La thérapie génique utilisant les vecteurs viraux est une des approches thérapeutiques possible pour le développement d’une thérapie pour les maladies génétiques mono-géniques dont l’ataxie de Friedreich (FRDA). Dans le but de vérifier l’efficacité des virus adéno-associés (AAV) à transférer la copie normale du transgène dans les tissus qu’ils infectent, nous avons insérer le gène codant pour la forme améliorée de la protéine fluorescente verte (eGFP) dans les AAV sérotype 9 (AAV9). Ces AAV recombinants (AAVr) ont été ensuite administrés aux souris femelles gestantes par voie intraveineuse et intra-péritonéale. Les résultats obtenus montrent que le transgène a été transféré à la fois dans les tissus des souris femelles ainsi que dans ceux des souriceaux. / Gene therapy using viral vectors is one of the therapeutic approaches possible for the development of genetic therapies for monogenic diseases including Friedriech's Ataxia (FRDA). In order to verify the effectiveness of adeno-associated virus (AAV) to transfer a transgene in the tissues they infect, we inserted the gene encoding the enhanced form of the green fluorescent protein (eGFP) in AAV Serotype 9 (AAV9). These recombinant AAV (rAAV) were then administered by intravenous and intraperitoneal to pregnant female mice. The results obtained show that the transgene was transferred in both in the female’ mouse tissues and in those of young mice.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l'agent étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), code pour deux protéines de régulation, Tat et Rev, et quatre protéines accessoires, Vif, Vpr, Vpu et Nef. La protéine Vpu du VIH-1 augmente le relâchement des particules virales à partir de la surface des cellules infectées. De plus, Vpu augmente la production virale d'autres rétrovirus tels que MoMuLV et VISNA. Actuellement, la majorité des transferts de gènes sont effectués à l'aide de vecteurs rétroviraux dérivés de MoMuLV. Un des problèmes majeur limitant l'utilisation des vecteurs rétroviraux en thérapie génique est la faible production des virus recombinants. La première partie de cette étude indique que Vpu augmente la production virale des lignées d'encapsidation rétrovirales. En effet, Vpu induit une augmentation de la production virale de 40 et 13 fois pour les lignées d'encapsidation Damp et ivCRIP respectivement. Cette observation suggère que Vpu pourrait jouer un rôle important dans la génération de nouvelles lignées d'encapsidation en augmentant la production des vecteurs rétroviraux et donc l'efficacité du transfert de gènes. La protéine Vpr possède plusieurs fonctions qui contribuent à la réplication du VIH-1 in vitro et in vivo. L'une des fonctions importante de Vpr pour la réplication optimale du VIH-1 est l'induction d'un arrêt en G2 du cycle cellulaire qui favorise la production des protéines virales. Cette fonction précoce nécessite la présence de Vpr dans la particule virale. En effet, Vpr est incorporé en grande quantité dans les virions probablement via une interaction directe avec le domaine p6 de Gag. Cette caractéristique de Vpr permet de cibler des séquences d'acides aminés exogène à l'intérieur du VIH-1 sous forme de protéines de fusion. Une des application envisageable en thérapie génique serait de cibler des séquences protéiques en fusion avec Vpr capables d'interférer avec la réplication du virus. La deuxième partie de ce travail identifie les régions de Vpr comprenant les acides aminés 1 à 88 et 15 à 88 comme responsables de l'incorporation maximale de Vpr en fusion avec la chloramphénicol acétyle transférase (CAT). Les 88 premiers acides aminés de Vpr ont aussi été fusionnés aux 18 derniers acides aminés de Vpu pour générer la protéine de fusion VprIE. Lorsque produite constitutivement par des lymphocytes T CD4+ en culture de cellules, VprIE interfère efficacement avec la réplication du VIH-1. En effet, VprIE démontre un effet protecteur comparable à celui de la protéine anti-VIH-1 RevM10 actuellement en essais cliniques. Enfin, VprIE n'a pas permis l'apparition de souche résistante du VIH-1 capable de se répliquer en présence de la protéine de fusion. Ces résultats établissent les bases nécessaires à la génération de nouvelles protéines de fusion pouvant interférer plus efficacement avec la réplication du VIH-1. De plus, l'ensemble de ce travail indique qu'il est possible d'utiliser les fonctions des protéines Vpu et Vpr du VIH-1 pour des applications en thérapie génique.

L’augmentation de l’espérance de vie entraîne l’accroissement d’une population vieillissante et augmente ainsi le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives. Le développement de nouveaux médicaments pour le traitement de ces maladies est grandement limité par la présence d’une barrière physiologique, appelée barrière hémato-encéphalique (BHE), qui protège l’homéostasie du cerveau. Cependant, un grand nombre de transporteurs spécifiques sont situé sur les cellules endothéliales formant la BHE et pourrait être l’objet de ciblage thérapeutique afin d’augmenter la disponibilité cérébrale de plusieurs médicaments. Afin d’évaluer le potentiel d’anticorps monoclonaux (AcM) ciblant le récepteur de la transferrine (RTf) dans le cadre d’une approche non invasive de thérapie génique, nous avons tout d’abord étudié la distribution cérébrale de l’AcM Ri7. Nous avons, en premier lieu, observé une rétention au cerveau des AcM ciblant le RTf. Cependant, des analyses de microscopie ont démontré que la distribution était confinée à la cérébrovasculature. Par la suite, en conjuguant le Ri7 à des points quantiques, nous avons caractérisé la distribution subcellulaire du vecteur. Nos analyses de microscopie électronique ont confirmé que les complexes Ri7-points quantiques étaient massivement internalisés dans les cellules endothéliales du cerveau (CECCs) et que ces complexes étaient observés dans les petites vésicules, les structures tubulaires et dans les corps multivésiculaires. Nous avons ainsi identifié les CECCs comme cible potentielle pour le traitement de la pathologie endothéliale de maladies neurodégénératives. Par la suite, nous avons évalué le potentiel de deux formulations de nanoparticules pour acheminer du matériel génétique dans les CECCs. Nos résultats ont démontré que l’utilisation de micelles polyionques et d’immunoliposomes permettait une accumulation importante d’acides nucléiques dans les CECCs. Notre étude ouvre donc la porte à de nouvelles approches thérapeutiques basées sur le ciblage thérapeutique des cellules endothéliales du cerveau. / The increase in life expectancy leads to a direct expansion of the aging population. This expansion further increases the burden of neurodegenerative diseases. The development of new drugs to treat brain pathologies is greatly hindered by the presence of a physiological barrier, the blood-brain barrier (BBB), protecting the brain homoeostasis. However, a high number of specific transporters are located on endothelial cells forming the BBB and could be the target of brain-drug delivery allowing significant cerebral accumulation of many therapeutic compounds. To study the potential of monoclonal antibodies (mAb) targeting the transferrin receptor (TfR) in the context of a non-invasive gene therapy strategy, we foremost studied the cerebral distribution of the mAb Ri7. We first observed retention in the brain of the mAb. However, fluorescence microscopy analysis revealed that the distribution of Ri7 was confined to cerebral vasculature. Thereafter, by conjugating Ri7 to quantum dots (Qdot), we performed experiments to characterize the subcellular distribution of the mAb. Our transmission electron microscopy analyses showed that Ri7-Qdots were massively internalized within brain capillary endothelial cells (BCECs) and that the TfR-targeted Qdots were in small vesicles, tubular structures and multivesicular bodies. We thus identified BCECs as a potential target for the treatment of endothelial pathology of neurodegenerative diseases. Finally, we investigated the potential of two nanoformulations to delivery nucleic acids to BCECs. Our data demonstrated the capacity of polyionic complex micelles and immunliposomes to deliver a large number of nucleic acids to BCECs. Overall, our study opens the door for a novel therapeutic approach based on brain endothelial cells drug delivery.

Le but général de ce projet de recherche était de valider la faisabilité de la méthode qui consiste en l'introduction d'un gène extrinsèque dans les macrophages cérébraux à l'aide d'un lentivirus, placé sous contrôle d'un promoteur connu pour être actif préférentiellement dans ces cellules. Plus spécifiquement, nous avons : 1) identifié le gène de la galectine-3 comme étant exprimé de façon préférentielle dans les macrophages cérébraux activés dans différentes conditions pathologiques du cerveau ; 2) caractérisé son promoteur ; 3) utilisé ce promoteur pour la conception d'un vecteur lentiviral ; et 4) vérifié la possibilité d'utiliser des cellules microgliales transduites comme vecteurs pour la thérapie génique. Nous avons obtenu des résultats prometteurs quant à une utilisation potentielle des cellules microgliales en thérapie génique ex vivo. Toutefois, pour confirmer que le vecteur lentiviral assure une expression spécifique et durable du transgène dans un contexte inflammatoire, il faudrait entreprendre d'autres analyses.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie héréditaire due à l'absence de dystrophine. Parmi les thérapies possibles, la greffe autologue de myoblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) provenant du patient dystrophique, préalablement corrigés génétiquement, est envisageable. Lors de la première partie de ma recherche, j'ai transplanté des hiPSCs de patient DMD différenciés en myoblastes chez la souris Rag/mdx. Ces cellules avaient été corrigées génétiquement à l'aide d'un vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine, une dystrophine tronquée, mais toujours fonctionnelle. Mes résultats ont démontré l'expression de cette micro-dystrophine dans certaines fibres hybrides. Cependant, le protocole de différenciation des hiPSCs en myoblastes doit être amélioré. La deuxième partie de mon projet consistait donc à induire la myogenèse à l’aide de protéines recombinantes. Pour cela, des facteurs de transcription régulateurs de la myogenèse, fusionnés à un peptide de pénétration cellulaire, ont été produits et purifiés d’un système bactérien. Leur pénétration dans des cellules mésenchymateuses a été observée in vitro et leurs effets sur les cellules sont en cours d’étude. Lorsque ces approches thérapeutiques seront mises au point, elles pourraient être appliquées cliniquement pour traiter des patients dystrophiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary myopathy due to the absence of dystrophin. Among the possible therapies, there is the autologous transplantation of genetically corrected myoblasts derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) of a dystrophic patient. In the first part of my research project, I have transplanted myoblasts differentiated from iPSCs of a DMD patient in the Rag/mdx mouse. These cells had been previously genetically corrected with a lentiviral vector coding for micro-dystrophin, a functional truncated version of dystrophin. The results demonstrated the expression of this micro-dystrophin in some of the hybrid fibers. However, in order to increase the graft success, the protocol of differentiation of hiPSCs in myoblasts must be improved. The second part of my project was the induction of myogenesis from hiPSCs using recombinant proteins. To accomplish this, myogenic transcription factors fused with a cell penetrating peptide were produced and purified from the bacterial system. Their capacity to enter into mesenchymal-like cells in vitro was observed and their effects on the cells are currently under study. Once optimized, these therapeutic approaches could be clinically applied to treat dystrophic patients.

Master 2 / L.L.M. Propriété Intellectuelle Fondamentale et Technologies Numériques / L'évolution des nouvelles technologies et des biotechnologies dans le domaine de la santé a permis la création de nouveaux médicaments dits de thérapie génique. Parmi ces traitements, le médicament pharmacogénomique se démarque des autres car il a pour objectif de soigner un patient en fonction de son profil génétique. Ce médicament, comme l'ensemble des médicaments de façon générale, est soumis au droit de la propriété industrielle et plus particulièrement au droit des brevets depuis le 1ᵉʳ janvier 1995. Dès lors, il fait l'objet d'une restriction d'accès en raison du monopole conféré au breveté. Dans le domaine des médicaments, cet effet restrictif d'accessibilité a poussé à la création de solutions afin d'améliorer la circulation de ces biens essentiels à la santé publique. Néanmoins, les médicaments pharmacogénomiques disposent de spécificités propres que le droit en vigueur peine à accommoder. En effet, ces solutions sont bien souvent inapplicables, inadaptées ou inefficaces, de sorte que cette invention pourtant révolutionnaire demeure inaccessible pour de nombreux individus. L'objectif de ce mémoire sera ainsi de mettre en avant les enjeux relatifs à l'accessibilité réduite des médicaments pharmacogénomiques des suites de l'application du droit des brevets. Une étude des solutions législatives existantes afin de favoriser le droit des brevets sera proposée avant de se tourner vers de nouvelles solutions.

L'alpha-foetoprotéine (AFP) est une protéine hépatique feotale souvent réexprimée dans les hépatomes. L'utilisation de son promoteur en thérapie génique pourrait donc augmenter la spécificité du traitement. Nous avons tenté de mettre au point un système de thérapie génique utilisant des mutants plus puissants du promoteur de l'AFP associés au gène suicide de la thymidine kinase (TK). La comparaison de l'efficacité du gène TK sauvage et du mutant TK30 à induire la mort cellulaire en présence de la prodrogue ganciclovir (GCV) dans notre lignée cellulaire d'hépatome de rat v7.6 nous a révélé que le mutant n'était pas supérieur au gène sauvage. Nous avons comparé l'efficacité de mutants plus actifs du promoteur de l'AFP, MO1 et M11, à induire l'expression du gène TK placé sous leur contrôle ainsi que leur effet bystander respectif. Le mutant MO1 s'est révélé être le meilleur choix pour la thérapie. Un effet bystander a pu être observé in vivo chez des rats Buffalo injectés avec des v7.6 contenant le plasmide MO1-TK. Nous avons démontré la capacité de l'adénovirus Ad-CMV-LacZ ainsi que nos constructions Ad-MO1-EGFP et Ad-MO1-TK à transduire les hépatomes en culture et chez l'animal (sauf pour Ad-MO1-TK). Finalement, nous avons testé l'efficacité de notre système de thérapie génique in vivo. L'Ad-MO1-TK n'a pas réussi à éliminer les tumeurs. Notre système n'est donc pas encore fonctionnel tel qu'utilisé.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales 2003-2004 / La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire grave qui engendre une perte d’autonomie des patients et diminue leur espérance de vie. Cette maladie est la plus fréquente des dystrophies musculaires chez l’adulte avec une incidence mondiale d’une personne atteinte sur 15 000. Au Québec, cette maladie est d’une importance particulière, car elle touche une personne sur 500 dans les régions du Saguenay et de Charlevoix. La DM1 est causée par l’expansion du triplet CTG situé dans la région 3’ non-codante de la myotonine protéine kinase (DMPK). Toutefois, il a été démontré que la grande part des symptômes de la maladie seraient liés à l’accumulation nucléaire de l’ARNm de DMPK portant l’expansion. Ces ARNm mutés se lient à des facteurs nucléaires formant des foci dans les noyaux des cellules DM1, engendrant des effets toxiques sur le métabolisme cellulaire et sur l’épissage alternatif de certains ARNm. Nos travaux avaient comme but premier d’évaluer si la destruction de l’ARNm mutant de DMPK dans des myoblastes provenant de muscle squelettique DM1 permettrait de rétablir certaines fonctions et caractéristiques normales dans ces cellules. Trois technologies à base d’ARNs: les antisens, les ribozymes et les shRNAs ont diminué avec succès ces niveaux d’ARN mutés. Les ARNs antisens et les ribozymes, contrairement aux shRNA, ont permis un ciblage préférentiel des ARNs mutés de DMPK dans le noyau de myoblastes DM1. Ceci permet donc de maintenir un niveau basal de la protéine DMPK dans les myoblastes, un détail important advenant l’utilisation de ces molécules en thérapie génique chez l’humain. En utilisant les ribozymes, nous avons diminué la quantité et l’intensité des foci ce qui a permis de libérer les facteurs cellulaires se liant aux expansions de CUG. Ceci a eu comme effet de corriger un défaut d’épissage alternatif dans le récepteur à l’insuline. En exprimant de longs antisenses à l’ARNm de DMPK par un oncorétrovirus, nous avons constaté une restauration de la fusion cellulaire, de la capture de glucose ainsi qu’une diminution de CUGBP, un facteur d’épissage alternatif. Nous avons également démontré que la surexpression de hnRNP H, un facteur d’épissage liant les expansions de CUG, permettait aussi de diminuer les niveaux de CUGBP et ainsi corriger le défaut d’épissage alternatif du récepteur à l’insuline. Ces résultats démontrent donc pour la première fois le lien direct entre la rétention des ARNs mutés, la déplétion nucléaire d’un facteur d’épissage s’y liant et l’exacerbation de certaines caractéristiques du phénotype DM1. La somme de nos observations a permis deux choses importantes: en premier lieu, d’établir un nouveau modèle détaillé expliquant la pathogenèse de la DM1. En second lieu, nos résultats ont permi de valider la pertinence de détruire spécifiquement les transcrits mutés de DMPK afin de développer une thérapie génique efficace pour la DM1. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe neuromuscular disease that ultimately causes loss of mobility and premature death. DM1 is the most common muscular dystrophy in adults with a world wide incidence of 1 affected individual in every 15 000. This disease is of special relevance in the Saguenay and Charlevoix regions in Quebec, where 1 in every 500 individuals is a carrier of the mutation. DM1 is caused by the expansion of an unstable CTG trinucleotide repeat located in 3’UTR of the DMPK (DM protein kinase) gene. However, it has been shown that most DM1 symptoms are related to the nuclear retention of mutant DMPK mRNA. These mutant transcripts bind to nuclear proteins and form foci in DM1 cell nuclei. This is though to be the leading cause of metabolical disruptions and defective alternative splicing of several mRNAs observed in DM1 cells. Our main project objective was to evaluate whether destruction of mutant DMPK mRNA could restore normal phenotype features in DM1 human skeletal myoblasts. The use of three RNA-based approaches: antisense RNAs, ribozymes and shRNAs, all displayed significant reductions in mutant DMPK mRNA. Antisense RNAs and ribozymes, as opposed to shRNAs, allowed specific targeting and destruction of mutant DMPK mRNAs in the nucleus of DM1 myoblasts. This feature thus allows a basal level of DMPK protein expression which is of particular relevance in the advent of developing a gene therapy for DM1. Ribozymes were effective in reducing the number and intensity of foci present in the nucleus of the myoblasts, thus allowing the release of certain CUG-binding proteins. This resulted in restoration of the defective splicing of the insulin receptor mRNA. Antisense RNAs to the DMPK mRNA expressed by an oncoretrovirus restored myoblast fusion, glucose uptake and lowered nuclear levels of CUGBP, an alternative splicing factor. Over expression of hnRNP-H, an alternative splicing factor that we showed could bind to CUG repeats, also reduces expression of CUGBP and restores defective splicing of the insulin receptor. These results reveal for the first time the intricate link between mutant DMPK mRNA nuclear retention, depletion of a CUG-binding protein that is also a splicing factor and exacerbation of related DM1 features. In conclusion, our work has allowed to better define the mechanisms involved in DM1 pathogenesis and has validated the relevance of developing a gene therapy that specifically targets mutant DMPK mRNAs.

Les thérapies génique et cellulaire sont à l'avant-garde de la recherche sur le traitement des dystrophies musculaires. La thérapie par transfert de myoblastes a été proposée comme traitement potentiel de ces dystrophies et les transplantations de myoblastes ont donné des résultats significatifs. Dans cette optique, une thérapie cellulaire autologue est à favoriser et cette approche implique une modification génétique ex vivo. Cette méthode nécessite une efficacité exemplaire du transfert, de l'implantation et de l'expression de l'ADN recombinant. Les myoblastes du muscle squelettique humain sont cependant plus ou moins réfractaires à certains vecteurs viraux. Nous avons donc procédé à l'étude de l'efficacité de vecteurs dérivés d'un rétrovirus, d'un lentivirus, d'un adénovirus et de virus adéno-associés, dans la transduction d'un transgène dans les myoblastes humains. Nous établissons que les vecteurs rétroviraux et lentiviraux démontrent un potentiel remarquable dans une perspective de thérapie génique ex vivo, dédiée à la musculature squelettique humaine. / Gene and cell therapies are at the forefront of research for the treatment of muscular dystrophies. Myoblast transfer therapy was proposed as a potential treatment for these diseases and myoblast transplantation experiments yielded significant results. In this approach, an autologous cell therapy would be preferable and this implies ex vivo gene therapy. However, gene delivery and expression must be optimal in this context and human myoblast is refractory to some viral vectors. For that reason, we have studied the transduction capacities, on such cells, of viral vectors derived from retrovirus, lentivirus, adenovirus and adeno-associated virus. We concluded that the retroviral and lentiviral vectors are the best suited for ex vivo gene therapy of human skeletal muscle cells dedicated to cell therapy.

L'objectif de la thérapie génique est de guérir des déficiences génétiques et de nombreuses maladies acquises par l'introduction d'acides nucléiques dans les cellules mammifères. Les vecteurs chimiques sont une alternative aux vecteurs viraux pour le transfert de gène, leur immunogénicité est réduite, en plus de leur faible coût et de la facilité de leur production. Jusqu'à présent, les liposomes et les polymères cationiques sont les vecteurs chimiques les plus étudiés et utilisés pour le transfert d'ADN plasmidique (ADNp) thérapeutique. Parmi les multiples barrières biologiques, la diffusion cytosolique limitée de l'ADNp est critique pour le niveau d'expression du transgène. Le but de ce travail de thèse était d'identifier un peptide de liaison à la dynéine, qui serait capable de recruter la protéine motrice dynéine et de faciliter le transport d'ADNp vers le noyau le long des microtubules. Nous avons donc étudié le réseau d'interaction de la protéine adénovirale E3-14.7K. E3-14.7K est indirectement en interaction avec la chaîne légère de la dynéine TCTEL1 par l'intermédiaire de FIP-1. Différentes techniques ont été utilisées pour analyser les interactions de ces différentes protéines telles que Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), Förster Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), immunoprécipitation et Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM). La technique de BRET nous a permis d'identifier un peptide de 20 acides aminés d'E3-14.7K (P79-98) responsable de son interaction avec FIP-1. Associé à des Quantum Dots P79-98 (P79-98-Qdot) colocalise avec les microtubules isolés et dans les cellules HeLa. Nous avons mis au point une méthode de greffage du peptide directement sur l'ADNp. Une fois greffé avec P79-98 l'ADNp est capable d'interagir avec les microtubules dans les cellules HeLa et de migrer activement jusqu'au noyau. P79-98 améliore l'efficacité de la transfection des HeLa jusqu'à 77%.