Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind essentielle angeborene Rezeptoren, die konservierte Strukturen von Krankheitserregern oder Gefahrsignale, die von beschädigten Zellen freigesetzt werden, erkennen können. Genetische Variationen in TLRs wie Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) können die Funktion von TLRs beeinträchtigen und erste Studien zeigen, dass dies zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Virusinfektionen oder einem erhöhten Krebsrisiko führen kann. In dieser Studie haben wir einen Multicolor-Durchflußzytometrie-Test entwickelt, um die TLR-Funktionen in verschiedenen Subpopulationen unseparierter peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) simultan analysieren zu können. Wir konnten beobachten, dass das Ausmaß der TLR-Antworten zwischen den Probanden stark variierte, jedoch über einen Zeitraum von einem Monat gut reproduzierbar war. Zunächst untersuchten wir TLR Reaktionen bei Patienten mit rezidivierenden Herpes labilalis (HL). Im Vergleich zu asymptomatischen Personen war eine HL- Anamnese mit einer signifikant verminderten TLR3-IFN-Gamma-Antwort nach Stimulation mit poly(I:C) in NK Zellen assoziiert. Weitere molekulare Untersuchungen zeigten eine mögliche Beteiligung von TLR3 L412F SNP, welcher die oberflächliche TLR3 Expression und die IFN-Gamma-Antworten in NK-Zellen reduzierte. Einige Studien zeigen, dassTLR1 I602S, ein weiterer sehr verbreiteter SNP, in der Lage ist die TNF-Alpah-Antworten von Monozyten gegen den TLR2/1-Agonisten (Pam3Cys) zu verringern. In der hier vorliegenden Arbeit konnten wir zudem nachweisen, dass TLR1 I602S SNP auch die Funktion von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen beeinträchtigt. Wir konnten keine Assoziation zwischen TLR2/1-Defizienz und reaktivierendem HL feststellen. Jedoch konnten wir an einer großen Kohorte von über 326 Patienten zeigen, dass der TLR1 SNP sowohl ein Risikofaktor für Magenkarzinomentstehung als auch für die Metastasierung ist. Zusammenfassend weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass genetische Polymorphismen von TLRs die Funktion von NK-Zellen beeinträchtigen und zu einer erhöhten Anfälligkeit für HSV-1 Erkrankung und Magenkarzinom führen können. / Toll-like Receptors (TLRs) are essential innate receptors which recognize conserved structures of pathogens, or danger signals released from damaged cells. Alterations of TLR responses might result in severe viral infections or a higher risk of cancer. Therefore, development of clinical assays to evaluate TLR functions could provide personalized information about susceptibility to these diseases. Since TLRs are differentially expressed on different subsets of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), a multi-color flow cytometry-based assay was developed to detect TLR responses of individual cell types simultaneously. We observed that the magnitude of TLR responses largely varied between human subjects, but was highly reproducible over one month. To evaluate the potential role of differences in natural killer (NK) cell TLR response we studied the association of NK cell TLR function and TLR single nucleotide polymorphisms (SNPs) with susceptibility to recurrent herpes labialis (HL) and gastric cancer. Using our assay, impaired TLR3 response of NK cells was found in people with recurrent HL. In addition, we have identified enhanced levels of homozygous TLR3 L412F SNP in people with recurrent HL, which results in lower surface expression and reduced NK cell response to poly(I:C). TLR1 I602S, another common SNP, has been reported to decrease TNF-Alpha responses of monocytes toward TLR2/1 agonist, Pam3CSK4 (Pam3Cys), stimulation. In our study, we found that TLR1 I602S homozygosity also contributes to impaired IFN-Gamma responses of NK cells and CD8+T cells. Although we did not observe an association of TLR2/1 deficiency with recurrent HL, association of TLR1 I602S with risk for primary as well as metastatic gastric cancer was found in a cohort of 326 patients. To sum up, our results suggest that genetic polymorphisms of TLRs can impair TLR function of NK cells, which contribute to the increased susceptibility to HSV-1 diseases and gastric cancer.

Die angeborene Immunität ist in der Lage, Pathogene schon beim erstmaligen Eindringen zu erkennen und zu bekämpfen. Haupteffektoren der schnellen, angeborenen Immunantwort sind Makrophagen und polymorphkernige neutrophile Granulozyten. Diese erkennen und phagozytieren Pathogene und koordinieren die weitere Immunantwort durch die Freisetzung von inflammatorischen Mediatoren und Zytokinen. Die Erkennung mikrobieller Bestandteile, wie Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien bzw. Peptidoglykan (PG) und Lipoteichonsäuren (LTA) Gram-positiver Bakterien, führt zur Aktivierung von unterschiedlichen Proteinkinasen, des Transkriptionsfaktors NF-(B und zur Freisetzung von Zytokinen. Mitglieder der Toll-Proteinfamilie, sogenannte Toll-like-Rezeptoren (TLR), wurden kürzlich als Rezeptoren auf Immunzellen identifiziert, die für die Erkennung solcher mikrobieller Bestandteile verantwortlich sind. Während TLR-4 der LPS-Erkennung dient, und TLR-2 und -6 verschiedene Liganden von Gram-positiven Bakterien binden, blieb die Frage der Erkennung von LTA und verwandten Glykolipiden strittig. Sowohl TLR-2 als auch TLR-4 wurden für diese Rolle diskutiert. Zielsetzung dieser Arbeit war, die Rolle von TLRs in der LTA- und Glykolipid-Erkennung zu untersuchten. Glykolipide von zwei eng verwandten Treponemen-Spezies, T. maltophilum (TM) und T. brennaborense (TB), sowie neuartig aufgereinigte Lipoteichonsäuren von Staphylococcus aureus (SA) und Bacillus subtilis (BS) wurden eingesetzt, um die nukleäre Translokation von NF-(B in verschiedenen Zellsystemen zu induzieren. Diese Zellstimulationsexperimente wurden mit verschiedenen TLR-2-negativen Zellinien sowie mit Peritonealexsudatzellen TLR-4-defizienter C3H/HeJ-Mäuse durchgeführt. Weitere Informationen lieferten TLR-2-Überexpressions-Experimente sowie Zellstimulationen unter Verwendung von anti-TLR-4-Antikörpern. Die Aktivierung von NF-(B wurde anhand von Gelshifts nachgewiesen. Mit der Überexpression von dominant-negativen Mutanten verschiedener Moleküle der Signalkaskade, mit Kinase-Hemmstoffen und mit Western Blots wurden die intrazellulären Signaltransduktionswege untersucht. Für Glykolipide von T. maltophilum und beide verwendeten Lipoteichonsäuren ließ sich eine klare TLR-2-Abhängigkeit in der Aktivierung von NF-(B und der Induktion von proinflammatorischen Zytokinen zeigen. Die Glykolipide von T. brennaborense hingegen waren überraschender Weise gleichzeitig auch TLR-4-Liganden. Beide untersuchten Glykolipide sowie beide LTAs aktivierten einen Signalweg unter Einbeziehung des Adaptermoleküls MyD88 und der NF-(B-induzierenden Kinase (NIK). Des weiteren konnte der Einfluß der MAP-Kinasen p42/44 und p38 auf die Treponema-Glykolipid- und LPS-induzierte TNF-(-Ausschüttung dargestellt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß TLR-2 der Hauptrezeptor von Lipoteichonsäuren ist, und TLR-2 und -4 beide Rezeptoren der Treponema-Glykolipide sein können. Diese Ergebnisse sollten dazu beitragen, die molekularen Grundlagen der Reaktionen des Immunsystems auf Gram-positive Bakterien und Treponemen zu verstehen. / The innate immune response to microbial pathogens is able to protect the host after a first pathogen contact. This immediate immune response is largely mediated by macrophages and neutrophils. They recognize and phagocytose pathogens, and coordinate host responses by secreting inflammatory mediators, such as cytokines. The recognition of lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria, or peptidoglycan (PG) and lipoteichoic acids (LTAs) of Gram-positive bacteria leads to the induction of protein-kinases, the transcription factor NF-(B, and subsequently the release of proinflammatory cytokines. Recently, members of the Toll-protein-family, the so-called Toll-like receptors (TLRs) have been found to be involved in immune cell activation by microbial products. While TLR-4 has been identified as the transmembrane signal transducer for LPS, and TLR-2 and -6 for different ligands originating from Gram-positive bacteria, the molecular basis of recognition of lipoteichoic acids and related glycolipids has not been completely understood: Both, TLR-4 and -2 have been postulated as receptors. In order to determine the role of TLRs in immune cell activation by Treponema glycolipids and LTAs experiments involving TLR-2-negative cell lines, macrophages from TLR-4-deficient C3H/HeJ-mice, cells overexpression TLR-2, and inhibitory TLR-4 antibodies were performed. The induction of NF-(B was assessed by electrophoretic mobility shift assays. Glycolipids of two related Treponema species, T. maltophilum (TM) and T. brennaborense (TB), and LTAs from Staphylococcus aureus (SA) and Bacillus subtilis (BS) were investigated for induction of nuclear translocation of NF-(B in different cell systems. Glycolipids from T. maltophilum and both LTAs studied revealed TLR-2-dependency in induction of NF-(B and proinflammatory cytokines. Surprisingly, glycolipids from T. brennaborense were found to be TLR-4-ligands. Furthermore an involvement of the signaling molecules MyD88 and NIK in cell stimulation by LTAs and glycolipids was revealed by dominant-negative overexpression experiments. The induction of TNF-( by Treponema glycolipids furthermore was dependent on activation of MAP kinases p42/44 and p38, as indicated by specific kinase inhibitors. Tyrosinephosporylation of the p42/44 kinase induced by Treponema glycolipids were detected by western blots. In summary, the results presented here indicate that TLR-2 is the main receptor for LTAs. Both TLR-2 and -4 serve as receptors for Treponema glycolipids. These results may potentially contribute to explain immune responses to Gram-positive bacteria and treponemes.

LBP vermittelt im Wirtsorganismus die direkte Immunantwort auf bakterielle Liganden wie das Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen oder Lipopeptide von Gram-positiven Bakterien. In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise von LBP weiter aufgeklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine natürlich vorkommende Mutation des LBP (c998t), die an Position 333 zu einem Austausch der Aminosäure Prolin zu Leucin führt, hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Struktur und Funktionalität des Proteins untersucht. Westernblot-Analysen des rekombinant hergestellten Proteins und humaner Seren von Mutationsträgern weisen auf einen Zerfall des mutierten Proteins hin. Es kommt zu einer Beeinträchtigung der Bindung bakterieller Liganden und einer deutlichen Reduktion der LBP-vermittelten Zytokinausschüttung von Immunzellen. Der hier untersuchte Polymorphismus hat eine Allelfrequenz von 0,072 in einer gesunden europäischen Population. Genotypanalysen von Patientengruppen zeigten, dass es durch die Mutation zu einer deutlich erhöhten Mortalität bei Patienten mit septischen Komplikationen und einer durch Gram-negative Erreger verursachten Pneumonie kommt. Unsere Ergebnisse zur eingeschränkten Funktion des LBP-c998t bieten eine erste Erklärung dafür, wie diese Mutation vermutlich die Fähigkeit, Krankheiten zu bewältigen, beeinträchtigt. Innerhalb dieser Arbeit ging es um die Analyse der Bindung von bakteriellen Liganden an LBP. Dabei wurde eine potentiell gemeinsame Bindungsstelle für Liganden untersucht, die von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien stammen und später von den Toll-like Rezeptoren (TLRs) 2 und -4 erkannt werden. Dazu wurden Bindungsversuche zwischen Lipopeptiden und LPS mit einer zweiten LBP-Variante (LBP-E94/95) durchgeführt. Beim LPS führt dies zu einem Bindungsverlust. Auch für die Lipopeptide war durch die Mutationen die Interaktion mit LBP beeinträchtigt, was die These einer gemeinsamen Bindungsstelle von TLR2- und TLR4-Liganden an das Protein weiter unterstützt. / LBP enhances the innate immune reaction against bacterial ligands like LPS from gram negative or lipopeptides from gram positive bacteria in the host. Here we investigated the function of LBP using two recombinant mutants of the protein. The first part of this work examines a natural occurring mutation of LBP (c998t) leading to an amino acid exchange of proline to leucine at position 333 with regard to the impact on structure and function of the protein. Western blot analyses of the recombinant protein and sera obtained from individuals differing in the LBP genotype indicate the disaggregation of the mutated protein. Thereby binding of bacterial ligands to LBP is diminished and the LBP mediated cytokine secretion of immune cells is reduced. The gene polymorphism leading to the occurrence of the mutation is present with an allelic frequence of 0.072. A recent study has shown that this LBP-SNP led to a higher mortality in patients with septic complications and gram negative pneumonia. The results presented here, showing the negative impact on the function of LBP due to the mutation, may therefore be a first explanation on how this mutation affects the ability of people to deal with disease. Within this work binding of ligands to LBP was also explored. It was investigated whether ligands which are later recognized by Toll-like receptors (TLRs) 2 and – 4 share a common binding site on LBP. Assays with immobilized lipopeptides and LPS were performed with a second mutated LBP (LBP-E94/95). LPS binding to LBP is diminished completely. Here we showed that binding of lipopeptide to LBP is affected likewise, furthermore supporting the hypothesis of a common binding site for TLR2- and TLR4- ligands.

Toll-like Rezeptoren (TLR) und Nod-like Rezeptoren (NLR) sind Muster-erkennende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die bakterielle Zellwandbestandteile erkennen können. Interleukin (IL)-1beta ist ein streng reguliertes Zytokin. Durch eine erste Stimulation wird der TLR-Rezeptor ausgelöst und führt zur Expression des Vorläuferproteins proIL-1beta. Durch einen zweiten Stimulus wird ein zytoplasmatischer NLR-Rezeptor zur Caspase1-Aktivierung angeregt. Dies führt zur post-translationalen Reifung von proIL-1beta zu reifem IL-1beta und zur Aktivierung weiterer Mechanismen der Pathogen-Eliminierung während einer bakteriellen Meningitis. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die synergistische Beziehung zwischen TLRs und NOD2 in Bezug auf die IL-1beta-Sekretion in Astrozyten und Mikroglia untersucht. Primäre murine WT-Astrozyten und eine humane Zelllinie, die mit Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipopeptid sowie Muramyldipeptid (MDP) stimuliert wurden, zeigten signfikant erhöhte IL-1beta-Werte. IL-1beta war in NOD2-/- Astrozyten nicht erhöht. NOD2 trägt demnach als MDP-ausgelöster Rezeptor in Astrozyten, vermutlich zusammen mit dem Inflammasom-Komplex, zur Caspase-1-Aktivierung bei. In Mikrogliazellen lässt sich der bei Astrozyten gezeigte Effekt nicht reproduzieren. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die TLR-abhängige IL-1beta-Antwort durch NOD2-Beteiligung in murinen und humanen Astrozyten synergistisch erhöht wird. In einem weiteren Versuchsteil wurde in primären murinen Peritonealmakrophagen von adulten Mäusen der TLR/NLR-Synergismus untersucht. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass weibliche NOD2-/- Mäuse zu einer synergistisch erhöhten IL-1beta-Sekretion fähig waren. SiRNA-Versuche mit in Östrogen vorinkubierten RAW264.7-NOD2-/- Zellen zeigten eine eindeutige Synergie der TLR4- und NOD2-Rezeptoren in der IL-1beta-Ausschüttung. Östrogen scheint weiblichen Individuen einen protektiven Vorteil vor Infektionen bei NOD2-Defizienz zu verschaffen. / Toll-like receptors (TLR) and nod-like receptors (NLR) are pattern-recognition receptors that recognize lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides and myramyldipeptide (MDP) derived from bacterial cell wall. We focus our question on the regulation of the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-1beta during bacterial meningitis in primary murine astrocytes and microglia as well as cell lines and the synergism of TLR4 or TLR2 and NOD2 to amplify IL-1beta-expression. ProIL-1beta is expressed by TLR-stimulation and activation of NF-kB signal transduction. Through the activation of Caspase-1, possibly through NOD2 and the inflammasome, proIL-1beta is cleaved on post-translational level and obtains its activated status, leading to pathogen elimination during bacterial meningitis. Primary murine WT-astrocytes and a human cell line primed with LPS or lipopeptide and stimulated with MDP show significantly increased IL-1beta levels in the supernatant. NOD2-/- astrocytes do not show elevated IL-1beta levels. After screening of cytoplasmic proCaspase-1 and activated Caspase-1 by Western blot it became clear, that stimulation of NOD2 with MDP led to Caspase-1 activation and thus to IL-1beta maturation in primary murine WT-astrocytes. We demonstrate for the first time that the synergism between TLR4 and NOD2 leads to significantly elevated IL-1beta levels and that NOD2 is capable of activating caspase-1 in primary murine astrocytes. Another part of the work was to test the TLR/NLR-synergism on primary peritoneal macrophages from adult mice. Surprisingly, female NOD2-/- mice showed significantly elevated IL-1beta levels. SiRNA- and stimulation-experiments with RAW264.7-NOD2-/- cells pre-incubated in estrogen show a clear synergy in IL-1beta secretion through TLR4 and NOD2 receptors. Estrogen seems to protect females from infection when having a NOD2 deficiency.

Eine Melanomerkrankung im metastasierten Stadium ist heute noch eine nicht heilbare und in den meisten Fällen tödlich verlaufende Erkrankung. Über 50% der Patienten mit metastasierendem malignen Melanom entwickeln Lungenmetastasen. Nach dem Auftreten von Lungenmetastasen beträgt die durchschnittliche Überlebenszeit noch 7,3 Monate. Demnach ist die Entwicklung von Therapiestrategien notwendig, um das Fortschreiten von Tumormetastasen oder sogar deren Entstehung zu verhindern. Die lokale Stimulation der angeborenen Immunabwehr durch Behandlung mit Toll-like-Rezeptor-Agonisten käme hierfür in Frage. Inhalative Behandlungen mit Immunmodulatoren, wie sie für IL-2 beschrieben wurden, könnten insbesondere für die Behandlung pulmonaler Metastasen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das pulmonale angeborene Immunsystem im Mausmodell durch den TLR2/6-Agonisten MALP-2 stimuliert und die Auswirkung dieser Immunstimulation auf experimentell induzierte pulmonale Melanommetastasen untersucht. Intratracheale Instillationen von 0,5 µg MALP-2 führten zu starker Einwanderung neutrophiler Granulozyten (6-fach) und Makrophagen (3,4-fach) in die Lunge von C57/BL6-Mäusen. Innerhalb von 24 h war das Maximum der Immunzelleinwanderung erreicht. Der Leukozyteneinstrom fiel dann innerhalb von 72 h wieder auf das Ursprungsniveau zurück. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass MALP-2 auch zu einer deutlichen Steigerung der Expression von VCAM-1 in pulmonalen Blutgefäßen führt. In vitro Experimente zeigten, dass dieses Adhäsionsmolekül die Bindung von B16-F10-Melanomzellen vermitteln kann.  Außerdem führte die MALP-2-Behandlung weder in vitro noch in vivo zu einer signifikanten Steigerung der Fähigkeit von Immunzellen, B16-F10-Melanomzellen zu lysieren.  So konnte, im Gegensatz zu Rückschlüssen aus früheren Publikationen, trotz der ausgeprägten Stimulation des pulmonalen Immunsystems und unabhängig vom Applikationsregime durch MALP-2 vor oder nach Tumorinokulation im Mausmodell keine signifikante Änderung der pulmonalen Metastasen erreicht werden. Durch Markierung von Melanomzellen, die stabil mit Green fluorescent Protein transfiziert waren, war es möglich, Melanomzellen kurz nach Tumorzellaussaat zu untersuchen. Eine lokale TLR2/6-Aktivierung durch MALP-2-Instillation 24 h vor Tumorinokulation führte aber in vivo zu keiner Beeinflussung des pulmonalen Melanomzellarrests im Mausmodell. Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch das „Boostern“ des Immunsystems durch wiederholte intratracheale MALP-2-Applikation an bereits etablierten pulmonalen Metastasen zu keiner Änderung des klinischen Gesamtresultates führt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass diese teilweise unerwarteten Ergebnisse deutlich machen, dass klinische Vorhersagen bezüglich immunmodulierender Therapien mit Vorsicht zu stellen sind, insbesondere, da multiple, sich wechselseitig beeinflussende Effekte durch die Immunstimulantien selbst das Gesamtergebnis einer Tumortherapie beeinflussen können.