for the Dpy19l2 gene, that the protein is localized in the inner nuclear membrane and is necessary for the anchoring of the acrosome to the nuclear envelope. In order to characterize new actors of acrosome attachment, we assessed the importance of Sun5 (also called Spag4l) in acrosome attachment which was previously shown to be expressed in NE of spermatogenic cells, facing the acrosome and that could be a partner of Dpy19l2. Interestingly we demonstrate that Sun5 and Dpy19l2 are not partners and that Sun5, is not as initially reported, facing the acrosome but is in fact excluded from this zone. We were also interested in understanding the main molecular causes of the poor fertilization ability or the very low success rate in ICSI when performed with globozoospermics sperm.Therefore we have searched the PLC ζ protein, the sperm factor thought to induce the Ca2+ oscillations responsible for egg activation, in human spermatozoa from patients with DPY19L2 deleted gene and in murine spermatozoa from Dpy19l2 Knock-Out mice and showed that actually this protein is absent both in patients and in KO mice. We also made a comparative study of the main stages of genome compaction of sperm from both WT and Dpy19l2 KO mice and we showed that Dpy19l2 deficient sperm displays defective genome condensation and DNA alterations. Thus, PLC ζ deficiency, the compaction defects and the high rate of DNA fragmentation may explain the failure of fertilization after ICSI, and the poor development of embryos from patients deficient for the gene DPY19L2 as well as Dpy19l2 KO mice.Understanding the physiopathology of globozoospermia should allow the proposal of new therapeutic strategies that improves the rate of embryonic development in ART.

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie mitochondriale caractérisée par une ataxie spinocérébelleuse et sensitive, une cardiomyopathie et un diabète. L’AF est due à un déficit en frataxine (FXN), une protéine mitochondriale impliquée dans la synthèse des centres Fe-S et l’homéostasie mitochondriale. L’atteinte cardiaque, pour laquelle il n’existe aucun traitement, est la cause principale de décès. Nous avons montré que l’injection intraveineuse d’un vecteur adéno-associé (AAV) rh10 exprimant la FXN humaine prévient le développement de la cardiomyopathie d’un modèle souris de l’AF mais aussi que l’injection du vecteur à des animaux en insuffisance cardiaque permet la correction complète et rapide du phénotype cardiaque. Ces résultats démontrent la capacité des cardiomyocytes défectueux présentant un défaut bioénergétique à être rapidement corrigés. Nous avons ainsi établi la preuve de concept qu’un traitement par thérapie génique est une approche thérapeutique pertinente pour l’AF. / Friedreich ataxia (FRDA) is a mitochondrial disease with neurodegeneration, hypertrophic cardiomyopathy and diabetes. FRDA is caused by reduced level of frataxine (FXN), an essential mitochondrial protein involved in iron-sulfur cluster biogenesis and mitochondrial homeostasis. Cardiac failure is the most common cause of mortality in FRDA. To date, no treatment exists for FRDA cardiomyopathy. During my PhD, we showed that an adeno-associated vector (AAV) rh10 expressing human FXN injected intravenously not only prevented the onset of the cardiac disease in a faithful FRDA cardiac mouse model, but also, when administered in animals with cardiac failure, reversed rapidly and completely cardiac remodeling and insufficiency. Our results demonstrate the capacity of defective cardiomyocytes with severe energy failure and ultrastructure disorganization to be rapidly corrected and remodeled by gene therapy. Thus, we showed that gene therapy may be a relevant therapeutical approach for FRDA.

La rétine est un tissu spécialisé dans le traitement de l'information visuelle par l'intermédiaire des photorécepteurs, cônes et bâtonnets, et des neurones de deuxième ordre, les cellules bipolaires et les cellules ganglionnaires dont les axones forment le nerf optique. Notre groupe s'intéresse à élucider les mécanismes génétiques impliqués dans les maladies rares stationnaires, comme dans la cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS), ou progressives comme dans la dystrophie de type bâtonnet-cône (DBC). Cette thèse apporte de nombreuses connaissances sur la physiologie rétinienne. D'une part, nous avons identifié GPR179, un nouveau gène impliqué dans la CNCS complète, étudié la localisation de la protéine et la physiopathologie des protéines mutantes. Nous avons également créé et caractérisé fonctionnellement un nouveau modèle souris invalidé pour GPR179 qui nous a permis de mieux approcher la première synapse rétinienne entre les photorécepteurs et les cellules bipolaires adjacentes. D'autre part, nous avons caractérisé le génotype et le phénotype de l'un des modèles les plus utilisés de la DBC, le rat P23H. Nous avons ensuite développé une approche d'édition génomique pour invalider les mutants RHO ayant un effet dominant négatif en testant in vitro, ex vivo et in vivo les meganucleases, TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) puis le système CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9). / The first steps in vision occur in the retina when rod and cone photoreceptors transform light into a biochemical signal, which gets processed by bipolar cells, ganglion cells and finally by the brain. Our group investigates genetic causes and mechanisms involved in inherited stationary and progressive retinal diseases as congenital stationary night blindness (CSNB), and rod-cone dystrophy (RCD), also called retinitis pigmentosa. This thesis gives several insights on the retinal physiology. On one hand, we identified GPR179, a new gene mutated in complete CSNB, studied the localization and the physiopathology of missense and splice-site mutations. We also delivered a new knock-out mouse model which we functionally characterized, and studied GPR179 partners to provide a better understanding of the first visual synapse between photoreceptors and ON-bipolar cells. On the other hand, we genotypically and phenotypically characterized one of the most popular RCD model, the P23H rat model. There is currently no treatment for RCD and different therapeutic strategies are under investigation. We wanted to deliver the basis for a genome editing approach for RHO mutations, acting as a dominant negative effect, which cannot be addressed by current gene replacement strategies. We opened the field by performing in vitro, ex vivo and in vivo genome editing experiments using meganucleases, TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) and finally CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) and revealed how challenging the setting of genome editing strategies was.

Ce travail concerne l’évaluation de nanoparticules de silice associées à la poly-ethylèneimine (PEI) comme vecteurs de délivrance de gène pour le traitement des plaies chroniques de la peau. Des matériaux nanocomposites associant des complexes formés par l’association de ces particules hybrides et d’ADN avec des hydrogels de collagène colonisés par des fibroblastes 3T3 ont été élaborés. Grâce à la modulation de la taille de la particule et de la masse moléculaire du polymère, il a été possible de réaliser la transfection des fibroblastes au sein du gel, permettant l’expression génique pendant une semaine. Ces études montrent le rôle clé joué par la prolifération et la migration cellulaire sur l’efficacité de la transfection. L’efficacité de la transfection a ensuite été modulée en modifiant les interactions silice-PEI. Les résultats obtenus suggèrent que le détachement du complexe de la particule dans les endosomes est une étape clé de ce processus. La transfection de cellules humaines primaires a aussi été étudiée en vue d’applications in vivo. La transfection a été observée avec des fibroblastes et des keratinocytes humains en culture et avec les fibroblastes au sein des gels, mais avec des efficacités moindres que pour les cellules 3T3. Ceci est attribué au plus faible taux de prolifération des cellules primaires. Enfin la capacité des nanocomposites à moduler l’inflammation a été testée sur des macrophages humains activés. Ces systèmes permettent la synthèse soutenue d’IL-10 par les fibroblastes et l’inhibition de l’expression de TNF-alpha chez les macrophages. / This work is devoted to the evaluation of silica nanoparticles associated to poly-ethyleneimine (PEI) as vectors for gene therapy in the context of skin chronic wounds repair. Nanocomposite materials associating complexes formed by the association of these hybrid particles and DNA with collagen hydrogels cellularized with 3T3 fibroblasts have been prepared. Thanks to the modulation of particle size and polymer molecular weight, it has been possible to achieve fibroblast transfection within the gel, allowing for sustained protein expression over one week. These studies evidence the key role of cell proliferation and migration on transfection efficiency. The transfection process has been further modulated by modification of the silica-PEI interactions. The results suggest that the complex detachment from the particles within the endosomes is a key step in this process. The transfection of human primary cells has also been studied foreseeing in vivo applications. Human fibroblasts and keratinocytes have been successfully transfected in culture and, in the case of fibroblasts, within collagen hydrogels, but with lower efficiency than with 3T3 cells. This has been attributed to the lower proliferation rate of primary cells. Finally the ability of nanocomposites to modulate inflammation has been evaluated on activated human macrophages. These systems have allowed for the sustained production of IL-10 by fibroblasts and the inhibition of TNF-alpha expression by macrophages.

La maladie de Fabry est une maladie lysosomale présentant une grande hétérogénéité phénotypique et génotypique. Elle est causée par des mutations au niveau du gène GLA, situé sur le chromosome X, entrainant un déficit de l'enzyme alpha-galactosidase A. Celui-ci mène à une accumulation de globotriaosylcéramide (Gb3), de globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) et de galabiosylcéramide (Ga2) et leurs isoformes et analogues respectifs qui sont utilisés comme biomarqueurs pour la maladie de Fabry. Il est possible de les quantifier dans les liquides biologiques tels que le plasma et l’urine des patients. Le principal traitement consiste en une thérapie d’enzyme de remplacement (TER) qui n’est pas efficace pour tous les patients, car des complications peuvent survenir suite à une réponse auto-immune contre l’enzyme infusée. Le développement d’autres thérapies est au coeur de la recherche actuelle. La thérapie génique à l’aide d’un vecteur viral pour cette maladie lysosomale est en développement au Canada. Un modèle de souris NOD/SCID/Fabry (NSF) a été généré pour le développement du vecteur viral, la compréhension de la distribution des biomarqueurs au niveau des tissus de différents organes et l’évaluation des effets du traitement. Ce modèle est une souris avec une inactivation complète du gène GLA ainsi que l’absence de système immunitaire. Les objectifs du projet de maîtrise étaient donc de: 1) développer et valider une méthode pour l’homogénéisation des tissus, l’extraction et le dosage du Gb3 et ses isoformes/analogues dans les tissus de différents organes de souris Fabry et souris contrôles à l’aide de la chromatographie liquide ultra performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS); 2) comparer les profils de distribution des biomarqueurs dans différents organes pour des souris atteintes de la maladie de Fabry et des souris contrôles. L’analyse des souris NSF a permis d’établir un profil de biomarqueurs comportant jusqu’à 22 isoformes pour chaque organe et de mettre en évidence des différences significatives entre la distribution du Gb3 dans lesdits organes. La quantité la plus élevée de Gb3 se retrouve au niveau de la rate, suivis du petit intestin, des reins, des poumons, du coeur, du foie et du cerveau. Les isoformes formés d’un acide gras sans insaturation sont les plus abondants dans l’ensemble des organes. Un transfert technologique sera effectué pour l’analyse des biomarqueurs dans des échantillons de plasma de patients Fabry ayant reçu la thérapie génique. En conclusion, la méthode mise au point est sensible et offre un outil efficace pour l’analyse des tissus de différents organes de souris par la production d’un profil de biomarqueurs, ce qui peut aussi mener à de meilleurs outils pour monitorer les patients atteints de la maladie de Fabry.

PABPN1 est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire et ubiquitaire impliquée dans de nombreux mécanismes de régulation post-transcriptionnelle des ARN. Une expansion anormale de triplets GCN dans le gène PABPN1 conduit à une dystrophie musculaire appelée dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD). A l'heure actuelle les mécanismes moléculaires conduisant d'une expansion de quelques triplets dans le gène d'une protéine ubiquitaire vers cette pathologie où seulement quelques muscles sont touchés ne sont pas connus. La caractéristique phénotypique majeure de la maladie est la présence d'agrégats intranucléaires dans les noyaux des muscles atteints et non atteints. Cependant le rôle exact de ces agrégats et leur implication dans la pathologie reste encore incertain. A l'heure actuelle il n'y a pas de traitements curatifs pour l'OPMD. Dans ce contexte, ce projet de thèse a porté sur 1) l'étude des mécanismes moléculaires dérégulés dans la pathologie, 2) l'étude de la contribution des agrégats nucléaires et 3) le développement d'un stratégie de thérapie génique. Au cours de ce travail il a été mis en évidence des défauts mitochondriaux et les mécanismes moléculaires sous-jacents ont été élucidés. L'étude de l'implication des agrégats dans la maladie a révélé la présence de défauts d'épissage et en particulier dans un ARN muscle spécifique codant la protéine TNNT3. Le projet de thérapie génique dit de remplacement consiste à éteindre PABPN1 par interférence à ARN et amener un ADNc (PABopt) qui code la forme saine et qui est non ciblée par les outils interférence grâce à la redondance du code génétique. Les résultats obtenus ont été très positifs à la fois in vitro et in vivo / PABPN1 is an RNA binding protein involved in many post-transcriptional RNA regulation mechanisms. A pathological expansion of the GCN triplet in the gene leads to a muscular dystrophy called Oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD). The molecular mechanisms leading to a small expansion in an ubiquitous protein to a disease, where only few muscles are impaired are still not fully understood. The main pathological hallmark is the presence in the myonuclei of nuclear aggregates of the PABPN1 protein. Today there is no cure for OPMD patients. In this context the projects developed during this thesis have been to 1) study the molecular mechanisms involved in OPMD, 2) study the contribution of the nuclear aggregates in the physiopathology of the disease and 3) develop a gene therapy strategy. We found mitochondrial dysfunctions present in OPMD muscles and we decipher the molecular mechanism involved. Study of PABPN1 aggregates in OPMD has highlighted splicing deregulation events. Among them TNNT3, a RNA which encodes a muscle specific protein is deregulated and we found that the pre-mRNA is trapped in nuclear aggregates outsides speckles nuclear domain containing its natural splicing factor (SC35), leading to an imbalance of the ratio of two mutually exclusives exons of the transcript. The gene therapy strategy developed is a replacement strategy that consists of silencing PABPN1 using RNAi and also bringing a novel version of the protein using a cDNA, untargeted by RNAi thanks to the genetic code redundancy, which encodes a wild-type form of PABPN1. We obtained promising results both in vitro and in vivo in mice OPMD model with a rescue of the pathological phenotype.