Le virus humain T lymphotrope de type 1 (HTLV-1) est l’agent étiologique de la leucémie/lymphome T de l’adulte (ATLL) qui se développe après plusieurs décennies et pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. Parmi les protéines virales de HTLV-1, Tax et HBZ jouent un rôle déterminant dans le développement de l’ATLL. Si Tax participe au processus leucémogène dès les étapes précoces, HBZ jouerait plutôt un rôle dans le maintien du phénotype tumoral dans les étapes tardives. Dans ce contexte, là nous nous sommes intéressés à la régulation de l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL, par les protéines virales Tax et HBZ. Nous avons montré que Tax induit l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL de la famille Bcl-2 via la voie NF-κB, alors que HBZ n’a aucun effet sur leur expression. De plus, Tax coopère avec les facteurs de transcription c-Jun et JunD de la voie AP-1 pour augmenter l’expression de ces gènes anti-apoptotiques. En revanche, HBZ module uniquement la trans-activation de bfl-1 induite par Tax. L’ensemble de nos résultats indique donc que Tax joue un rôle prépondérant dans l’activation de l’expression de Bfl-1 et de Bcl-xL et suggère que Bfl-1 et Bcl-xL sont exprimées au cours des étapes précoces et tardives du développement de l’ATLL. Par une stratégie d’ARN interférence, nous avons ensuite montré que Bfl-1 et/ou Bcl-xL sont impliquées dans la survie de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1, suggérant que Bfl-1 et Bcl-xL représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour traiter l’ATLL. Actuellement, il existe des petites molécules ciblant les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, mais aucune ne cible spécifiquement Bfl-1. En collaboration avec la société IMAXIO, nous avons identifié par deux cribles à haut débit 83 molécules capables d’inhiber l’activité anti-apoptotique de Bfl-1. L’une de ces molécules induit spécifiquement la mort de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1 pour lesquelles Bfl-1 représente un gène de survie. Ainsi, ce travail doit permettre à terme de développer de futurs médicaments dirigés contre Bfl-1 et de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée contre l’ATLL / Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) that develops after several decades and for which there is no effective treatment. Among the viral proteins of HTLV-1, Tax and HBZ play a major role in the development of ATLL. If Tax participates in the initiation of leukemogenesis from the early stages, HBZ rather plays a role in maintaining the tumor phenotype in the late stages. The aims of our study were to better understand the regulation of Bfl-1 and Bcl-xL anti-apoptotic protein expression by Tax and HBZ viral proteins, as well as their role in the survival of HTLV-1-infected T-cells to propose new therapeutic strategies. We showed that Tax induces Bfl-1 and Bcl-xL expression via the NF-κB pathway, whereas HBZ has no effect on their expression. Tax also cooperates with c-Jun and JunD transcription factors of AP-1 family to increase the expression of these anti-apoptotic genes. By contrast, HBZ modulates the Tax-induced bfl-1 trans-activation. Altogether, our data indicate that Tax plays a key role in activating Bfl-1 and Bcl-xL expression and suggests that Bfl-1 and Bcl-xL are potentially expressed during the early and the late stages of ATLL development. Using short hairpin RNA strategy, we then showed that Bfl-1 and/or Bcl-xL are involved in HTLV-1-infected T-cell line survival, indicating that Bfl-1 and Bcl-xL represent potential therapeutic targets in the case of ATLL. One approach currently being developed in anti-cancer drug discovery is to search for small inhibitory compounds targeting anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family. But so far, no drug specifically targeting Bfl-1 is available. In collaboration with the IMAXIO Company, we have identified 83 molecules able to inhibit Bfl-1 anti-apoptotic activity using two high-throughput screening. One of these molecules specifically induced the death of HTLV-1-infected T-cell for which Bfl-1 represents a survival gene. This work provides new insight for long-term development of future drugs directed against Bfl-1 and should allow us to propose new therapeutic strategy for ATLL treatment

Parmi les cancers cutanés, le mélanome métastatique est le moins fréquent (5 à 7%) mais le plus meurtrier par sa forte résistante aux thérapies conventionnelles. Bien qu'immunogène, aucun traitement efficace n'existe actuellement pour traiter ce cancer, ce qui fait qu'il est urgent de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons évalué si l'Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1) pouvait représenter une cible d'intérêt thérapeutique dans le mélanome en inhibant l'expression du facteur IGF-1, à l'aide d'un épisome antisens, dans deux modèles cellulaires : des cellules de mélanome primaire B16-F0 et métastatique B16-F10 (cellules appelées B16-F0mod et B16-F10mod lorsque l'expression d’IGF-1 est inhibée).Dans des modèles expérimentaux in vivo, nos résultats montrent que la réduction d'expression d'IGF-1 induit une diminution de la tumorigénicité des cellules de mélanome, en générant des tumeurs sous-cutanées plus petites (B16-F0 et B16-F10 dans les souris C57BL/6) et en inhibant totalement (souris C57BL/6) ou fortement (souris NSG) la capacité des B16-F10 à former des métastases pulmonaires. Nous avons cherché à comprendre si cette perte de tumorigénicité, suite à l'inhibition du facteur IGF-1, était due à une modification de l'immunogénicité/antigénicité des cellules tumorales et/ou à une modification du potentiel tumorigène intrinsèque des cellules tumorales métastatiques.1/ L’immunisation de souris C57BL/6 à l'aide de cellules B16-F0mod induit la formation d’effecteurs humoraux lytiques en présence de complément dirigés contre la lignée parentale, mais également d’effecteurs cellulaires CD8+ capables d’induire la lyse des cellules tumorales in vitro et d’inhiber la croissance tumorale in vivo. Bien que l'analyse des voies humorale et cellulaire n'ait pas permis de démontrer les mécanismes IGF-1-dépendants mis en jeu avec les cellules B16-F10, l'immunisation des souris C57BL/6 à l'aide de cellules B16- F0mod conduit à une inhibition de la croissance des tumeurs sous-cutanées et du nombre de métastases pulmonaires, confirmant l'implication du facteur IGF-1 dans des mécanismes d'échappement tumoral au système immunitaire.2/ Nos résultats montrent par ailleurs que le facteur IGF-1 joue un rôle direct sur le potentiel tumorigène intrinsèque des cellules tumorales. Outre son action sur la prolifération des cellules tumorales, IGF-1 est impliqué dans le processus de transition épithélio-mésenchymateuse (augmentation des marqueurs N-cadhérine, vimentine, CD44 et CD29), favorisant le maintien de populations tumorales présentant un caractère souche (Sox2, Oct3/4, CD44, CD24, activité ALDH, side population, capacité à former des sphéroïdes). Par ce mécanisme, IGF-1 favorise à la fois les propriétés migratoires et d'efflux de drogues, comme la mitoxantrone, par les transporteurs ABC, qui explique en partie la forte résistance des mélanomes aux thérapies conventionnelles.Ces travaux montrent que l’inhibition de la voie IGF1/IGF1-R pourrait être une bonne stratégie pour le développement de traitements anti-tumoraux contre le mélanome. Outre le développement de stratégies d'immunothérapie, le blocage de la voie IGF-1 permettrait également de sensibiliser les cellules de mélanome aux traitements conventionnels et de diminuer le potentiel métastatique des cellules tumorales. / Metastatic melanoma is the least common (5-7 %), but is responsible for most skin cancer deaths by its strong resistance to conventional anti-cancer treatments. Although immunogen, no effective treatment currently exists against this aggressive form, making urgent to find new therapeutic targets. In this context, we assessed whether the Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) could represent a target of therapeutic interest in melanoma inhibiting the expression of IGF-1 by means of an episome-based vector encoding antisense IGF-1, in two cellular models: primary melanoma cells B16-F0 and metastatic B16-F10 (designated B16-F0mod and B16-F10mod when IGF-1 expression is inhibited).In experimental models in vivo, our results show that the reduction of IGF-1 expression induced a decrease of the melanoma cells tumorigenicity, generating smaller tumors under the skin (B16-F0 and B16-F10 in the C57BL/6 mice) and inhibiting totally (C57BL/6) or strongly (NSG mice) the developpment of B16-F10 lung metastases. We sought to understand whether this loss of tumorigenicity, following IGF-1 inhibition, was due to a change of immunogenicity/antigenicity of tumor cells and/or to intrinsic tumorigenic potential modification of metastatic tumor cells.1 / Immunization of mice C57BL/6 mice with B16-F0mod cells induces the formation of humoral lytic effectors in the presence of complement against the parental line, but also CD8+ effector cells capable of inducing tumor cells lysis in vitro and inhibiting tumor growth in vivo. Although the analysis of humoral and cellular pathways did not demonstrate IGF-1- dependent mechanisms involved in B16-F10 cells, immunization of C57BL/6 mice with B16 cells F0mod leads to skin tumor growth inhibition and a reduction in pulmonary metastases number, confirming the involvement of IGF-1 factor in tumor escape mechanisms of the immune system.2 / Our results also show that IGF-1 plays a direct role in the intrinsic tumorigenic potential of tumor cells. In addition to its effect on tumor cells proliferation, IGF-1 is involved in epithelial-mesenchymal transition (increased N-cadherin, vimentin, CD44 and CD29 markers), promoting the maintenance of tumor populations with stemness properties (Sox2, Oct3/4, CD44, CD24, ALDH activity side-population and ability to form spheroids). By this mechanism, IGF-1 promotes both migration properties and drugs efflux such as mitoxantrone, via ABC transporters, which partly explains the strong resistance of melanoma to conventional therapies.This work shows that the inhibition of IGF1/IGF1-R pathway might be a good strategy for the development of anti-tumor treatments against melanoma. In addition to developing immunotherapy strategies, blocking the IGF-1 pathway would also sensitize melanoma cells to conventional therapy and decrease the metastatic potential of tumor cells.

[ES] La biogénesis ribosomal es uno de los procesos más complejos, esenciales y costosos energéticamente de la célula eucariota. La formación de las subunidades ribosomales en levaduras comienza en el nucléolo con la transcripción del ARNr. En este proceso se requiere la participación de más de doscientos factores de ensamblaje y ARNs pequeños nucleolares (snoARNs) que no formarán parte del ribosoma maduro aunque son necesarios para un apropiado procesamiento del ARNr y organización estructural de las subunidades ribosomales. Los estudios estructurales de los estadios de maduración de la subunidad 60S han permitido la identificación de algunas interacciones funcionales entre los distintos factores de ensamblaje. Entre ellos se encuentran las proteínas Nop7, Erb1 e Ytm1 que forman un heterotrímero discreto denominado subcomplejo Nop7 en levaduras, o complejo PeBoW en mamíferos, compuesto por los ortólogos Pes1, Bop1 y WDR12, respectivamente. Este complejo puede detectarse de forma aislada de las partículas prerribosomales. La formación de este heterotrímero es esencial para el ensamblaje de la subunidad 60S ya que garantizan la correcta maduración del extremo 5' del ARNr 5,8S facilitando así su asociación con el ARNr 25S, aunque se desconoce en detalle el papel exacto en la biogénesis ribosomal. En este trabajo se ha realizado un análisis de las interacciones entre los componentes del PeBoW así como una aproximación a la resolución estructural del complejo en solución. Usando una combinación de técnicas biofísicas, nuestros resultados indican que la conformación estructural que adopta el complejo PeBoW en el nucleoplasma es diferente a la descrita en el contexto prerribosomal. Además, se han identificado posibles funciones que podría estar ejerciendo el complejo PeBoW o bien las distintas proteínas del complejo de forma aislada fuera del prerribosoma. Asimismo se conoce que la biogénesis ribosomal es un mecanismo altamente regulado y estrechamente relacionado con crecimiento y proliferación celular. La imperiosa necesidad de síntesis de ribosomas y proteínas que tiene una célula tumoral convierte a este proceso en un punto débil de la misma. Por esta razón, hay un gran interés para estudiar la biogénesis ribosomal como diana terapéutica contra el cáncer. Se ha observado que la paralización de esta vía es capaz de promover la activación no genotóxica del supresor tumoral p53, a diferencia de los efectos indeseados que provocan las terapias convencionales contra el cáncer. Como primer paso hacia el desarrollo de herramientas inhibidoras de la biogénesis del ribosoma, hemos utilizado la información cristalográfica que poseíamos del complejo de Chaetomium thermophilum entre los factores de ensamblaje Erb1 e Ytm1 para realizar una selección guiada por la estructura de péptidos de interferencia. Los péptidos de interferencia han sido analizados in vitro para determinar su capacidad de interacción utilizando técnicas biofísicas. Además, se han generado péptidos de interferencia con la secuencia humana de Erb1/Ytm1 para evaluar sus efectos en cultivo de células de cáncer de colon HCT-116. Nuestros resultados indican que el estrés ribosómico se puede inducir en diferentes etapas del proceso de maduración al dirigirse a las interacciones proteína-proteína, elevándolas como una alternativa al uso de inhibidores de la ARN pol I. / [CA] La biogènesi ribosomal és un dels processos més complexos, essencials i costosos energèticament de la cèl·lula eucariota. La formació de les subunitats ribosomals en llevats comença en el nuclèol amb la transcripció de l'ARNr. En aquest procés es requereix la participació de més de dos-cents factors d'assemblatge i ARNs xicotets nucleolars (snoARNs) que no formaran part del ribosoma madur encara que són necessaris per a un apropiat processament de l'ARNr i organització estructural de les subunitats ribosomals. Els estudis estructurals dels estadis de maduració de la subunitat 60S han permès la identificació d'algunes interaccions funcionals entre els diferents factors d'assemblatge. Entre ells es troben les proteïnes Nop7, Erb1 i Ytm1 que formen un heterotrímer discret denominat subcomplex Nop7 en llevats, o complex PeBoW en mamífers, compost pels ortòlegs Pes1, Bop1 i WDR12, respectivament. Aquest complex pot detectar-se de forma aïllada de les partícules prerribosomals. La formació d'aquest heterotrímer és essencial per a l'assemblatge de la subunitat 60S ja que garanteix la correcta maduració de l'extrem 5' de l'ARNr 5,8S facilitant així la seua associació amb l'ARNr 25S, encara que es desconeix detalladament el paper exacte en la biogènesi ribosomal. En aquest treball s'ha realitzat una anàlisi de les interaccions entre els components del PeBoW així com una aproximació a la resolució estructural del complex en solució. Utilitzant una combinació de tècniques biofísiques, els nostres resultats indiquen que la conformació estructural que adopta el complex PeBoW en el nucleoplasma és diferent a la descrita en el context prerribosomal. A més, s'han identificat possibles funcions que podria estar exercint el complex PeBoW o bé les diferents proteïnes del complex de forma aïllada fora del prerribosoma. Així mateix es coneix que la biogènesi ribosomal és un mecanisme altament regulat i estretament relacionat amb creixement i proliferació cel·lular. La imperiosa necessitat de síntesi de ribosomes i proteïnes que té una cèl·lula tumoral converteix a aquest procés és un punt feble d'aquesta. Per aquesta raó, hi ha un gran interès per a estudiar la biogènesi ribosomal com a diana terapèutica contra el càncer. S'ha observat que la paralització d'aquesta via és capaç de promoure l'activació no genotòxica del supressor tumoral p53, a diferència dels efectes indesitjats que provoquen les teràpies convencionals contra el càncer. Com a primer pas cap al desenvolupament d'eines inhibidores de la biogènesi del ribosoma, hem utilitzat la informació cristal·logràfica que posseíem del complex de Chaetomium thermophilum entre els factors d'assemblatge Erb1 i Ytm1 per a realitzar una selecció guiada per l'estructura de pèptids d'interferència. Els pèptids d'interferència han sigut analitzats in vitro per a determinar la seua capacitat d'interacció utilitzant tècniques biofísiques. Així mateix, s'han generat pèptids d'interferència amb la seqüència humana de Erb1/Ytm1 per a avaluar els seus efectes en cultiu de cèl·lules de càncer de còlon HCT-116. Els nostres resultats indiquen que l'estrès ribosòmic es pot induir en diferents etapes del procés de maduració en dirigir-se a les interaccions proteïna-proteïna, elevant-les com una alternativa a l'ús d'inhibidors de l'ARN pol I. / [EN] Ribosomal biogenesis is a complex, essential and one of the most energy-costing process in eukaryotic cells. The assembling of the ribosomal subunits, in yeast, starts with the RNA transcription inside the nucleolus. This process requires the participation of more than two hundred assembly factors and small nucleolar RNAs (snoRNAs) that will not be part of the mature ribosome, however, they are still necessary to perform the appropriate rRNA processing and structural management. The structural studies on the maturation stages of the 60S subunit have shown functional interactions between different assembling factors. In this group, we find Nop7, Erb1 and Ytm1, that both form a discrete heterotrimer called Nop7 subcomplex in yeast, or PeBoW in mammalian, composed by the respective orthologues Pes1, Bop1 and WDR12. This complex can be found isolated from the pre-ribosomal particles. The presence of this complex is crucial to the 60S subunit assembling, once it ensures the correct maturation of the 5' tip of the rRNA 5,8S, supporting the association with the 25S rRNA. Yet, the details of the PeBoW complex roll in ribosomal biogenesis remain unknown. Hereafter, there are some analysis of interaction assays between the PeBoW component proteins, as well as an approach to structural of the complex in solution. Using different biophysical techniques, the results suggest that PeBoW complex adopts a different conformation in the nucleoplasm than the described in the pre-ribosomal context. Furthermore, it hints some other functions of the PeBoW complex, or the isolated component proteins out of the pre-ribosome path. Besides that, the ribosomal biogenesis is a highly regulated process and strictly related with cellular growth and proliferation. The mandatory demand of ribosome and protein synthesis of tumoral cells make this process a weak point of it. This is the reason why ribosomal biogenesis as cancer treatment target is a point of great interest. According to some studies, it is expected that the interruption of this pathway can lead the non-genotoxic activation of the tumor suppressor p53, unlike other conventional cancer therapies. As a first step to development of ribosomal biogenesis inhibiting tools, the structural information of Erb1 and Ytm1 in Chaetomium thermophilum complex, was taken to design structure-guided interfering peptides. Using biophysical techniques, the interfering peptides were evaluated in vitro to determine their interaction ability. Then, human-sequenced Erb1/Ytm1 interfering peptides were designed to look over the effects on colon cancer cells HCT-116. The results indicate that the ribosomal stress can be induced in different stages of the maturation process, by approaching protein-protein interactions, planting it as an alternative to RNA pol I inhibitors. / Este trabajo ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación enumerados a continuación: SAF2015-67077-R, SAF2017-89901-R y PROMETEO/2018/0 Durante el periodo de realización de esta tesis, la autora, Lidia Orea Ordóñez, ha sido beneficiaria de una subvención para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral denominada “Ayudas para la contratación de personal investigador de carácter predoctoral”, (ACIF) (ACIF/2016/103), otorgada por la Generalitat Valenciana, Conselleria de Innovación, Universidades, Ciencia y Sociedad Digital, concedida en la convocatoria 2016. / Orea Ordóñez, L. (2022). Estructura y función del complejo PeBoW como modelo en el desarrollo de posibles herramientas terapéuticas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182347 / TESIS

La leucémie myéloïde aiguë (AML) est une forme agressive du cancer du sang qui est caractérisée par un haut taux de mortalité, tant chez les patients plus jeunes que plus âgés. Le développement de nouveaux traitements est ardu par l’hétérogénéité de cette maladie. Dans cette perspective, les études CCC phénotypiques menées à l’IRIC visent à déceler de nouveaux composés ayant une synergie contre des souches AML primaires de patients en vue de personnaliser les thérapies selon leur profil cytogénétique. Il a été découvert que le MG624, un antagoniste des récepteurs nicotiniques α7-nAChR inhibant la prolifération des cellules cancéreuses dans les SCLC, démontrait une activité spécifique contre la souche AML5. Dans cette recherche, les voies de synthèse des analogues du MG624 sont explorées afin de concevoir une série de sondes permettant d’identifier les cibles potentielles via une approche chimioprotéomique par affinité dans le lysat cellulaire. Cette méthode a permis d’identifier trois cibles potentielles à l’aide d’un essai par compétition et de contrôles négatifs, soit XIAP, NQO2 et U119B, toutes impliquées dans différentes formes de cancer. Ces expériences ont mené à une meilleure compréhension des motifs procurant l’activité du composé chez les cellules leucémiques. La synthèse d’une sonde par photoaffinité a ensuite été élaborée pour éventuellement lier les protéines identifiées de manière covalente dans l’environnement cellulaire natif afin de valider ces cibles. / Acute myeloid leukemia (AML) is an aggressive form of blood cancer characterized by a high mortality rate in both younger and older patients. The development of new treatments is hampered by the heterogeneity of this disease, which has led to the phenotypic CCC studies carried out at IRIC to identify new compounds that exhibit synergies against primary AML patient strains to personalize therapies according to their cytogenetic profile. MG624, an α7-nAChR nicotinic receptor antagonist that inhibits cancer cell proliferation in SCLC, was found to have specific activity against AML5. In this research, the synthetic pathways of MG624 analogues are explored to design a series of probes to identify potential targets via an affinity-based chemoproteomic approach in cell lysate. This method identified three potential targets using a competitive assay and negative controls, namely XIAP, NQO2 and U119B, all implicated in different forms of cancer. These experiments led to a better understanding of the motifs that provide the compound's activity in leukemic cells. A photo-affinity probe synthesis was then developed to covalently bind the identified proteins in the native cellular environment to eventually validate these targets.