O sistema linfoide é composto de órgãos linfoides primários e secundários. O timo é um órgão linfoide primário responsável pela maturação, diferenciação e seleção da linhagem linfocitária do tipo T que é responsavel pela imunidade celular do individuo. Para cumprir estas funções, o timo possui uma disposição peculiar das suas células epiteliais morfologicamente distintas e de suas estruturas vasculares. Seus vasos sanguíneos possuem um papel na oxigenação tecidual e no processo de migração das células precursoras de linfócitos T para o interior do parênquima tímico e por isso apresentam uma arquitetura típica caracterizada por vasos de grande calibre, localizados na junção cortico-medular e uma fina rede de ramos e anastomoses que se estendem para o córtex. Este processo de estruturação e arquitetura vascular ainda possui sua base molecular desconhecida, assim como os mecanismos que provocam a involução do órgão. O VEGF é um fator angiogênico que atua na formação vascular e na modulação de funções relacionadas à vascularização, sendo um importante marcador da angiogênese. A fim de se melhor compreender o comportamento vascular na formação e involução tímica, propôs-se avaliar a expressão gênica e proteica deste fator durante fases de desenvolvimento e involução do órgão, além da quantificação da vascularização do timo pela técnica estereológica, análise do parênquima tímico pela técnica de microscopia eletrônica de varredura e análise dos tipos celulares presentes em cada estágio etário. Para tal utilizou-se amostras de timo de gato em quatro estágios de desenvolvimento fetal (35, 45, 55, 65), e dois estágios pós-natal (6 meses e 1 ano) para a realização da imuno-histoquímica, PCR em tempo real e MEV,e para a técnica estereológica 2 estágios pós-natal (6 meses e 1 ano). Na microscopia eletrônica de varredura foram observados os timócitos de diferentes tamanhos, em estágios de maturação distintos. As proteinas do VEGF-A e dos receptores Fit-1 e KDR foram identificadas no timo de gatos em todas as fases do desenvolvimento foram localizadas no citoplasma de células epiteliais e no interior dos corpúsculos tímicos. A expressão do mRNA no período de 1 ano de idade a expressão do mRNA do VEGF e seus receptores tem um aumento significativo, coincidindo com a diminuição do Nvasc e do Nv(vasc) podendo causar um estado de hipóxia no órgão levando a um aumento compensatório de sistema VEGF. A curva de crescimento vascular obedece a um padrão de desenvolvimento e involuçãio do órgão. / The lymphoid system is composed by primary and secondary lymphoid organs. The thymus is a primary lymphoid organ responsible for maturation, differentiation and selection of the lymphoid T cell lineage that is responsible for cellular immunity. To accomplish these functions has a peculiar arrangement with morphologically distinct epithelial cells and vascular structures. The blood vessels have a role in tissue oxygentation and the migration of T cells into the thymic parenchyma, therefore they presents large vessels in cortico-medullary junction and a fine network branches to the cortex. This process has its molecular basis unknown as well as the involution process of the thymus. VEGF is an angiogenic factor that plays a role in the formation and modulation of vascular functions, being an important marker of angiogenesis. We proposed to evaluate the gene and protein of VEGF during the thymus development and involution, stereological quantification and scanning electronic microscopy. Samples of cat´s thymus from 35, 45, 55, 65 days of development and 6 months and 1 year of age. In scanning electronic microscopy different stages maturation thymocytes were observed. Protein expression of VEGF and its receptors were identified in all development stages in epithelial cells, endothelial cells and thymic corpuscles. The VEGF mRNA expression and its receptors in 1 year old animals was significantly increased, coinciding with the decreasing Nvasc and the Nv(vasc) causing a hypoxic condition in the thymus resulting in a compensatory increase of VEGF system. The vascular growth curve follows a pattern of development and involution of the organ.

Verificou-se o metabolismo e as repercussões morfológicas no timo de forma qualitativa e quantitativa através de morfometria e estereologia.Utilizaram-se 30 ratos wistar () nos grupos Nutrido (N=10), Desnutrido (D=10) e Renutrido (R=10). O peso corporal e a ingestão foi maior no N, menor no D, e os R apresentaram valores médios em relação a estes grupos. Todos os outros parâmetros (ingestão de água, excreção de fezes e urina, %ingestão/peso corporal, %fezes/ingestão, água/peso corporal, %urina/água consumida e peso tímico) não obtiveram diferença estatística entre o N e R. O grupo D mostrou exuberante alteração nos componentes elásticos e fibrosos, menor calibre dos seus vasos, atrofia dos lóbulos tímicos (com limite córtex-medular muitas vezes indefinido), e grande quantidade de timócitos em apoptose no córtex e na medula. Poucos corpúsculos tímicos foram verificados no grupo D, diferindo dos animais N e R. Deste modo, afirma-se que os animais R conseguiram restituir a morfologia da glândula após intervenção nutricional. / The Metabolism and morphologic repercussions on thymus were verified in a qualitative and quantitative way by morfometric and stereologycal assessment. 30 wistar rats were used () in the Nourishment (N=10), Undernourishment (UN=10) and Re-nourishment (RN=10) groups. The body weight and ingestion were higher in N, lower in UN, and RN presented medium values in relation to the others groups. All the addicional parameters as water ingestion, faeces and urine excrecion, %ingestion/corporal weigh, %faeces/ingestion, water/corporal weight, %urine/water consumed and thymic weight, had no statistics difference between N and RN. The UN group showed exuberant modification on elastic and fibrous components, smaller caliber of their vessels, thymic lobule atrophy (with many times indefinite cortex-medular limit), and apoptose of timocytes in the cortex and medulla. Few thymic corpuscles were verified in UN group differing of the N and RN. Therefore, after nutricional intervencional, the gland morphology was reestablished.

Descrições morfológicas são os primeiros passos para compreender a fisiologia dos organismos e seus sistemas. A biologia do desenvolvimento e a ontogenia da hematopoese de serpentes são pouco conhecidas, sendo a hematopoese embrionária inteiramente desconhecida. Os principais objetivos deste trabalho foram caracterizar o desenvolvimento e a hematopoese embrionária da serpente falsa-coral Oxyrhopus guibei (Dipsadidae: Xenodontinae) a partir da oviposição, através da análise de caracteres morfológicos externos para a classificação dos estágios de desenvolvimento embrionário, de 30 embriões com 1-3, 15, 25, 30, 45, 65 e ~75 dias de ovipostura (d.o.) (quando eclodem), e de cortes histológicos de 29 ovos (ou embriões) de 1-3, 15, 25, 30, 45, 60d.o. e de filhotes do dia da eclosão e com uma semana de nascimento para a caracterização da hematopoese embrionária. Os embriões de 1-3d.o. foram classificados entre os estágios (st.) 17 e 23, com ausência da formação ocular até a presença de olhos sem pigmentação; de 15d.o. no st. 26, com olhos pigmentados e ductos endolinfáticos calcificados; de 25d.o. no st. 31, com escamas no corpo não pigmentado e a musculatura dos flancos não fusionada na linha mediana ventral; de 30d.o. entre os st. 31 e 33, que em adição à formação descrita no período anterior, apresentam membrana palpebral completa e musculatura fusionadas na linha mediana ventral na região pré-cardíaca; de 45d.o. entre os st.34 e 36, com musculatura completamente fusionada na linha mediana ventral e começando a desenvolver um padrão de pigmentação; de 65d.o. no st. 37 (último da tabela) com o padrão de pigmentação bem desenvolvido de coral em tríades, típico da espécie, e com o dente do ovo, e com ~75d.o. os ovos eclodiram com filhotes sadios, que apresentam cicatriz umbilical e o dente do ovo permanece presente até dois dias após a eclosão. A hematopoese em ovos de 1-3 e 15d.o. foi caracterizadas como hematopoese extraembrionária, ocorrendo nos vasos das membranas extraembrionárias e na fenda vitelínica, e hematopoese intraembrionária, na região AGM (aorta gonadal mesonéfrons), principalmente no interior da artéria aorta dorsal, que continua como local hematopoético embrionário até no período de 30d.o., porém com estruturas mais diferenciadas; com 45d.o. o principal local hematopoético passa a ser medula óssea, com foco hematopoético de multi-linhagem sanguínea a partir de 60d.o., nos seios vertebrais e medula costal, constituindo o local hematopoético definitivo. Foi observada a atividade hematopoética junto ao tecido renal, com o desenvolvimento da região AGM, entre os períodos de 15 a 30d.o., o timo e baço apresentam diferenciação linfocítica, observados a partir de 30 e 45d.o., respectivamente e o fígado não apresenta hematopoese embrionária. Esta é a primeira descrição do desenvolvimento embrionário de uma serpente Caenophidia ovípara e da hematopoese embrionária de Serpentes, contribuindo para o conhecimento da fisilogia destes processos e indicando a necessidade de estudos tanto para um melhor entendimento do desenvolvimento embrionário, quanto para a compreensão da ontogenia da hematopoese das serpentes. / Morphological descriptions are the first steps to understand the physiology of organisms and their systems. Developmental biology and ontogeny of hematopoiesis of snakes are poorly known, and the embryonic hematopoiesis is completely unknown. The main goals of this study were to characterize the embryonic and hematopoiesis development of the false coral snake Oxyrhopus guibei (Dipsadidae: Xenodontinae) since oviposition. Analysis of external morphological characters regarding the classification developmental stages for developmental stages classification has been made for 30 embryos with 1 -3, 15, 25, 30, 45, 65 and ~ 75 days after oviposition days (o.d.) (when hatched), and histological sections of 29 eggs (or embryos) from 1-3, 15, 25, 30, 45, 60o.d. and one day neonates and one week after birth for the characterization of embryonic hematopoiesis. The embryos with 1-3o.d. were ranked between 17 and 23 stages (st.), with the absence of eye formation to the presence of unpigmented eyes; with 15o.d. in 26 st., with pigmented eyes and calcified endolymphatic duct; with 25o.d. in 31 st., with unpigmented body scales and muscles of the flanks not fused in the midline, with 30o.d. between 31 and 33 st., which in addition to the preceeding form, have full eyelid membrane and muscles fused at midline in the pre-cardiac region; with 45d.o. between 34 and 36 st., with muscles completely fused in the midline and beginning the development of pigmentation pattern, with 65o.d. in 37 st. (last stage of table) with the distinctive pigmentation tricolor-triad pattern , and the egg tooth, and ~ 75 d.o. health newborns have hatched, exhibiting the umbilical scar and the egg tooth up to two days after hatching. The hematopoiesis in eggs of 1-3 and 15o.d. was characterized as extraembryonic hematopoiesis, occurring in the vessels of extraembryonic membranes and in yolk clef, and intraembryonic hematopoiesis, in the AGM (gonad mesonefron aorta), mainly within the dorsal aorta, which continues as the embryonic hematopoietic site until the 30o.d., although with better differentiated structures; wth 45o.d. the bone marrow turns the main hematopoietic site, and with a hematopoietic focus of multi-lineage blood beginning in the 60d.o. at vertebral sinus and the ribs marrow, consisting the definitive hematopoietic sites. Hematopoietic activity was observed with the kidney tissue, through development of the AGM region, between the periods of 15 to 30d.o., thymus and spleen lymphocyte differentiation have been observed at 30 . and 45o.d., respectively, and the liver does not displays embryonic hematopoiesis. This is the first description of embryonic development of an oviparous Caenophidia snake and of the embryonic hematopoiesis in Serpentes, contributing to the knowledge the physiology of these processes and demonstrating the need of further studies for a better understanding of both embryonic development and the ontogeny snake.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de fatores de crescimento responsáveis pelo processo vasculogênico durante o desenvolvimento e involução do timo em cães. Para este propósito, timos de fetos de cães (30, 40 50 e 60 dias de desenvolvimento), cães jovens (6 meses de idade) e cães adultos (1 ano de idade) foram coletados. Os tecidos foram analisados estereológicamente e submetidos à imunohistoquímica, PCR tempo real e western blot para os componentes do sistema VEGF (VEGF-A, VEGF-C, Flt-1, KDR e Flt-4) e endocrine gland-derived (EG)-VEGF. Pela estereologia, observamos um aumento no número dos vasos durante o desenvolvimento do órgão e uma diminuição durante a involução (p<0.05). Todos os componentes do sistema VEGF e do EG-VEGF foram detectados em todos os estágios durante o desenvolvimento e involução. As proteínas correspondentes foram localizadas nas células endoteliais e células epiteliais da região cortical e medular, sendo que o EG-VEGF foi observado apenas nas células epiteliais da região medular. A expressão do RNAm do sistema VEGF e do EG-VEGF apresentou um perfil tempo-dependente durante o desenvolvimento e involução. O sistema VEGF apresentou uma expressão constante durante o desenvolvimento e um aumento progressivo durante a involução, com exceção do KDR que se mostrou crescente durante todo o período de desenvolvimento e involução e do VEGF-C que apresentou alta expressão durante a involução. A expressão do RNAm do EG-VEGF foi crescente durante as fases estudadas, já a expressão da sua proteína foi alta no início do desenvolvimento do timo e diminui na involução, onde permanece praticamente constante durante todo o período. Nossos resultados sugerem que o sistema VEGF e o EG-VEGF possuem atividades biológicas similares nas glândulas endócrinas e diferentes papéis durante o desenvolvimento e involução, o qual pode ser especificado em estudos futuros. Possíveis funções incluem um efeito modulatório na vasculogênese tímica e microambiente, influenciando na diferenciação e proliferação de timócitos, maturação de células T, interação célula-célula e secreção de hormônios tímicos. / The aim this study was therefore to evaluate the expression of growth factors responsible for the vasculogenic process throughout development and initial involution of the canine thymus. For that purpose, thymuses from fetuses (30, 40, 50 and 60 days), juvenile (6 months) and adult (1 year) dogs were collected. The tissues were examined stereologically and subjected to immunohistochemistry, Real Time PCR and western blot for components of the VEGF-system (VEGF-A, VEGF-C, Flt-1, KDR and Flt-4) and endocrine gland-derived (EG)-VEGF. By means of stereology, the total number of blood vessels increased during development and decreased during involution. These changes were statistically significant (p<0.05). All components of the VEGF-system and EG-VEGF were detected in all stages during development and involution. The corresponding proteins were localized in endothelial and epithelial cells of cortical and medullar regions, and EG-VEGF was detected only in epithelial cells of medular region. The VEGF-system and EG-VEGF protein and mRNA expression showed a specific time-dependent profile during development and involution. The VEGF system showed a constant expression during development and a progressive increase during involution, except KDR that showed increased during all development and involution and VEGF-C that showed high expression during involution. The EG-VEGF RNAm expression was increased during development and involution, but protein expression was high in early thymus development and decreased in involution, and remains constant during all period. Our results suggest that VEGF-system and EG-VEGF have similar biological activities in endocrine glands and different roles during thymus development and involution which have to be specified in further studies. Possible functions include a modulatory effect on thymic vasculogenesis and microenvironment, influencing thymocyte proliferation and differentiation, T-cell maturation, cell-cell interaction and thymic hormonal secretion.

Cannabis sativa (maconha) é a droga ilícita mais conhecida e utilizada em todo o mundo. Recentemente, o uso recreativo da droga por jovens aumentou muito, especialmente entre as gestantes. Estudos indicam que seu uso na gestação causa efeitos fetotóxicos adversos, no entanto, poucos estudos avaliam esses efeitos durante este período crítico sobre o desenvolvimento do sistema imunológico. Neste estudo, avaliamos o impacto da exposição gestacional à fumaça de maconha resultante da queima de cigarros sobre o desenvolvimento do baço e do timo de proles de camundongos BalbC. Utilizamos um modelo que se aproxima das reais condições de uso humano (inalação) sob os aspectos de dose e média exposição. Camundongos fêmeas gestantes (n = 20) foram expostas ao fumo da maconha ou ao ar filtrado (grupo controle) do 5,5° ao 17,5° dia gestacional (DG) por 5 minutos diariamente. Para isso, foi utilizado um aparelho para inalação da fumaça desenvolvido em nosso laboratório, onde os cigarros de maconha (200mg de Cannabis sativa) foram queimados e a fumaça conduzida para a câmara de exposição dos animais (exposição somente inalatória). Os baços e timos das proles foram coletados no 18,5° dia gestacional (DG), 20° e 60° dias pós-natais (DPN) para a realização das análises histológica e histoquímica. Avaliações morfológicas e quantitativas dos órgãos foram realizadas utilizando-se métodos estereológicos e por meio da semi quantificação de fibras do sistema colágeno. Os resultados indicam um aumento no peso corporal dos animais com 60 DPN cujas mães foram expostas ao fumo de Cannabis sativa durante a gravidez. Os machos com 60 DPN expostos apresentaram redução no volume total do timo, assim como em seus principais compartimentos, medula e córtex, onde também foi observado um aumento de fibras do sistema colágeno, quando comparados aos animais controles. Além disso, o baço desses animais também apresentou redução significativa em seu volume, porém não houve redução significativa no volume total da polpa vermelha. Machos e fêmeas com 60 DPN do grupo exposto apresentaram redução no volume total da polpa branca e aumento de fibras do sistema colágeno na região das trabéculas do parênquima do baço. Em suma, a exposição gestacional à maconha causa efeitos fetotóxicos que podem ser observados por alteração no baço e no timo da prole (sendo os efeitos distintos para machos e fêmeas) e estas alterações se tornam mais marcantes com o avanço da idade do animal, com potencial comprometimento da resposta imune nesses indivíduos. / Cannabis sativa (marijuana) is one of the most well-known and used illicit drugs worldwide. Recently, recreational use of that drug among young people has increased greatly, especially among pregnant women. Studies indicate that its use in pregnancy causes adverse fetotoxic effects, however there are few studies evaluating the effects of marijuana use during this critical period on the developing immune system. In this study, we evaluated the impact of gestational exposure to smoke marijuana resulting from burning cigarettes on the spleen and thymus development of BalbC mice offspring. We have used a model that approximates the real conditions of human use (inhalation) under the dose and medium exposure aspects. Pregnant mice (n=20), were exposed to marijuana smoke or filtered air (control group) from 5.5° to 17.5° gestational day (GD) for 5 minutes daily. Thus, we used a smoke inhalation apparatus developed in our laboratory where the marijuana cigarettes (200mg of Cannabis sativa) were burned and conducted to exposure chamber reaching the animals (nose-only exposure). Spleen and thymus of the offspring were collected on the 18.5° gestational day (GD), 20° and 60° postnatal day (PND) for the histological and histochemical analysis. Morphological and quantitative evaluations of these organs were performed using stereological methods and semi quantification of collagen fibers. The results indicate an increase in the mice body weight at PND 60 whose mothers were exposed to Cannabis sativa smoke during pregnancy. The PND 60 males from exposed group showed lower thymus total volume, as well as its main compartments such as medulla and cortex, where collagen fibers was also observed, when compared with males from the control group. Also, the spleen of these animals also presented a significant reduction, however no significant reduction was showed in the total volume of the red pulp. In addition, males and females from the exposed group at PND 60 presented reduction in total volume in the white pulp and increased of collagen fibers in the trabeculae region of the spleen. In summary, gestational exposure to marijuana causes fetotoxic effects that can be observed due to alteration in the spleen and thymus of the offspring (the effects being different for males and females), and these changes being marked with the advancement of the age, with potential impairment of the immune response in these individuals.

O timo é um órgão complexo estruturado por um estroma, o qual é formado principalmente por células epiteliais corticais (cTECs) e por células epiteliais medulares (mTECs) além de outros tipos celulares como células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos B e fibroblastos. Além disso, os precursores das células T originados da medula óssea chegam ao timo (timócitos) se maturando em linfócitos T, os quais migram para a periferia. O timo é, portanto, o local de eventos muito importantes durante a maturação do sistema imune, incluindo o controle de sua própria homeostase. No presente estudo, procuramos retratar as principais características do timo por meio da análise da expressão gênica em grande escala, isto é, descrevendo parte de seu transcriptoma. Fizemos uso da tecnologia dos cDNA microarrays em duas versões. Na primeira delas utilizamos cDNA microarrays construídos em lâminas de vidro e sondas fluorescentes marcadas com fluorocromos Cy3 ou Cy5 e, na segunda versão utilizamos cDNA microarrays em membranas de náilon e sondas radioativas marcadas com o isótopo 33P. Para a análise dos dados, utilizamos programas de bioinformática dedicados, tais como o SAM (Significance analysis of microarrays) e o Cluster e TreeView. Três conjuntos de resultados foram possíveis. No primeiro conjunto observamos a ocorrência da expressão gênica promíscua (PGE) de antígenos de tecidos/órgãos parenquimatosos (TSAs), demarcando sua emergência temporal durante a ontogenia do timo murino, a qual é influenciada pelo background genético das linhagens isogênicas estudadas. A ocorrência da PGE no timo é associada às bases genético-moleculares da indução de tolerância imunológica nas células T, contribuindo com a prevenção da auto-imunidade. O segundo conjunto de resultados consistiu na análise da expressão gênica do timo de camundongos nocautes (KO) envolvendo genes importantes para a maturação das células T, tais como TCR?, LAT, Rel-b, RAG-1 e CD3?, possibilitando a observação de seus efeitos na regulação da transcrição neste órgão. Finalmente, o terceiro conjunto consistiu na definição da dissecação molecular virtual do timo. Por meio de perfis de expressão gênica particulares exibidos por cada tipo principal que povoa o timo, foi possível dissecar este órgão usando a tecnologia dos cDNA microarrays. / The thymus is a complex organ structured by a stroma, which is formed mainly by cortical epithelial cells (cTECs) and medullary epithelial cells (mTECs) besides of other cell types such as dendritic cells (DC), macrophages, B lymphocytes and fibroblasts. Moreover, the T cell precursors arising from the bone marrow reach the thymus (thymocytes) maturing in T lymphocytes, which migrate to the periphery. Thus, the thymus is the place of very important events during the maturation of the immune system, including the control of their own homeostasis. In the present study, we search to picture the main characteristics of the thymus by means of the large scale gene expression analysis that is, describing part of their transcriptome. We made use of the cDNA microarray technology in two versions. In the first one we used cDNA microarrays constructed on glass slides and fluorescent probes labeled with the fluorochromes Cy3 or Cy5 and in the second version we used cDNA microarrays on nylon membranes and radioactive probes labeled with 33P isotope. To data analysis we used dedicated bioinformatics programs, such as SAM (significance analysis of microarrays) and Cluster-Tree View. Three sets of results were possible. In the first set we observed the occurrence of the promiscuous gene expression (PGE) of parenchymal tissue/organ specific antigens (TSAs), demarking their temporal emergence during the murine thymus ontogeny, which is influenced by the genetic background of the inbred strains studied. The occurrence of PGE in the thymus is associated to the molecular-genetics basis of the immune tolerance of T cells, contributing with the prevention of autoimmunity. The second set of results consisted in the analysis of gene expression of thymus from knockout mice (KO) involving genes important for T cell maturation, such as TCR?, LAT, Relb, RAG-1 and CD3?, allowing the observation of its effects on the transcription regulation in this organ. Finally, the third set consisted in the definition of the virtual molecular dissection of the thymus. By means of particular gene expression profiling featured by each main cell type populating the thymus, it was possible to dissect this organ using the cDNA microarray technology.

Au cours de la réponse immunitaire, comme au cours de la sélection thymique, les interactions cellulaires sont dépendantes de la formation d'un contact étroit entre cellules caractérisé par une synapse. De nombreuses molécules associées aux synapses neurologiques ou neuro-musculaires se sont également exprimées au niveau des cellules immunitaires et impliquées dans la régulation des contacts. Nous avons donc recherché la présence d'autres récepteurs neurologiques au niveau des cellules immunitaires. La neuropilin-1 (Np-1), responsable de la régulation de l'orientation et des contacts des neurones, a été mise en évidence à la fois sur les cellules dendritiques (DC) et les lymphocytes T (LT). De même, la sémaphorin-3A (Sema-3A), un de ces principaux ligands, est exprimée et sécrétée au niveau de ces cellules. La Np-1 est impliquée dans la formation des contacts entre les LT-DC et Thymocytes-cellules épithéliales thymiques. Sa régulation est dépendante de l'activation T médiée par le TcR et/ou par l'interleukine-7 concernant les thymocytes. La production et la sécrétion de la Sema-3A, est exclusivement dépendante de la stimulation du TcR. La Sema-3A interfère avec la prolifération des LT via l'inhibition de la polymérisation de l'actine ce qui empêche la polarisation du TcR au site du contact cellulaire. Le blocage de la Sema-3A, par des anticorps neutralisants provoque une augmentation de la prolifération T. La Sema-3A joue également un rôle au niveau de l'adhésion des thymocytes en bloquant la capacité d'adhésion de ces derniers aux molécules de la matrice extracellulaire (laminine et fibronectine). De plus, la Sema-3A induit la chemorépulsion des thymocytes Np-1 positifs.

Les principaux échecs des greffes de cellules souches allogéniques (HSCT) sont la rechute et les infections, accompagnées ou non de GvHD (Graft versus Host Disease, maladie du greffon contre lhôte), manifestations qui pourraient être partiellement attribuées à un déficit immunitaire (rechute, infections) ou à une réaction immunitaire exacerbée envers le receveur (GvHD) (Baron, Storer et al. 2006). Létude de la reconstitution du système immunitaire, et particulièrement, lymphocytaire, savère dès lors capitale dans le développement des HSCT. Nous avons investigué la reconstitution immune de 50 patients traités par HSCT nonmyéloablative classique vs HSCT nonmyéloablative déplétée en lymphocytes T CD8+. 50 patients ont été randomisés : greffon déplété en CD8 (n=22) vs non manipulé (n=28). Lâge médian était de 57 ans au moment de la greffe (range 36-69). Le régime de conditionnement consistait en une irradiation corporelle totale de 2 Gy avec ou sans ajout de Fludarabine. 20 patients ont reçu une greffe de donneur familial, 14 de donneurs non familiaux HLA identiques, et 16 de donneurs non familiaux présentant une disparité HLA. La reconstitution immunitaire la première année après HCT a été monitorée par cytométrie en flux, analyse de la diversité du répertoire du TCR (spectratyping), quantification de sjTREC (signal joint T cell receptor excision circle, marqueur de la thymopoïèse). La déplétion des CD8 a réduit la reconstitution des taux de CD8 durant les 6 premiers mois postgreffe (P<0.0001) mais na pas présenté dimpact significatif sur la récupération des autres populations cellulaires. Les concentrations de sjTREC et des taux de CD3 ont augmenté parallèlement entre le jour 100 et le jour 365 après greffe (P=0.006 et P=0.022, respectivement), suggérant ainsi la néoproduction de lymphocytes T par le thymus, même chez ces patients âgés. Les facteurs associés à une concentration conséquente de TREC un an après greffe incluent 1° le choix dun donneur non familial HLA-matched (P=0.029), 2° de hautes concentrations de lymphocytes T dans le greffon (P=0.002), et 3° labsence de GVHD chronique (P<0.0001). Nos données suggèrent un modèle biphasique de reconstitution du pool lymphocytaire T: 1) une expansion des T matures du greffon en périphérie durant les 3 premiers mois ;2) une néoproduction active par voie intrathymique assurant la reconstitution du système immunitaire à plus long terme. Combien de temps cette néosynthèse intrathymique perdure-t-elle ? Quels facteurs laffectent ? Est-elle associée à une diversité accrue du répertoire lymphocytaire ? Ces questions nous ont amenés à étudier la reconstitution immunitaire à long terme (entre 1 et 6.5 ans) de 73 patients après minigreffe (211 points au total). Nous avons observé un maintien de la thymopoïèse réenclenchée au cours de la première année postgreffe chez les patients âgés de moins de 50 ans et de 50-60 ans. Cette reprise de la thymopoïèse na pas été mise en évidence au sein du groupe des plus de 60 ans. Ainsi, une application clinique concrète à cette observation pourrait être ladministration de greffons particulièrement riches en lymphocytes T à ce type de patients, puisquils seront plus susceptibles de développer une lymphopénie persistante postgreffe par absence de réenclenchement de la voie thymodépendante. Les facteurs associés à une reconstitution thymodépendante à long terme après minigreffe étaient : 1°labsence de cGvHD (P<0.0001); 2°lâge du receveur (P<0.0001); 3° la concentration en lymphocytes T dans le greffon (P=0. 0.0038) ; 4°laugmentation de la diversité HLA (P=0.0001). Enfin, une tendance non significative à une augmentation parallèle de la diversité du répertoire TCR et des concentrations en sjTREC a été mise en évidence. Cette analyse doit être confirmée par létude dun plus grand nombre de sujets. Afin déliminer au maximum les influences extrathymiques sur les taux de TREC périphériques, nous comptons mesurer pour chaque patient des TREC précoces (BTREC) et un TREC tardif (sjTREC), et calculer un ratio reflétant exactement le nombre de divisions intrathymiques. Cette méthode a été validée dans notre centre au cours dune expansion de lymphocytes T in vitro au moyen de billes anti-CD3 anti-CD28, expansion durant laquelle nous avons pu observer une diminution des sjTREC et des BTREC, mais pas du ratio sjTREC/BTREC. Lanalyse des ratios de TREC des patients greffés est actuellement à létude. Une troisième étude a été également menée afin déclaircir le lien entre GvHD, thymopoïèse et présence de lymphocytes T régulateurs (TRegs) chez 64 patients après HCT. Lémergence dun nouveau marqueur spécifique des TRegs, le CD127, a permis pour la première fois une isolation sans équivoque des TRegs (Liu, Putnam et al. 2006). Nous navons pas pu mettre en évidence de différence significative entre lapparition dune cGvHD chez les patients présentant après greffe des taux de TRegs supérieurs ou inférieurs à la médiane (P=0.13). Inversement, loccurrence de cGvHD na pas paru significativement affecter les concentrations en TRegs après greffe (P=0.1). Nous avons également mis en évidence une corrélation positive significative entre le taux de sjTREC/ml et le taux de TReg/ul au J100 (R=0.46, P=0.007) et à 1 an R=0.47, P=0.001). Afin de déterminer lorigine précise de ces TReg après greffe (thymus du donneur?), nous réalisons actuellement des mesures de sjTREC et de chimérisme sur les populations cellulaires triées au moyen du triple marquage CD4+CD25+CD127- (cellules T classiques vs régulatrices).

<p>Thymus atrophy is highly inducible by stress and prolonged thymus atrophy can contribute to T cell deficiency or inhibit immune recovery after acute peripheral T cell depletion. Little is known regarding the mechanisms driving thymic involution or thymic reconstitution after acute stress. Leptin deficiency in mice results in chronic thymic atrophy, suppressed cell-mediated immunity, and decreased numbers of total lymphocytes, suggesting a role for leptin in regulating thymopoiesis and overall immune homeostasis. Exogenous leptin administration during stress has been shown to protect against thymic damage, yet the mechanisms governing these thymostimulatory effects are currently undefined. Studies herein define the impact of endotoxin-induced thymic damage in the stromal and lymphoid compartment of the thymus and systemic glucocorticoid and cytokine responses in the animal. We report here the novel finding that leptin receptor expression is restricted to medullary thymic epithelial cells in the normal thymus. Using a model of endotoxin-induced acute thymic involution and recovery, we have demonstrated a role for the metabolic hormone leptin in protection of medullary thymic epithelial cells from acute endotoxin-induced damage. We also demonstrated that systemic leptin treatment decreased endotoxin-induced apoptosis of double positive thymocytes and promoted proliferation of double negative thymocytes in vivo through a leptin receptor isoform b-specific mechanism. Leptin treatment increased thymic expression of IL-7, an important soluble thymocyte growth factor produced by medullary thymic epithelial cells. We also found leptin to inhibit systemic glucocorticoid and pro-inflammatory cytokine responses. Using leptin-deficient and leptin receptor-deficient mice in our stress model, we found that endotoxin-induced thymic atrophy was exacerbated in the absence of leptin, despite an inability to mount a proper pro-inflammatory cytokine response. Together, these data support a model in which leptin can function to protect the thymus gland from stress-induced acute damage in part by reduction of systemic corticosteroid and pro-inflammatory cytokine responses, and intrathymically through a mechanism orchestrated by medullary thymic epithelial cells and their soluble mediators (e.g. IL-7). Taken together, these studies suggest a physiological role for leptin signaling in the thymus for maintaining healthy thymic epithelium and promoting thymopoiesis, which is revealed when thymus homeostasis is perturbed by stress.</p> / Dissertation

Kawasaki disease (KD) is characterized by a systemic vasculitis of unknown etiology. More research indicates that KD is related to genetic. In 2003, Sekiya et al. studied the correlation of Th2-related genes and the KD in Japan. They found out that -431T allele would increase the concentration of Thymus and activation-regulated chemokine (TARC)/ CCL17 protein in serum by single nucleotide polymorphism (SNP) -431 C>T of chemokine TARC/ CCL17 operon 5¡¦-flanking region , which suggests that SNP has functionality. Therefore, this study explored the polymorphism and relationship between the regulation of chemokine of TARC/ CCL17 and KD. Firstly, we performed polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) to detect TARC/CCL17 -431 C>T genotype. Then enzyme immunoassay was used to detect TARC/CCL17 chemokine¡¦s expression. The results showed that the performance of TARC -431 C/T SNP, the alleles from KD patients with -431 T, were significantly less than the non-KD control group. It was observed that the -431 T alleles had a lower chance to occur in KD with aneurysms, but independent with coronary artery lesions (CAL). In addition, the acute stage of KD has a higher TARC protein expression, which gradually decreases during IVIG treatment period. However, the up-regulation of TARC protein may not be the direct consequence caused by the single nucleotide polymorphism of TARC -431 C>T.