京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13160号 / 論医博第2147号 / 新制||医||1029(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 杉田 昌彦, 教授 椛島 健治 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Central to the age-associated decrease in immune system function, characterised by the increase in the frequency and severity of infections and autoimmune diseases, is the decrease in production of naïve T cells by the thymus. This results from the targeted degeneration or involution of the thymus with age. One of the principal causes of involution is the loss of organisation and functionality of the thymic epithelium, which confers the primary function of the organ via interactive regulation of T cell development. Although the mechanisms that govern the deterioration of the thymic epithelium are poorly understood, a number of recent reports indicate that the transcription factor, Foxn1, is required to maintain this compartment in the postnatal thymus. Thus, the first aim of this study was to precisely profile Foxn1 expression levels in aging postnatal thymic epithelial cells. The second aim was to investigate the effects of upregulating Foxn1 in the aging thymus, which was achieved using a novel, regulatable Foxn1 mouse model generated during this study. In this study I show that Foxn1 is expressed at different levels in different postnatal thymic epithelial cell (TEC) sub-populations suggesting a dosage-dependent mode of action for Foxn1. Additionally, using two experimental approaches, I show that Foxn1 expression decreases with age in TECs, supporting the current data that implicate the loss of Foxn1 as a potential cause of thymus involution. Next, I generated a tissue-specific, regulatable Foxn1 mouse model that allowed me to modulate Foxn1 expression in the postnatal thymus. Firstly, using this model, I show that thymus involution can be prevented by the up-regulation and maintenance of Foxn1 expression from the onset of involution. Thymi that up-regulated Foxn1 were overtly larger and exhibited greater cellularity in both the thymocyte and epithelial compartments compared to age matched controls. Additionally, the larger TEC compartment contained a higher proportion of functional and proliferating TECs that upregulated a panel of genes involved in TEC development and function. Next, I show that Foxn1 up-regulation in aged, involuted thymi is sufficient to partially reverse involution, as shown by an increase in TEC organisation and intrathymic T cell numbers. While other strategies that promote thymic rebound or reversal have been reported, including cytokine treatment or sex steroid ablation, these approaches are complicated by side effects and toxicity. Hence, I propose a novel model for immune reconstitution through the regulation of Foxn1 expression in the postnatal thymus.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21636号 / 医博第4442号 / 新制||医||1034(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 杉田 昌彦, 教授 竹内 理 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Le thymus subit un vieillissement précoce, appelé involution thymique, qui cause une perte de fonction du thymus avec l’âge. À ce jour, les mécanismes de renouvellement des cellules épithéliales thymiques (TECs) sont encore mal compris, c’est pourquoi nous avons voulu identifier les cellules souches de l’épithélium thymique. Comme les cellules souches sont quiescentes dans plusieurs tissus, les objectifs de notre étude étaient de déterminer si l’épithélium thymique contenait des cellules quiescentes et d’étudier la cinétique de prolifération des TECs chez les souris jeunes et adultes. Pour ce faire, nous avons utilisé une souris transgénique (H2B-GFP Tet-On) nous permettant d’identifier les cellules ne se divisant pas sur une longue période de temps (LRC, label-retaining cells¬). Nous avons d’abord montré que les TECs proliféraient plus rapidement chez les femelles que les mâles. De plus, nous avons trouvé plusieurs différences entre l’épithélium thymique post-natal et adulte : (1) les TECs corticales (cTECs) et médullaires (mTECs) ont un taux de prolifération similaire chez les jeunes souris, mais chez l’adulte, les cTECs prolifèrent plus lentement que les mTECs; (2) les TECs prolifèrent plus rapidement chez les souris jeunes que adultes; (3) des LRC sont détectées chez l’adulte, mais pas chez les jeunes souris. Les LRC, retrouvées dans le compartiment cTEC, sous-expriment des gènes associés à la sénescence et surexpriment des gènes importants pour le développement et le renouvellement des TECs. Ces résultats montrent que ces cellules sont quiescentes et suggèrent qu’elles pourraient bel et bien être les progéniteurs thymiques responsables du renouvellement des TECs adultes. / The thymus undergoes a rapid degeneration with age termed thymic involution that causes a loss of function of the thymus with age. To this day, mechanisms of thymic maintenance are still unknown. This is why we aimed to identify thymic epithelial stem cells. Since stem cells are quiescent in many tissues in adults, our main objectives were to determine whether the thymic epithelium contains quiescent cells and study the proliferation kinetics of thymic epithelial cells in neonatal and adult mice. To this end, we used the transgenic mouse model H2B-GFP Tet-On, a label-retaining assay allowing us to identify cells that have not divided for a prolonged period of time, which are called label-retaining cells (LRC). First, we showed that in the adult thymus, females’ thymic epithelial cells (TECs) proliferated more actively than males’ TECs. We observed three main differences between neonatal and adult thymi: (1) cTECs and mTECs have similar proliferation rates in young, but mTECs cycled more actively in adult mice; (2) neonatal TECs have a higher turnover rate than adult’s TECs, and (3) we were able to detect LRC in adult mice, but not in neonatal mice. These LRC are contained in the cTEC compartment and express very low levels of senescence-associated proteins and show a high expression of genes important for thymic development and. These results show that the LRC identified in adult thymi are not senescent cells and therefore might represent the elusive thymic progenitor cells responsible for thymic maintenance and regeneration in adult mice.

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La vaccination est largement utilisée pour la génération de lymphocytes T spécifiques contre les tumeurs. Malheureusement, cette stratégie n'est pas adaptée aux personnes âgées car leur thymus régresse avec l'âge conduisant ainsi à une baisse dans la production de cellules T et à l'accumulation de cellules immunitaires âgées ayant des défauts liés à leurs stimulations. Comme il a été démontré auparavant que L’IL-21 est capable d’induire des fonctions thymiques, nous avons émis l’hypothèse que l’injection d’IL-21 à des souris âgées stimulera la thymopoïèse. Nos résultats montrent que l’administration de l’IL-21 augmente le nombre absolu de thymocytes chez les souris âgées et augmente la migration de ces cellules vers la périphérie ou ils contribuent à la diversité du TCR. De plus les cellules T en périphérie expriment un niveau plus élevé de miR181-a, et par conséquent moins de phosphatase comme SHP2, DUSP5/6 qui inhibent le TCR. En vaccinant des souris âgées avec le peptide Trp2, les souris traitées avec l’IL-21 montrent un retard dans la croissance des cellules B16 tumorales. Cette étude montre que l’IL-21 pourrait être utilisé comme stratégie pour le rétablissement du systeme immunitaire chez les personnes âgées. / Vaccines have been largely sought for the generation of protective tumor-specific T cells. Unfortunately however, this strategy is not suitable for the elderly as their thymus regresses with age leading to a decline in T-cell production and accumulation of aged lymphocytes endowed with stimulation-related defects. Interleukin (IL)-21 has been shown to display thymostimulatory properties. Therefore, we hypothesized that IL-21 administration to ageing host may boost T-cell production and restore a competent peripheral T-cell compartment. Our study shows that IL-21 injection to aged mice lead to an increase in the thymocytes absolute number and an increase in thymocytes egress to the periphery where they enhance the T-cell receptor (TCR) diversity. Furthermore T-cell in the periphery express higher level of miR-181a and thus less TCR-inhibiting phosphatases SHP-2 and DUSP5/6 enable them to be more responsive upon stimulation. Consequently, aged rIL-21-treated mice vaccinated using a tyrosinase-related protein 2 (Trp2)-derived peptide exhibited a substantial delay in B16 tumor growth and improved survival. The results of this study highlight the immunorestorative function of rIL-21 paving its use as a strategy for the re-establishment of effective immunity in the elderly.

Durant la grossesse, les défenses immunitaires maternelles sont considérablement réduites, ce qui augmente la vulnérabilité aux pathogènes. Cette modulation immunitaire est principalement due à l’involution aiguë du thymus, qui réduit la production de lymphocytes T essentiels à une réponse immunitaire efficace. L’involution thymique associée à la grossesse est un processus naturel et hautement conservé chez les vertébrés. Elle est cruciale pour augmenter la fertilité maternelle et la tolérance immunitaire au fœtus. Bien que sévère, cette involution est temporaire. La régénération thymique commence rapidement après l'accouchement, rétablissant ainsi rapidement la fonction thymique. Le rôle du thymus dans la sélection des lymphocytes T est principalement attribué aux cellules épithéliales thymiques (TECs). L’involution et la régénération thymique associées à la grossesse sont médiées par les TECs sous l’influence de la progestérone. La suppression des récepteurs de la progestérone exprimés par les TECs permet de prévenir l’involution thymique, mais elle altère également la fertilité. Ces éléments font de ce processus un modèle idéal pour étudier les régulateurs de la fonction et de l'homéostasie des TECs. Bien que des études antérieures aient identifié des acteurs clés dans la régénération thymique à l'aide de divers modèles d’involution, les mécanismes spécifiques à l’atrophie et à la régénération thymique liée à la grossesse restent encore mal compris. La première étude de cette thèse analyse les modifications transcriptomiques des TECs et la régulation de leur homéostasie pendant la régénération post-partum. Ces résultats ont révélé que l’involution thymique associée à la grossesse n’entraînait pas de perte de TECs, tandis que la régénération post-partum était principalement guidée par des changements transcriptomiques et phénotypiques dans les cTECs. De plus, cette étude a mis en évidence le rôle central du facteur de transcription FOXN1 dans la régulation de la fonction thymique durant la régénération. Dans l’objectif d’identifier les facteurs de transcription régulant l’homéostasie des TECs pendant la grossesse, la seconde étude présente le rôle protecteur de KLF4 pour l’intégrité thymique. La suppression spécifique de Klf4 dans les TECs a montré un impact négatif sur la cellularité thymique pendant la grossesse, entraînant une survie réduite des cTECs et l’acquisition de caractéristiques mésenchymateuses. Cette involution exacerbée a des répercussions durables sur la régénération thymique post-partum, soulignant ainsi le rôle critique de Klf4 dans le maintien de l'intégrité des cTECs pendant la grossesse. Enfin, la dernière étude, basée sur des études transcriptomiques et épigénétiques, révèle que KLF4 protège les cTECs en activant la réponse au stress, dont l'autophagie, tout en diminuant l’inflammation, l'apoptose et la transition épithélio-mésenchymateuse. De plus, nous avons développé une technique qui permet, pour la première fois, d’analyser des interactions ADN-protéine dans des TECs primaires isolées de thymus. Ces travaux apportent une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la régulation de la fonction thymique pendant et après la grossesse. La découverte du rôle protecteur de l’intégrité des cTECs par KLF4 ouvre une voie prometteuse pour prévenir ou ralentir l’involution thymique liée à l’âge. En effet, le vieillissement du thymus précède celui des autres organes, rendant les personnes âgées plus à risque d'infections, de cancer et d'une efficacité vaccinale réduite. / During pregnancy, maternal immune defenses are significantly reduced, increasing susceptibility to pathogens. This immune modulation is primarily due to acute thymic involution, which reduces the production of T lymphocytes essential for an effective immune response. Pregnancy-associated thymic involution is a natural and highly conserved process among vertebrates. It is critical for enhancing maternal fertility and fetal immune tolerance. Although severe, this involution is transient. Thymic regeneration begins immediately after birth, rapidly restoring thymic function. The role of the thymus in T lymphocyte selection is primarily attributed to thymic epithelial cells (TECs). Thymic involution and regeneration associated with pregnancy are mediated by TECs under the influence of progesterone. Suppression of progesterone receptors expressed by TECs prevents thymic involution but also impairs fertility. These aspects make this process an ideal model to study the regulators of TEC function and homeostasis. While previous studies have identified key factors in thymic regeneration using different models of involution, the specific mechanisms of thymic atrophy and regeneration associated with pregnancy remain poorly understood. The first study presented in this thesis analyzes the transcriptomic changes in TECs and the regulation of their homeostasis during postpartum regeneration. These results showed that pregnancy-associated thymic involution does not lead to TEC loss, while postpartum regeneration is mainly controlled by transcriptomic and phenotypic changes in cortical TECs (cTECs). In addition, this study highlights the central role of the transcription factor FOXN1 in regulating thymic function during regeneration. To identify the transcription factors that regulate TEC homeostasis during pregnancy, the second study presents the protective role of KLF4 for thymic integrity. Specific deletion of Klf4 in TECs showed a negative impact on thymic cellularity during pregnancy, leading to reduced cTEC survival and acquisition of mesenchymal characteristics. This exacerbated involution has lasting effects on postpartum thymic regeneration, underscoring the critical role of Klf4 in maintaining cTEC integrity during pregnancy. Finally, the last study, based on transcriptomic and epigenetic analyses, shows that KLF4 protects cTECs by activating the stress response, including autophagy, while reducing inflammation, apoptosis and epithelial-to-mesenchymal transition. In addition, we have developed a technique that allows, for the first time, the analysis of DNA-protein interactions in primary thymic TECs. These findings provide a better understanding of the cellular and molecular mechanisms regulating thymic function during and after pregnancy. The discovery of KLF4’s protective role in maintaining cTEC integrity opens promising avenues for preventing or slowing age-related thymic involution. Indeed, thymic aging precedes that of other organs, making older individuals more susceptible to infections, cancer, and reduced vaccine efficacy.