The effect of triiodothyronine (L-T₃) on the protein, RNA and DNA fractions of the thymus nuclei of growth-arrested sulfaguanidine-fed rats has been studied. A single dose of 15 µg of L-T₃ stimulated the incorporation of ¹⁴C-labelled amino acids into total nuclear protein, whole histone and histone fractions. The incorporation of the labelled amino acid into nuclear protein was increased 40 percent over the control 4 hours after the administration of L-T₃. The incorporation of alanine-1-¹⁴C into the total histone fraction reached a maximum 4 hours after the administration of L-T₃ and then decreased 8 and 16 hours after the administration of L-T₃. The incorporation of alanine-1-¹⁴C into histone fraction f₁ reached a maximum at 4 hours after the administration of L-T₃ while the incorporation into fractions f_2a, f_2b and f₃ did not reach a maximum until 8 hours after the administration of L-T₃. Time course studies showed that the protein and RNA moieties of thymus chromatin of rats injected with a single dose of L-T₃ was increased to a maximum at 4 hours. The T_m of chromatin was increased 2° by L-T₃ administration as early as 2 hours. However, the T_m of DNA was not affected. Four hours after the administration of L-T₃ the template efficiency increased 171 percent. The template efficiency of DNA was not affected by L-T₃. These results demonstrate that thyroid hormones modify the chromatin in such a way that the template efficiency is increased. An hypothesis for the mechanism of thyroid hormone action was presented. / Ph. D.

Octylphenol and genistein are two of the growing list of endocrine disrupting chemicals found in the environment that mimic estrogen in reproductive tissue both in vitro and in vivo. It is well established that endogenous estrogens modulate not only the reproductive system, but also the immune system. However, the effects of many endocrine disrupting chemicals, such as octylphenol and genistein, on the immune system have yet to be determined. Preliminary studies on short-term treatment with genistein (0.6 mg) and octylphenol (10 mg) showed that the thymus of orchiectomized (NZBxNZW)F1 males is sensitive to these agents. Further studies focused on the effects of short-term treatment of octylphenol on the morphology and function of the thymus in adult, reproductively intact non-autoimmune C57BL/6 and pre-autoimmune (NZBxNZW)F1 males. Oral dosing of 0.1 mg, 1 mg, or 10 mg of octylphenol 3 times a week for 3 weeks did not affect the morphology or function of the thymus as assessed by its weight, thymocyte cellularity, proportion of immature and mature thymocytes, level of apoptosis, apoptotic rates of stimulated thymocytes, and proportion of mature T cells in the spleen. Furthermore, oral dosing of 0.1 mg, 1 mg, or 10 mg of octylphenol did not result in estrogenic changes in the reproductive tract in our model. Subcutaneous injection of 10 mg of octylphenol resulted in skin lesions that confounded the assessment of its affects on the thymus. Further studies are needed to definitively determine the effects of octylphenol on the immune system of both males and females of various ages and to determine the effect of long-term exposure. / Master of Science

Les précurseurs des lymphocytes T appelés thymocytes se développent dans le thymus, un organe lymphoïde primaire, via différents processus de sélections aboutissant à l’élimination par apoptose de ceux qui sont inutiles ou dangereux (autoréactifs). Le développement des thymocytes nécessite de nombreuses molécules comme les cytokines et les chimiokines. Bien que le rôle des médiateurs lipidiques dans l’immunité soit bien décrit, leur rôle dans la maturation des thymocytes l’est peu. Nous avons étudié le rôle de la phospholipase A2 cytosolique du groupe IVA (cPLA2α), une enzyme clé pour la biosynthèse des médiateurs lipidiques, dans le développement des thymocytes. En utilisant des approches génétiques (délétion de la cPLA2α) et pharmacologiques (utilisation d’un inhibiteur de la cPLA2α, la pyrrophénone) nous montrons que la maturation des thymocytes se déroule indépendamment de la cPLA2α suggérant que la plupart des produits dérivés de l’acide arachidonique ne sont pas nécessaires au développement des thymocytes. Au cours des processus de sélections dans le thymus, environ 98% des thymocytes sont éliminés par apoptose. Des études ont montré que le lysophosphatidylcholine, obtenu suite au clivage d’un phospholipide membranaire par une phospholipase A2, permet une élimination efficace des cellules apoptotiques. Nous avons étudié le rôle des phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) IIA, V et X dans l’élimination des thymocytes apoptotiques. Ces enzymes sont exprimées dans le thymus mais leur fonction est pour le moment inconnue. Nous montrons in vitro que toutes les sPLA2 testées, excepté la IIA humaine, éliminent les thymocytes apoptotiques et que ceci est dépendant de leur activité enzymatique. De nombreuses études ont émis l’hypothèse que les sPLA2 peuvent affecter la détection et la quantification des microparticules (MPs) formées suite à l’activation cellulaire ou l’apoptose. Nous observons que les sPLA2 V et X humaines éliminent partiellement les MPs de thymocytes apoptotiques humains (il y a une grande quantité de thymocytes apoptotiques dans le thymus) mais pas celles de d’autres origines cellulaires. Nous montrons également que certaines sPLA2 affectent la détection et la quantification des MPs selon l’espèce étudiée, l’origine cellulaire des MPs et le moyen de détection employé. Finalement l’impact de ces enzymes est dépendant de leur activité enzymatique. / T cell precursors called thymocytes develop in the thymus, a primary lymphoid organ, by different selection processes that eliminate by apoptosis useless or dangerous (auto reactive) thymocytes. Numerous molecules such as cytokines and chemokines are needed for thymocyte development. While the roles of eicosanoids in immunity are described their role in thymocyte maturation remains uncertain. We have studied the role of the cytosolic phospholipase A2 of group IVA (cPLA2α), a key enzyme in lipid mediator biosynthesis, in thymocyte development. Using genetic (deletion of cPLA2α) and pharmacological approaches (using an inhibitor, pyrrophenone) we demonstrate that thymocyte maturation occurs independently of cPLA2α suggesting that most arachidonic acid metabolites are dispensable in thymocyte development. During selection processes occurring in the thymus, around 98% of thymocytes are eliminated by apoptosis. Studies demonstrated that the lysophosphatidylcholine, produced by phospholipase A2 hydrolysis of membrane phospholipids, induces an efficient elimination of apoptotic cells. We investigated the role of secreted phospholipase A2 (sPLA2) IIA, V and X in the clearance of apoptotic thymocytes. These enzymes are expressed in the thymus but their functions in this organ are currently unknown. In vitro, we demonstrated that all sPLA2 tested, except the human IIA, eliminate apoptotic thymocytes and that their enzymatic activity is required. Several studies have hypothesized that the sPLA2 could affect the detection and quantification of microparticles (MPs) produced during cell activation or apoptosis. We demonstrated that human sPLA2 V and X eliminate partially apoptotic thymocyte (there are many apoptotic thymocytes in thymus) MPs but not the MPs of other cellular origins. We also observed that certain sPLA2 enzymes impair the quantification of microparticles, depending on the species studied, the cellular source of microparticles and the means of detection employed. Finally, the sPLA2 impact on MPs is dependent on their enzymatic activity.

No description available.

The development of T cells in the thymus is a tightly regulated process. Any defect in thymic differentiation could result in autoimmune disorders, inability to ward off infections or neoplasm. Early thymocyte development requires signals mediated through the preTCR complex by the associated CD3 chains (gamma, delta, epsilon, and zeta). Research conducted towards this project has revealed that signaling modules within the intracytoplasmic domain of CD3epsilon is absolutely required for this process. Interestingly, our results emphasized the importance of the proline-rich sequence motif in preTCR mediated signaling events, such as the proliferation of double negative thymocytes and the regulation of TCR surface expression on double positive thymocytes in a stage-specific manner. The outcomes of this project may provide a better understanding of the mechanism of preTCR-mediated thymocyte differentiation and the role of CD3 chains in these processes.

No description available.

Il est connu que les lymphocytes B (LB) ont un rôle pathogène dans de nombreuses maladies auto-immunes. Afin de comprendre comment la perte de tolérance B survient dans le lupus érythémateux systémique, maladie auto-immune prototypique, nous avons tout d’abord développé, dans un modèle murin, une méthode de marquage des LB pathogènes en cytométrie en flux. D’autre part, nous avons trouvé qu’un défaut de réponse au TLR9 est une caractéristique unique des LB de patients lupiques et est associée à une diminution d’expression du complexe CD19/CD21 à la surface des LB. Ces anomalies pourraient favoriser la survie des LB autoréactifs, et permettre la survenue de troubles auto-immuns. Dans un second temps nous avons exploré les fonctions d’une population lymphocytaire B méconnue: les LB thymiques humains. Nos résultats appuient le rôle tolérogène de ces LB, avec notamment l’expression, par 5% d’entre eux, de la protéine AIRE (AutoImmune REgulator), qui joue un rôle majeur dans la sélection négative des lymphocytes T. L’ensemble de ces données montrent la dichotomie fonctionnelle des LB et nous rappelle la complexité des processus régissant la tolérance et son maintien. / It is well known that B cells play pathogenic roles in a variety of autoimmune diseases. In order to understand how B tolerance breakdown occurs during systemic lupus erythematosus (SLE), a prototypical autoimmune disease, we first developed a method to identify autoreactive B cells by flow cytometry in a mouse model. In addition we found that a defective in vitro response to TLR9 agonists is a specific feature of SLE B cells and is associated with a CD19/CD21 complex downregulation. These abnormal functions in SLE B cells may contribute to B cell tolerance breakdown in these patients. But B-cell involvement in autoimmune diseases should not lead us to forget the functional diversity of B cells. This prompted us, in a second project, to analyze the tolerogenic role of a B cell population considered as simple bystanders of thymopoiesis: the human thymic B cells. Our results support the tolerogenic role of thymic B cells, as 5% of them express AIRE (AutoImmune REgulator), which plays a major role in cells in T cells negative selection. All these data underline the functional dichotomy of B cells and remind us the complexity of the processes governing tolerance and its maintenance.

Abstract not available

Thesis (Ph. D.)--University of Missouri--Columbia, 2003. / Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 146-172). Also available on the Internet.

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) assurent la génération de toutes les lignées sanguines. Leur différenciation en cellules T matures se déroule dans un microenvironnement spécialisé, le thymus, orchestrée par des interactions complexes entre cytokines, chimiokines et cellules stromales. Les mutations bloquant la différenciation des cellules T ont un impact sur l'architecture du thymus, soulignant l’importance des interactions entre cellules T en développement et cellules stromales thymiques.Les déficits immunitaires combinés sévères sont généralement traités, avec succès, par transplantation de CSH allogénique par voie intraveineuse. Cependant, des complications peuvent survenir notamment en cas de greffe non compatible. Pour pallier à cela, la thérapie génique a été développée mais son efficacité et son innocuité restent à améliorer. Dans ce but, notre groupe a développé une approche par correction génique des progéniteurs T directement in vivo, via un vecteur lentiviral. Bien qu’efficace, là encore, l’efficacité de traitement reste insuffisante voire extrêmement limitée chez les macaques.Lors de ma thèse, j'ai donc évalué le potentiel de différents sérotypes de vecteur viraux adéno-associés (AAV) pour la transduction des thymocytes. L'administration IT de plusieurs sérotypes de AAV2 engendre une transduction des thymocytes >10 fois plus élevée que celle des vecteurs lentiviraux. Le sérotype AAV2/8 induit la transduction des thymocytes la plus efficace et les cellules transduites représentent jusqu'à 1% des cellules T périphériques d’une souris immunocompétente. En utilisant des souris immunodéficientes ZAP-70-/- comme paradigme, j'ai découvert que l'injection IT de l’AAV2/8-ZAP-70 entraîne une transduction et différentiation lymphocytaire T rapide, associée à la génération d’une medulla thymique. En effet, des cellules épithéliales thymiques de la médulla (mTEC) exprimant le régulateur auto-immun AIRE sont détectées en <2 semaines. Bien que cette reconstitution soit transitoire, les mTECs AIRE+ diminuant 10 semaines post-injection, les cellules T périphériques corrigées persistent >40 semaines et présentent environ 1 copie du vecteur AAV/cellule. Ces cellules T effectrices peuvent sécréter des niveaux élevés de cytokines et un nombre important de cellules T régulatrices est également généré. Ainsi, une seule vague de thymopoïèse à partir de progéniteurs transduits par l’AAV-ZAP-70, permet une restauration, rapide et transitoire de l'architecture thymique mais, à long terme de cellules T périphériques fonctionnelles.Pour évaluer les diverses populations de TEC régissant le développement et la sélection des cellules T, j'ai collaboré avec les groupes de P Jay/J Abramson/I Amit pour établir une cartographie de novo du compartiment stromal thymique. Nos analyses ont mis en évidence quatre populations majeures de mTEC (I-IV) avec des fonctions distinctes. Notamment, les mTEC-IV constituent une population unique présentant des similarités moléculaires et morphologiques avec les cellules tuft intestinales. Comme nous avions précédemment identifié la sécrétion d'IL-25 par les cellules tufts comme un régulateur des interactions entre compartiment épithélial et hématopoïétique dans l'intestin, nous avons évalué ce potentiel dans le thymus. Ainsi, des souris déficientes en cellules tuft intestinales présentent également une déficience spécifique en mTEC-IV et une homéostasie perturbée de diverses populations exprimant l'IL-25R dans le thymus. Notre recherche a donc permis d'identifier une nouvelle population de TEC tuft avec un rôle critique dans la formation de la niche immunitaire du thymus.L’ensemble de mes résultats montrent le potentiel thérapeutique de stratégie intrathymique de thérapie génique pour des patients ayant besoin d’une reconstitution rapide en cellules T et fournissent de nouvelles perspectives sur les populations stromales thymique et leur rôle dans l’équilibre de la niche immunitaire. / Hematopoietic stem cells (HSC) ensure the generation of all blood lineages. Their differentiation to mature T lymphocytes occurs in the specialized microenvironment of the thymus, orchestrated by complex interactions between cytokines, chemokines, and stromal cells. Mutations resulting in a block in T cell differentiation impact on the architecture of the thymus, pointing to the critical crosstalk between developing T cells and thymic stromal components.Genetic severe combined immunodeficiencies (SCID) are generally treated by the intravenous transplantation of healthy allogeneic HSCs. Although this therapy is often successful, complications can occur, especially for patients receiving non-histocompatible HSC transplants. To circumvent these problems , significant efforts have gone into developing gene therapy strategies but adverse events indicate the necessity of exploring other avenues. Our group hypothesized that in situ gene correction of T lymphoid progenitors in the thymus itself may overcome some of the drawbacks of ex vivo gene therapy. While intrathymic (IT) lentiviral vector administration corrected immunodeficient thymocyte precursors in mice, thymus transduction was inefficient and efficacy in macaques was limited.During my PhD, I assessed the in vivo potential of adeno-associated vectors (AAV) to transduce thymocyte precursors. Intrathymic administration of several different scAAV2 serotypes resulted in a >10-fold higher transduction of thymocytes (3-5%) as compared to lentiviral vectors. scAAV2/8 promoted the highest level of gene transfer and strikingly, transduced cells represented up to 1% of peripheral T lymphocytes in immunocompetent mice. Using ZAP-70-/- immunodeficient mice as a paradigm, I found that IT injection of an AAV2/8-ZAP-70 vector resulted in a rapid transduction and T cell differentiation, correlating with a dramatic generation of the thymus medulla. Indeed, medullary thymic epithelial cells (mTEC) expressing the AIRE autoimmune regulator were detected within <2 weeks. While this reconstitution was transient––AIRE+ mTECs decreased by 10 weeks post gene transfer––gene-corrected peripheral T cells, harboring approximately 1 AAV genome/ cell, persisted for >40 weeks. Effector T cells had the potential to secrete high levels of cytokines and significant numbers of gene-corrected regulatory T cells were also generated. Thus, a single wave of thymopoiesis, from intrathymic AAV-ZAP-70-transduced progenitors, allows for a rapid but transient restoration of the thymic architecture and long-term peripheral T cell function.To better assess the diverse TEC populations that orchestrate T cell development and selection, I collaborated with the groups of P. Jay/J. Abramson/I. Amit to combine single cell analysis and in-vivo fate-mapping to de novo characterize the entire stromal compartment of the thymus. Our analyses highlighted four major medullary TEC (mTEC I-IV) populations with distinct lineage regulator function and specifically, we found that mTEC-IV constitutes a highly divergent TEC subset that bears strong molecular and morphological characteristics to intestinal tuft cells. As we previously identified tuft cell secretion of IL-25 as a regulator of the crosstalk between the epithelial and hematopoietic compartments in the gut, we assessed the potential immune-modulatory function of mTEC-IV. Notably, mice deficient in intestinal tuft cells exhibited a specific depletion of mTEC-IV and a perturbed homeostasis of various IL25-R-expressing populations in the thymus. Taken together, our data identify a new tuft TEC population critical for shaping the thymus immune niche.In conclusion, the data generated during my PhD advance the therapeutic potential of intrathymic-based vector strategies for the treatment of patients requiring a rapid T cell reconstitution and provide new insights into thymic stromal subsets that are critical for shaping the thymus immune niche.