This thesis presents a strategy designed to determine how Thi1 and Thi5 may differentially regulate thiamine production and the vegetative and sexual life cycles in fission yeast. Fission yeast cells regulate the cell cycle and development in response to available nutrients. Thiamine, vitamin B1, is an essential vitamin and its active form, TDP (thiamine diphosphate), is an important co-factor for many metabolic enzymes. It also acts as an inhibitor of meiosis and zygote formation in fission yeast. The thiamine biosynthetic pathway in fission yeast is repressed by the presence of thiamine. The transcription factors, Thi1 and Thi5, are independently capable of positively regulating the nmt1 (no message in thiamine) promoter in fission yeast and both factors are required for wildtype nmt1 expression. Although Thi1 and Thi5 regulate the same promoter in thiamine biosynthesis, it has been previously found that Thi1 and Thi5 antagonistically regulate different aspects of meiosis. Thi1 and Thi5 are both Zn(II) 2Cys6 transcription factors. Since zinc finger transcription factors are known to homo- and hetero-dimerize, I hypothesize that the synergistic and antagonistic attributes of Thi1 and Thi5 may be due to this process. To examine their potential interaction in vegetative and meiotic cells using fluorescence resonance energy transfer (FRET) as well as co-immunoprecipitation, tagged versions of these proteins have been constructed. For FRET analysis Thi1 and Thi5 have been successfully tagged with CFP and YFP and are able to rescue the thiamine auxotrophy of strains lacking thi1 and thi5. To perform co-immunoprecipitation Thi1 and Thi5 have been tagged with His6. I was able to detect the tagged versions of Thi1 and Thi5 using commercially available antibodies against the fluorescent tags CFP and YFP and the His6 tag. The use of these constructs to address the interaction between these proteins is currently underway. / Thesis (Master, Biology) -- Queen's University, 2012-06-29 09:18:42.349

O gene thi1 foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de A. thaliana devido à sua capacidade de complementar mutantes de E. coli para rotas de reparo de DNA. O posterior seqüenciamento desse gene permitiu a identificação de similaridade com genes de fungos ativados em condições de estresse ou ativados na ausência de tiamina (vitamina B1). A síntese de tiamina é de grande importância já que na forma pirofosfatada é coenzima essencial para vários processos vitais das células. No presente estudo, foi realizada a caracterização funcional do gene thi1 utilizando-se, para tanto, linhagens de A. thaliana mutante e/ou com expressão diferencial desse gene. Foram analisados parâmetros biológicos como viabilidade de sementes, antioxidantes, danos no DNA, e atividade transcricional e traducional do gene thi1. Foi iniciado, também, o processo de padronização da quantificação de tiamina em plantas. Foi observado, para a linhagem mutante, menor viabilidade de sementes, maior produção de antioxidantes e maior quantidade de danos no DNA de cloroplastos. Quanto à atividade transcricional e traducional, foi observado que o gene thi1 apresenta um pico de expressão no período da tarde com um ritmo circadiano em potencial. Além disso, o acúmulo da proteína nos tecidos acompanha o perfil de expressão de RNAm thi1, o que sugere que o modo de regulação primária do gene é em nível transcricional. A análise comparativa de proteína por gel bi-dimensional entre as linhagens selvagem e mutante permitiu a identificação de quatro proteínas em maior quantidade na mutante, sendo duas identificadas por seqüenciamento: enolase e fosfoglicerato desidrogenase. Na análise de tiamina foi observado que a linhagem mutante acumula um composto, não identificado, que emite fluorescência no mesmo comprimento de onda que as tiaminas, sendo, provavelmente, um precursor do tiazol. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que THI1 defectivo acarretaria em desbalanço metabólico e, não necessariamente, que o gene thi1 estaria envolvido em dupla função. Em bactérias, entre os precursores de tiazol, estão a cisteína e o gliceraldeído 3-fosfato (G3P). O G3P em excesso seria deslocado para o ciclo de Calvin a fim de regenerar a ribulose 1,5-bisfosfato. Maior quantidade de G3P, maior taxa fotossintética, maior produção de ROS, maior produção de antioxidantes na mutante. A maior disponibilidade de G3P aumentaria o fluxo de glicólise e, consequentemente, de respiração mitocondrial, aumentando a taxa de ROS. A fosfoglicerato desidrogenase, em maior quantidade na mutante, está envolvida na síntese de cisteina que acarreta na produção de glutationa. A glutationa e a cisteína, por sua vez, atuariam induzindo o promotor da SOD, acarretando, então, na produção de mais antioxidantes. Todos esses antioxidantes estariam envolvidos na detoxificação de ROS presente em excesso na linhagem mutante, que levaria à menor viabilidade de sementes e maior quantidade de danos no DNA. Devido à grande quantidade de ROS, haveria superexpressão de enolase, envolvida no bloqueio da proliferação celular e, subsequentemente, em morte celular programada, o que explicaria o retardo no desenvolvimento da linhagem mutante / thi1 gene was previously isolated from A. thaliana cDNA library due to its capacity to complement mutant Escherichia coli defective in DNA repair. The late analyse of this gene showed its similarity with yeast genes activated under stress conditions or activated in the absence of thiamine. It means that THI1 has bifunctional activity, being involved in thiamine biosynthesis and repair/tolerance to DNA damage. The thiamine biosynthesis is important because its phosphorilated form is a coenzyme essential to several vital process at the cell. The repair/tolerance to DNA damage shows its importance because it is necessary to maintenance the genetic stability of the individual. In the present study, we report the functional characterization of thi1 gene using A. thaliana lines with differential expression of this gene. We analyzed the seed viability, the fresh weight of different lines, thi1 mRNA expression, the amount of protein produced and the expression in situ using the thi1-GUS construction in different conditions. Besides that we quantified free radicals in the wild-type (WT) and mutant lines and analysed the response of the mutant line, with defective THI1, to the production of antioxidant enzymes and non-enzimatics antioxidants. We also quantified DNA damage in chloroplast of WT and mutant lines and we did comparative proteomic analysis between and began the standardization of the thiamine quantification in plants. All these results together lead us up to a better understanding about THI1 activity at the cellular metabolism. Previous results suggested that besides thiamine synthesis, THI1 would be involved in repair/tolerance to DNA damage. Results obtained in this study strengthen the hypothesis of this another function of the thi1 gene. Considering that the mutant line does not produce a higher quantity of ROS, as indicated by hydrogen peroxide quantification, but shows more antioxidants and more DNA damage, probably the genetic material of this line is more susceptible to damage, showing that the defective THI1 protein could not protect it efficiently.

O gene thi1 foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de A. thaliana devido à sua capacidade de complementar mutantes de E. coli para rotas de reparo de DNA. O posterior seqüenciamento desse gene permitiu a identificação de similaridade com genes de fungos ativados em condições de estresse ou ativados na ausência de tiamina (vitamina B1). A síntese de tiamina é de grande importância já que na forma pirofosfatada é coenzima essencial para vários processos vitais das células. No presente estudo, foi realizada a caracterização funcional do gene thi1 utilizando-se, para tanto, linhagens de A. thaliana mutante e/ou com expressão diferencial desse gene. Foram analisados parâmetros biológicos como viabilidade de sementes, antioxidantes, danos no DNA, e atividade transcricional e traducional do gene thi1. Foi iniciado, também, o processo de padronização da quantificação de tiamina em plantas. Foi observado, para a linhagem mutante, menor viabilidade de sementes, maior produção de antioxidantes e maior quantidade de danos no DNA de cloroplastos. Quanto à atividade transcricional e traducional, foi observado que o gene thi1 apresenta um pico de expressão no período da tarde com um ritmo circadiano em potencial. Além disso, o acúmulo da proteína nos tecidos acompanha o perfil de expressão de RNAm thi1, o que sugere que o modo de regulação primária do gene é em nível transcricional. A análise comparativa de proteína por gel bi-dimensional entre as linhagens selvagem e mutante permitiu a identificação de quatro proteínas em maior quantidade na mutante, sendo duas identificadas por seqüenciamento: enolase e fosfoglicerato desidrogenase. Na análise de tiamina foi observado que a linhagem mutante acumula um composto, não identificado, que emite fluorescência no mesmo comprimento de onda que as tiaminas, sendo, provavelmente, um precursor do tiazol. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que THI1 defectivo acarretaria em desbalanço metabólico e, não necessariamente, que o gene thi1 estaria envolvido em dupla função. Em bactérias, entre os precursores de tiazol, estão a cisteína e o gliceraldeído 3-fosfato (G3P). O G3P em excesso seria deslocado para o ciclo de Calvin a fim de regenerar a ribulose 1,5-bisfosfato. Maior quantidade de G3P, maior taxa fotossintética, maior produção de ROS, maior produção de antioxidantes na mutante. A maior disponibilidade de G3P aumentaria o fluxo de glicólise e, consequentemente, de respiração mitocondrial, aumentando a taxa de ROS. A fosfoglicerato desidrogenase, em maior quantidade na mutante, está envolvida na síntese de cisteina que acarreta na produção de glutationa. A glutationa e a cisteína, por sua vez, atuariam induzindo o promotor da SOD, acarretando, então, na produção de mais antioxidantes. Todos esses antioxidantes estariam envolvidos na detoxificação de ROS presente em excesso na linhagem mutante, que levaria à menor viabilidade de sementes e maior quantidade de danos no DNA. Devido à grande quantidade de ROS, haveria superexpressão de enolase, envolvida no bloqueio da proliferação celular e, subsequentemente, em morte celular programada, o que explicaria o retardo no desenvolvimento da linhagem mutante / thi1 gene was previously isolated from A. thaliana cDNA library due to its capacity to complement mutant Escherichia coli defective in DNA repair. The late analyse of this gene showed its similarity with yeast genes activated under stress conditions or activated in the absence of thiamine. It means that THI1 has bifunctional activity, being involved in thiamine biosynthesis and repair/tolerance to DNA damage. The thiamine biosynthesis is important because its phosphorilated form is a coenzyme essential to several vital process at the cell. The repair/tolerance to DNA damage shows its importance because it is necessary to maintenance the genetic stability of the individual. In the present study, we report the functional characterization of thi1 gene using A. thaliana lines with differential expression of this gene. We analyzed the seed viability, the fresh weight of different lines, thi1 mRNA expression, the amount of protein produced and the expression in situ using the thi1-GUS construction in different conditions. Besides that we quantified free radicals in the wild-type (WT) and mutant lines and analysed the response of the mutant line, with defective THI1, to the production of antioxidant enzymes and non-enzimatics antioxidants. We also quantified DNA damage in chloroplast of WT and mutant lines and we did comparative proteomic analysis between and began the standardization of the thiamine quantification in plants. All these results together lead us up to a better understanding about THI1 activity at the cellular metabolism. Previous results suggested that besides thiamine synthesis, THI1 would be involved in repair/tolerance to DNA damage. Results obtained in this study strengthen the hypothesis of this another function of the thi1 gene. Considering that the mutant line does not produce a higher quantity of ROS, as indicated by hydrogen peroxide quantification, but shows more antioxidants and more DNA damage, probably the genetic material of this line is more susceptible to damage, showing that the defective THI1 protein could not protect it efficiently.

A forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade. / The active form of vitamin B1, Thiamine pyrophosphate (TPP), is an indispensable cofactor for some enzymes that act on carbohydrates and amino acids metabolism. Its biosynthesis requires the independent formation of its compounds, pyrimidine and thiazole. In prokaryotes, the vitamin B1 biosynthetic way has already been elucidated, but in eukaryotes there are some gaps to be filled. In Arabidopsis thaliana, the Thi1 protein is possibly responsible for the synthesis of the thiazole moiety, since a related compound to TPP was found in its structure. In this work, we have investigated Thi1 and its natural mutant Thi1(A140V), which is responsible for the thiamin auxotrophy in A. thaliana mutant line, to identify the role this mutation plays in the structure and activity of Thi1. The proteins were produced in E. coli and the results of biophysical analysis using fluorescence and Circular Dichroism (CD) showed considerable differences in the protein stability. Thermal and chemical unfolding studies have shown a difference in the melting temperature (around 4 ºC higher for Thi1) and concentration of guanidine at which half of the protein had unfolded (0,42 M for Thi1 and 0,24 M for Thi1(A140V)). The fluorescence anisotropy data obtained from thermal unfolding showed Thi1(A140V) is more unstable compared to Thi1. We have also carried out tests of absorption, CD and infra-red to assess the presence and to characterize the possible precursor of TPP in Thi1 (A140V). The results showed that the ligants could have different compositions. However, complementary results from NMR (1D 1H e 2D TOCSY) revealed that the difference observed in the ligant samples from both proteins were actually related to the proportion of four distinct compound population, representing a ligant pool. In the sample from Thi1(A140V), the dominant population corresponded to ADP. Besides, although both samples contained ADT, it was significantly less abundant in that one derived from Thi1(A140V). Concluding, the results demonstrated that the A140V mutation leaded to a more unstable conformation of Thi1 and, additionally, the presence of smaller amounts of ADT in Thi1(A140V) suggests this change might have contributed to reducing its activity.

A forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade. / The active form of vitamin B1, Thiamine pyrophosphate (TPP), is an indispensable cofactor for some enzymes that act on carbohydrates and amino acids metabolism. Its biosynthesis requires the independent formation of its compounds, pyrimidine and thiazole. In prokaryotes, the vitamin B1 biosynthetic way has already been elucidated, but in eukaryotes there are some gaps to be filled. In Arabidopsis thaliana, the Thi1 protein is possibly responsible for the synthesis of the thiazole moiety, since a related compound to TPP was found in its structure. In this work, we have investigated Thi1 and its natural mutant Thi1(A140V), which is responsible for the thiamin auxotrophy in A. thaliana mutant line, to identify the role this mutation plays in the structure and activity of Thi1. The proteins were produced in E. coli and the results of biophysical analysis using fluorescence and Circular Dichroism (CD) showed considerable differences in the protein stability. Thermal and chemical unfolding studies have shown a difference in the melting temperature (around 4 ºC higher for Thi1) and concentration of guanidine at which half of the protein had unfolded (0,42 M for Thi1 and 0,24 M for Thi1(A140V)). The fluorescence anisotropy data obtained from thermal unfolding showed Thi1(A140V) is more unstable compared to Thi1. We have also carried out tests of absorption, CD and infra-red to assess the presence and to characterize the possible precursor of TPP in Thi1 (A140V). The results showed that the ligants could have different compositions. However, complementary results from NMR (1D 1H e 2D TOCSY) revealed that the difference observed in the ligant samples from both proteins were actually related to the proportion of four distinct compound population, representing a ligant pool. In the sample from Thi1(A140V), the dominant population corresponded to ADP. Besides, although both samples contained ADT, it was significantly less abundant in that one derived from Thi1(A140V). Concluding, the results demonstrated that the A140V mutation leaded to a more unstable conformation of Thi1 and, additionally, the presence of smaller amounts of ADT in Thi1(A140V) suggests this change might have contributed to reducing its activity.

Thiazole biosynthetic protein (THI1) is involved in the synthesis of the thiazole ring, a thiamine (vitamin B1) component. Thiamine is an essential co-factor in several carbohydrate and amino acid metabolic pathways. Prokaryotes and a few eukaryotes, such as fungi and plants, are able to synthesize thiamine de novo. These organisms contain the genes that encode the corresponding enzymes (such as THI1) that perform this metabolic function. THI1 actually functions as a reagent rather than as a conventional catalytic enzyme, as the THI1 polypeptide itself serves as the sulfide donor for thiazole formation. This gene also plays a role in organelle DNA damage tolerance. Arabidopsis thaliana has only one copy of the thi1 gene (At-thi1). Transcripts derived from At-thi1 are targeted simultaneously to chloroplasts and mitochondria by differential usage of two in-frame initiation codons. The tz-201 A. thaliana thi1 mutant has been shown to accumulate more sucrose in its tissues than wild-type plants. This suggests that a better understanding of thi1 genes and the role they play in cellular sucrose accumulation may be relevant for improving commercially important crops such as sugarcane. Sugarcane (Saccharum spp.) is a C4 photosynthesis monocot. Unlike A. thaliana, sugarcane has at least two thi1 copies (sc-thi1.1 and sc-thi1.2), as do the other C4 grasses. This thesis concerns the molecular and functional analyses of sugarcane thi1 (sc-thi1) gene homologues. The identified alleles related to sc-thi1.2 have some differences in sequence and seems to be diverging into two subgroups (sc-thi1.2a and sc-thi1.2b), based on phylogenetic analyses. Expression analysis showed that each sc-thi1 copy is expressed differentially in individual tissues and in developing stages levels. Subcellular analysis showed that sc-thi1.1 and sc-thi1.2b have the same cellular distribution pattern, distinct from the observed for sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 and sc-thi1.2b were also able to partially complement thiamine auxotrophy in a yeast mutant deficient in thiamine biosynthesis. A similar complementation assay is not possible in the A. thaliana tz-201 mutant owing to low transformation efficiencies. Thus, Physcomitrella patens was chosen to generate thi1 mutant lines for future functional complementation studies. P. patens is a moss used as a plant model, with a small size, short life cycle and a haploid dominant phase. Despite its simplicity, it has six thi1 homologues copies. Homologous Recombination was used to generate P. patens thi1 mutants. In each case, a target thi1 gene was disrupted by replacing its coding region with an antibiotic resistance gene cassette. Single mutants were obtained for all six thi1 gene copies. All the knockout lines were able to survive and grow with only minor effects on morphology and physiology. Deletion of one of the thi1 gene copies (PpThi1.20F) drastically affected protoplast survival and regeneration, suggesting a role for this gene in early (polar) cell division and differentiation. The experimental design, which permits recycling of the selectable marker cassettes, provides a research platform for the construction of double, triple, quadruple or quintuple mutants in the future. The individual mutants line generated in this work, as well as the possible multiple mutants, will be useful for thi1 functional complementation experiments and for discerning the specific functions of individual thi1 gene family members. / THI1 (proteína da biossíntese de tiazol) está envolvida na síntese do anel de tiazol, um componente de tiamina (vitamina B1). A tiamina é um cofator essencial em várias vias metabólicas de carboidratos e aminoácidos. Somente procariontes e alguns eucariontes, como fungos e plantas, são capazes de sintetizar a tiamina de novo. A proteína THI1 atua mais como um reagente do que como uma enzima catalítica convencional, pois usa a si mesmo como doador de sulfeto para a formação do anel de tiazol. Este gene também está envolvido na tolerância ao dano no DNA das organelas. A. thaliana apresenta apenas uma cópia do gene thi1. Seu transcrito primário é direcionado simultaneamente aos cloroplastos e mitocôndrias através do uso diferencial de dois códons de iniciação, presentes no mesmo quadro aberto de leitura. Além disso, o mutante tz-201 de A. thaliana acumula mais sacarose em seus tecidos do que a planta selvagem. Isso sugere que um melhor entendimento do gene thi1 e seu papel no acúmulo de sacarose podem ser importantes para o melhoramento comercial de cultivares, como cana-de-açúcar. Cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma monocotiledônea de metabolismo fotossintético C4. Diferentemente do observado em A. thaliana, a cana-de-açúcar possui pelo menos duas cópias (sc-thi1.1 e sc-thi1.2) homólogas a thi1, como observado também para outras gramíneas C4. Nesta tese são discutidas análises moleculares e funcionais dos homólogos do gene thi1 (sc-thi1) de cana-de-açúcar. Os alelos identificados como relativos a sc-thi1.2 apresentam algumas diferenças em suas sequências e, baseado em análises filogenéticas, parecem estar divergindo em dois subgrupos (sc-thi1.2a e sc-thi1.2b). As análises de expressão mostraram que cada cópia de sc-thi1 é diferencialmente expressa em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento. A análise de localização subcelular mostrou sc-thi1.1 e sc-thi1.2b apresentam o mesmo padrão de distribuição, distinto do observado para sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 e sc-thi1.2b também foram capazes de complementar parcialmente a auxotrofia para tiamina em leveduras mutantes, deficientes na via de biossíntese de tiamina. Um teste similar de complementação funcional mutante tz-201 de A. thaliana não é possível no devido à baixa eficiência de transformação. Assim, Physcomitrella patens foi escolhida para gerar linhagens mutantes de thi1 para futuros estudos de complementação funcional. P. patens é um musgo usado como planta modelo, apresenta tamanho pequeno, um ciclo de vida curto e uma fase dominante haploide. Apesar de sua simplicidade, possui seis cópias homólogas a thi1. A técnica de Recombinação Homóloga foi escolhida para gerar os mutantes thi1 de P. patens. Em cada mutante, uma das cópias de thi1 foi interrompida, substituindo sua região codificante por um cassete de gene de resistência. Mutantes individuais foram obtidos para as seis cópias do gene thi1. As linhagens knockouts foram capazes de sobreviver e crescer apenas com alguns pequenos efeitos em sua morfologia e fisiologia. A deleção de uma das cópias de thi1 (PpThi1.20F) afetou drasticamente a sobrevivência e regeneração dos protoplastos, sugerindo um papel deste cópia gênica no inicio da divisão e diferenciação celular. O desenho experimento utilizado para a geração destes mutantes permite a reciclagem dos cassetes de seleção, fornecendo uma plataforma para a construção de duplos, triplos, quádruplos, quíntuplos e sêxtuplos mutantes no futuro. Os mutantes individuais para cada cópia de thi1 gerados nesse trabalho, bem como os possíveis mutantes múltiplos, serão úteis para experimentos de complementação funcional e o discernimento de funções específicas de diferentes membros da família gênica thi1.

Thiazole biosynthetic protein (THI1) is involved in the synthesis of the thiazole ring, a thiamine (vitamin B1) component. Thiamine is an essential co-factor in several carbohydrate and amino acid metabolic pathways. Prokaryotes and a few eukaryotes, such as fungi and plants, are able to synthesize thiamine de novo. These organisms contain the genes that encode the corresponding enzymes (such as THI1) that perform this metabolic function. THI1 actually functions as a reagent rather than as a conventional catalytic enzyme, as the THI1 polypeptide itself serves as the sulfide donor for thiazole formation. This gene also plays a role in organelle DNA damage tolerance. Arabidopsis thaliana has only one copy of the thi1 gene (At-thi1). Transcripts derived from At-thi1 are targeted simultaneously to chloroplasts and mitochondria by differential usage of two in-frame initiation codons. The tz-201 A. thaliana thi1 mutant has been shown to accumulate more sucrose in its tissues than wild-type plants. This suggests that a better understanding of thi1 genes and the role they play in cellular sucrose accumulation may be relevant for improving commercially important crops such as sugarcane. Sugarcane (Saccharum spp.) is a C4 photosynthesis monocot. Unlike A. thaliana, sugarcane has at least two thi1 copies (sc-thi1.1 and sc-thi1.2), as do the other C4 grasses. This thesis concerns the molecular and functional analyses of sugarcane thi1 (sc-thi1) gene homologues. The identified alleles related to sc-thi1.2 have some differences in sequence and seems to be diverging into two subgroups (sc-thi1.2a and sc-thi1.2b), based on phylogenetic analyses. Expression analysis showed that each sc-thi1 copy is expressed differentially in individual tissues and in developing stages levels. Subcellular analysis showed that sc-thi1.1 and sc-thi1.2b have the same cellular distribution pattern, distinct from the observed for sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 and sc-thi1.2b were also able to partially complement thiamine auxotrophy in a yeast mutant deficient in thiamine biosynthesis. A similar complementation assay is not possible in the A. thaliana tz-201 mutant owing to low transformation efficiencies. Thus, Physcomitrella patens was chosen to generate thi1 mutant lines for future functional complementation studies. P. patens is a moss used as a plant model, with a small size, short life cycle and a haploid dominant phase. Despite its simplicity, it has six thi1 homologues copies. Homologous Recombination was used to generate P. patens thi1 mutants. In each case, a target thi1 gene was disrupted by replacing its coding region with an antibiotic resistance gene cassette. Single mutants were obtained for all six thi1 gene copies. All the knockout lines were able to survive and grow with only minor effects on morphology and physiology. Deletion of one of the thi1 gene copies (PpThi1.20F) drastically affected protoplast survival and regeneration, suggesting a role for this gene in early (polar) cell division and differentiation. The experimental design, which permits recycling of the selectable marker cassettes, provides a research platform for the construction of double, triple, quadruple or quintuple mutants in the future. The individual mutants line generated in this work, as well as the possible multiple mutants, will be useful for thi1 functional complementation experiments and for discerning the specific functions of individual thi1 gene family members. / THI1 (proteína da biossíntese de tiazol) está envolvida na síntese do anel de tiazol, um componente de tiamina (vitamina B1). A tiamina é um cofator essencial em várias vias metabólicas de carboidratos e aminoácidos. Somente procariontes e alguns eucariontes, como fungos e plantas, são capazes de sintetizar a tiamina de novo. A proteína THI1 atua mais como um reagente do que como uma enzima catalítica convencional, pois usa a si mesmo como doador de sulfeto para a formação do anel de tiazol. Este gene também está envolvido na tolerância ao dano no DNA das organelas. A. thaliana apresenta apenas uma cópia do gene thi1. Seu transcrito primário é direcionado simultaneamente aos cloroplastos e mitocôndrias através do uso diferencial de dois códons de iniciação, presentes no mesmo quadro aberto de leitura. Além disso, o mutante tz-201 de A. thaliana acumula mais sacarose em seus tecidos do que a planta selvagem. Isso sugere que um melhor entendimento do gene thi1 e seu papel no acúmulo de sacarose podem ser importantes para o melhoramento comercial de cultivares, como cana-de-açúcar. Cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma monocotiledônea de metabolismo fotossintético C4. Diferentemente do observado em A. thaliana, a cana-de-açúcar possui pelo menos duas cópias (sc-thi1.1 e sc-thi1.2) homólogas a thi1, como observado também para outras gramíneas C4. Nesta tese são discutidas análises moleculares e funcionais dos homólogos do gene thi1 (sc-thi1) de cana-de-açúcar. Os alelos identificados como relativos a sc-thi1.2 apresentam algumas diferenças em suas sequências e, baseado em análises filogenéticas, parecem estar divergindo em dois subgrupos (sc-thi1.2a e sc-thi1.2b). As análises de expressão mostraram que cada cópia de sc-thi1 é diferencialmente expressa em diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento. A análise de localização subcelular mostrou sc-thi1.1 e sc-thi1.2b apresentam o mesmo padrão de distribuição, distinto do observado para sc-thi1.2a. Sc-thi1.1 e sc-thi1.2b também foram capazes de complementar parcialmente a auxotrofia para tiamina em leveduras mutantes, deficientes na via de biossíntese de tiamina. Um teste similar de complementação funcional mutante tz-201 de A. thaliana não é possível no devido à baixa eficiência de transformação. Assim, Physcomitrella patens foi escolhida para gerar linhagens mutantes de thi1 para futuros estudos de complementação funcional. P. patens é um musgo usado como planta modelo, apresenta tamanho pequeno, um ciclo de vida curto e uma fase dominante haploide. Apesar de sua simplicidade, possui seis cópias homólogas a thi1. A técnica de Recombinação Homóloga foi escolhida para gerar os mutantes thi1 de P. patens. Em cada mutante, uma das cópias de thi1 foi interrompida, substituindo sua região codificante por um cassete de gene de resistência. Mutantes individuais foram obtidos para as seis cópias do gene thi1. As linhagens knockouts foram capazes de sobreviver e crescer apenas com alguns pequenos efeitos em sua morfologia e fisiologia. A deleção de uma das cópias de thi1 (PpThi1.20F) afetou drasticamente a sobrevivência e regeneração dos protoplastos, sugerindo um papel deste cópia gênica no inicio da divisão e diferenciação celular. O desenho experimento utilizado para a geração destes mutantes permite a reciclagem dos cassetes de seleção, fornecendo uma plataforma para a construção de duplos, triplos, quádruplos, quíntuplos e sêxtuplos mutantes no futuro. Os mutantes individuais para cada cópia de thi1 gerados nesse trabalho, bem como os possíveis mutantes múltiplos, serão úteis para experimentos de complementação funcional e o discernimento de funções específicas de diferentes membros da família gênica thi1.