DNA supercoiling is an important determinant of variety of molecular processes because of its influence on substrate properties of DNA. Many proteins that bind DNA interact in a negatively supercoil dependent manner. The higher free energy associated with negative supercoiling is utilized for binding and subsequent transactions. Protein components of DNA replication, segregation, transcription and recombination machinery interact with DNA in topology dependent manner. Topoisomerases, thus play essential role in DNA transaction processes. Owing to their influence on diverse cellular functions, the enzymes are considered as global regulators. Movement of macromolecular assemblies along the DNA helix generates internal torsional strain during replication and transcription. This strain manifests itself as local domains of supercoils ahead and behind the helix tracking machinery. If left unchecked, accumulation of these supercoils could severely affect the survival of the cells. Cellular systems thus employ more than one topoisomerase, which act in concert to regulate DNA topology and maintain a steady-state level of supercoiling necessary for integrity and functionality of DNA molecules.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T00:26:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 277022.pdf: 4321942 bytes, checksum: 61f110123aa6e16130d34cb59a61133a (MD5) / DNA topoisomerases são enzimas que participam de diversos processos celulares tais como: replicação, transcrição, recombinação e segregação dos cromossomos. Atuando na clivagem transitória de uma fita (tipo I) ou ambas as fitas (tipo II) da molécula de DNA, as topoisomerases são alvos de agentes bactericidas e de drogas antitumorais e podem ser um importante alvo para quimioterapia de doenças causadas por parasitos. Neste estudo, descrevemos e caracterizamos os genes que codificam as topoisomerases tipo II de Trypanosoma rangeli (TrTop2). Os genes TrTop2 apresentaram um quadro aberto de leitura com 3.696 (TrTop2mt) e 4.368 pares de bases (TrTop2?), codificando polipeptídios preditos de 1.232 (138,8 kDa) e 1.456 (164,1 kDa) aminoácidos, respectivamente. Ambos os genes apresentaram uma alta similaridade da sequência protéica com topoisomerases ortólogas de outros tripanosomatídeos, sobretudo com T. cruzi (96% e 85%). Entre os dois genes a similaridade a nível de aminoácidos foi de 56%, sendo ambos de cópia única no genoma do T. rangeli. Anticorpos dirigidos a fragmentos protéicos de ambas as proteínas foram utilizados em ensaios de western blot e revelaram bandas de aproximadamente 130 kDa em extratos protéicos totais de T. rangeli. Embora com tamanho similar, foram identificadas proteínas distintas quando avaliadas por eletroforese 2D (pI 6,4 e 7,6). Através de géis de poliacrilamida em condições não desnaturantes foi possível determinar que ambas as proteínas nativas formam um complexo protéico de alto peso molecular indicando uma possível interação entre proteínas ou subunidades. Ensaios de imunolocalização com os distintos anticorpos contra DNA topoisomerases II apontaram diferentes padrões de localização celular, com reconhecimento no núcleo ou no cinetoplasto em formas epimastigotas e em alguns casos dispersa no citoplasma de formas tripomastigotas. A novobiocina, inibidor de topoisomerases tipo II procarióticas, foi ativo in vitro contra o T. rangeli. Acima de 300 ?g/ml observa-se uma redução no crescimento dos parasitos com alterações morfológicas e estruturais a nível nuclear e do cinetoplasto. Acima de 150 ?g/ml observa-se completa inibição da diferenciação celular in vitro. Utilizando as proteínas mtHSP70, DHLADH e a DNA topoisomerase II mitocondrial (TrTop2mt) como marcadores biológicos, foi observado redução da expressão das mesmas durante a diferenciação do T. rangeli, assim como nos tratamentos com novobiocina. Conclui-se que eventos relacionados as DNA topoisomerases II podem ser essenciais na redução do crescimento e da diferenciação celular do T. rangeli.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T17:18:19Z No. of bitstreams: 1 Aline Rossi da Silveira_Tese.pdf: 8471913 bytes, checksum: 0fab38761956ee193363ddbd346558dc (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T17:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aline Rossi da Silveira_Tese.pdf: 8471913 bytes, checksum: 0fab38761956ee193363ddbd346558dc (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Vice Direção de Ensino, Informação e Comunicação. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As DNA topoisomerases constituem um família de enzimas que desempenham um importante papel nos processos de replicação e atuam na regulação da topologia do DNA, inserindo uma quebra temporária em uma ou em ambas as fitas do DNA. A topoisomerases IB (TopoIB) produz quebras numa cadeia do DNA e permite o giro da cadeia quebrada sobre a cadeia intacta. A TopoIB conserva a energia do rompimento da ligação fosfodiéster, estocando-a na forma de ligação covalente que ocorre entre ela e os grupamentos fosfatos, no ponto de clivagem. Depois ela utiliza essa energia para restaurar a ligação fosfodiéster e selar a quebra. Algumas topoisomerases I podem relaxar super enovelamentos positivos e negativos no DNA. Estas enzimas são potenciais alvos para drogas citotóxicas. Alguns compostos já foram descritos como capazes de interferir na atividade de TopoI. Estes inibidores, chamados poisons, como a camptotecina e seus derivados, são efetivas drogas anticâncer. Outros, como os derivados de naftoquinonas são conhecidos como inibidores catalíticos, já foram descritos como atuantes sobre TopoI por mecanismos diferentes. Dentre estes compostos, o lapachol, uma naftoquinona natural, e alguns de seus derivados sintéticos como a α- e a β-lapachona, já foram associados à inibição de topoisomerases. Desta forma, o objetivo principal deste trabalho foi o de estudar computacionalmente a interação entre alguns compostos derivados de naftoquinonas e a enzima DNA TopoIB humana, utilizando as técnicas de docking vii molecular e simulações de dinâmica molecular. Os compostos aqui estudados foram analisados quanto ao sítio mais provável de interação com a enzima, por docking molecular. Utilizando a mesma metodologia, foi possível descartar a atuação dos 75 compostos avaliados como poisons. Em geral, os compostos aqui estudados indicam que derivados de naftoquinonas são interessantes para o desenvolvimento de drogas anticancerígenas e antibióticas. / The DNA topoisomerases are a family of enzymes that play an important role in the replication processes and act in regulating the topology of the DNA by inserting a reversible break in one or both strands of DNA. The topoisomerases IB (TopoIB) produces breaks in the DNA chain and allows the rotation of the broken chain around the intact chain. The TopoIB conserves energy for breaking the phosphodiester bond, storing it in the form of covalent bonding that occurs between itself and the phosphate groups at the cleavage site. Then it uses this energy to restore the phosphodiester bond and seal the break. Some topoisomerases I can relax positive and negative DNA supercoils. These enzymes are potential targets for cytotoxic drugs. Some compounds have been described as capable of interfering with the activity of TopoI. These inhibitors, known as poisons, such as camptothecin and its derivatives, are effective anticancer drugs. Others, such as naphtoquinone derivatives are known as catalytic inhibitors that have been described as operating on topoi by different mechanisms. Among these compounds, lapachol, a natural naphtoquinone, and some of its synthetic derivatives such as α-and β-lapachone, have been associated with inhibition of ix topoisomerases. Thus, the main objective of this work was to study computationally the interaction between some naftokinone derived compounds and the human TopoIB DNA enzyme, using molecular docking and molecular dynamics simulations. The compounds studied here were analyzed for its most probable site of interaction with the enzyme by molecular docking. Using the same methodology, it was possible to dismiss the action of 75 compounds evaluated as poisons. In general, the compounds studied here suggest that naphtoquinone derivatives are interesting for the development of anticancer drugs and antibiotics.

PINHEIRO, D. P. Avaliação do potencial citotóxico e mecanismo molecular das naftoquinonas sintéticas ENSJ39 e ENSJ108: estudos in vitro e in silico. 2017. 213 f. Tese ( Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-10-26T16:51:14Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_dppinheiro.pdf: 333951 bytes, checksum: 50509ba3b73b6c364f0d8ad0bff04928 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Carvalho (lolitaprado@ufc.br) on 2017-10-30T11:26:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_dppinheiro.pdf: 333951 bytes, checksum: 50509ba3b73b6c364f0d8ad0bff04928 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-30T11:26:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_dppinheiro.pdf: 333951 bytes, checksum: 50509ba3b73b6c364f0d8ad0bff04928 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / Cancer consists in a set of diseases, which present in common the disordered proliferation and the inability of normal cellular differentiation. It is a disease of high incidence and one of the main causes of mortality worldwide, with an estimate for Brazil, in the biennium 2016-2017, indicating the occurrence of about 600 thousand new cases. Despite the large arsenal of chemotherapy in clinic, several studies are conducted in the search for drugs with higher therapeutic potency and, especially, more selective for tumor cells. Naphthoquinones are object of several studies due to their pharmacological activities, presenting excellent antitumor activity, besides microbicidal and anti-inflammatory activities, appearing as good candidates for the cancer treatment. Thus, the present study aimed to evaluate the in vitro cytotoxic effect of naphthoquinone compounds, as well as to study the mechanisms of action involved in the process of cell death induction by these compounds. Therefore, the compounds were initially subjected to a target-directed screening as inhibitors of topoisomerases and DNA repair enzymes, as well as evaluation of cell viability in several tumor and non-tumor cell lines. From the initial group of compounds, two were selected for further evaluation of the mechanisms of action: synthetic naphthoquinone ENSJ39, analogous to Nor-β-lapachone; and ENSJ108, analogous to α-lapachone. The results showed that, in the HCT-116 cancer cell line, the naphthoquinone ENSJ39, bioactivated by the NQO1 enzyme, induced an antiproliferative effect followed by a cytotoxic effect in a concentration-dependent manner, inhibiting cell cycle progression with G2/M arrest. These effects are related to the DNA damage caused by the reactive oxygen species generated by the drug. DNA damage activates the NHEJ and HR repair pathways, and is also related to the drug-induced topoisomerase II inhibition, which leads to the trapping of Top2cc; besides of a possible catalytic inhibition of topoisomerase I. These effects may induce death by apoptosis via the mitochondrial (intrinsic) pathway or, secondarily, appear to activate the extrinsic pathway. The naftoquinone ENSJ108, in tumor cells HCT-116, induced an antiproliferative effect followed by a cytotoxic effect, in a concentration-dependent manner, promoting the generation of reactive oxygen species (ROS). It results in a ROS-dependent DNA damage, leading to hyperactivation of PARP1, culminating in a type of cell death due to regulated necrosis called parthanatos. The drug also causes topoisomerase II inhibition by top2cc trapping, resulting in double-strand breaks and activation of TDP2 and HR. Secondarily, the drug appears to activate apoptosis via the extrinsic pathway. In conclusion, the naphthoquinones ENSJ39 and ENSJ108 show potent in vitro antitumor activity, highlighting the importance of future studies in animal models to evaluate the therapeutic potential of these molecules. / O câncer compreende um conjunto de doenças, que apresentam em comum a proliferação desordenada e a incapacidade de diferenciação celular normal. É uma doença de alta incidência e uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, com estimativa para o Brasil, no biênio 2016-2017, apontando a ocorrência de cerca de 600 mil novos casos. Apesar do grande arsenal existente de quimioterápicos na clínica, vários estudos são realizados na busca por fármacos com maior potência terapêutica e, especialmente, mais seletivos para as células tumorais. As naftoquinonas são objeto de diversos estudos devido suas atividades farmacológicas, apresentando excelente atividade antitumoral, além de atividades antimicrobiana e anti-inflamatória, surgindo como bons candidatos para o tratamento do câncer. Dessa forma, o presente estudo teve por finalidade avaliar o efeito citotóxico in vitro de compostos naftoquinonas, bem como, estudar os mecanismos de ação envolvidos no processo de indução de morte celular destes compostos. Os compostos pertencentes ao grupo das naftoquinonas sintéticas foram inicialmente submetidos a um screening alvo-dirigido como inibidores de topoisomerases e enzimas de reparo de DNA, além de avaliação da viabilidade celular em diversas linhagens celulares tumorais e não tumorais. Do grupo inicial de compostos, dois foram selecionados para prosseguimento da avaliação dos mecanismos de ação: a naftoquinona sintética ENSJ39, análogo da Nor-β-lapachona; e a ENSJ108, análogo da α-lapachona. Os resultados mostraram que, na linhagem tumoral HCT-116, a naftoquinona ENSJ39, bioativada pela enzima NQO1, induziu efeito antiproliferativo seguido de efeito citotóxico, de maneira concentração dependente, inibindo a progressão do ciclo celular com parada em G2/M. Esses efeitos estão relacionados ao dano de DNA causado pelas espécies reativas de oxigênio geradas pela droga. O dano ao DNA ativa as vias de reparo por NHEJ e HR, estando também relacionado à inibição de topoisomerase II induzida pela droga, que leva ao aprisionamento de Top2cc; além de uma possível inibição catalítica da topoisomerase I. Estes efeitos podem induzir a morte por apoptose pela via mitocondrial (intrínseca) ou, de forma secundária, parece ativar a via extrínseca. Já a naftoquinona ENSJ108, em células tumorais HCT-116, induziu efeito antiproliferativo seguido de efeito citotóxico, de maneira concentração dependente, promovendo geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). As ROS geradas causam dano ao DNA, levando a hiperativação de PARP1 que culmina com um tipo de morte celular por necrose regulada chamada parthanatos. A droga causou também inibição de topoisomerase II, pelo aprisionamento de topo2cc, resultando em quebras de dupla fita e ativação de TDP2 e HR. De forma secundária, a droga parece ativar apoptose pela via extrínseca. Podemos concluir que as naftoquinonas ENSJ39 e ENSJ108 mostraram potente atividade antitumoral in vitro, destacando a importância de futuros estudos em modelos animais para avaliação do potencial terapêutico destas moléculas.

Este estudo foi elaborado com o objetivo de elucidar os mecanismos de resistência às quinolonas presentes em enterobactérias isoladas de pacientes de duas regiões metropolitanas brasileiras. Foram avaliadas possíveis alterações nas proteínas relacionadas com o sítio de ação das quinolonas, bem como a presença de plasmídeos e integrons que carregam determinantes gênicos que codificam resistência às quinolonas. A associação destes com mecanismos plasmideais de resistência aos antibióticos -lactâmicos também foi analisada. Foram avaliadas 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico isoladas de pacientes hospitalizados e da comunidade no período de 2000 a 2005. Por PCR e seqüenciamento, foram analisadas as mutações presentes nos genes cromossômicos gyrA e parC e as estruturas gênicas associadas com determinantes plasmideais de resistência às quinolonas, Qnr, e aos -lactâmicos de amplo espectro. Foram determinados os perfis plasmideais e a transferabilidade dos plasmídeos que carrearam estes determinantes. A extração e a análise das proteínas de membrana externa foi realizada para avaliar uma possível perda ou diminuição da expressão de porinas, também relacionada com os mecanismos de resistência avaliados. Todas as amostras foram resistentes ao ácido nalidíxico, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) superior a 16 g/mL, e em média, 70% apresentaram diminuição de sensibilidade às fluoroquinolonas testadas. De 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico, em seis enterobactérias (2,3%), incluindo 3 E. coli, 2 K. pneumoniae e 1 C. freundii foi encontrado o gene qnrB. Cinco linhagens apresentaram suas seqüências idênticas ao gene qnrB2, e uma linhagem, C. freundii JF79, apresentou uma seqüência idêntica ao gene qnrB8. Em uma linhagem de E. cloacae foi detectado o gene qnrA1 (0,37%). Os genes qnrA e qnrB apresentaram-se localizados em plasmídeos que apresentaram de 55 a 180 kilobases. A análise da estrutura gênica indicou que os genes qnrA1 e qnrB2 estavam associados com um integron classe 1 e localizados entre o elemento ISCR1 e a segunda cópia do segmento conservado 3. Na coleção bacteriana avaliada, as principais mutações observadas foram nos códons 83 e 87 em gyrA, e nos códons 80 e 84 em parC. Todas as enterobactérias que exibiram unicamente mutações no gene gyrA apresentaram CIM 16 µg/mL para o ácido nalidíxico. A diferença encontrada nos valores da CIM de fluoroquinolonas em enterobactérias que apresentaram as mesmas substituições em GyrA e ParC foi explicada pela ausência ou diminuição da expressão de porinas. Em relação à produção de -lactamase de espectro ampliado (ESBL), sua presença foi comprovada em 24 (9,3%) enterobactérias. O seqüenciamento de blaCTX-M identificou 18 determinantes: CTX-M-2 (n=13), incluindo dois novos variantes, CTX-M-8 (n=2) e CTX-M-9 (n=3) mediados por plasmídeos de 48 a 180 kilobases, não conjugativos, em maioria. O gene blaSHV-5 foi detectado em seis enterobactérias. Todos os determinantes do grupo 2 apresentaram-se associados com um elemento ISCR1, enquanto que aqueles do grupo 9 estiveram relacionados com ISEcp1. Concluindo, o principal mecanismo de resistência às quinolonas detectado foi a presença de substituições em GyrA e ParC, apesar de outros mecanismos, como a diminuição da expressão de porinas estarem envolvidos nas enterobactérias avaliadas. A associação da produção de ESBL foi significativa devido ao encontro de uma grande diversidade de genótipos circulando na comunidade, com uma predominância de enterobactérias produtoras de CTX-M. Quanto aos determinantes Qnr descritos neste estudo, que notoriamente foram os primeiros relatos no Brasil, somente dois deles apresentaram-se relacionados com a produção de ESBL. / The aim of this study was to investigate the main mechanisms of quinolone resistance among enterobacterial isolates recovered from hospitalized patients and outpatients in Brazil. The modification of the quinolone targets with changes of DNA gyrase and of topoisomerase IV genes and the presence of determinants codifying plasmid- mediated quinolone and oxymino- cephalosporins resistance were investigated. Two hundred fifty seven non-duplicate nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates recovered from January 2000 to May 2005 were analysed. Mutations in the topoisomerases gyrA and parC genes and the genetic structures surrounding Qnr and CTX-M determinants were recognized by PCR and sequencing. Conjugation experiments were performed to determine whether the qnr- and blaCTX-M carrying plasmids were self transferable. Also, decrease in the level of porin expression related to quinolone resistance was assessed. All enterobacterial isolates were resistant to nalidixic-acid, showing minimal inhibitory concentrations (MIC) 16 g/mL and 70% of these isolates showed decreased susceptibility to fluoroquinolone. Six qnrB-positive (2.3%) out of 257 nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates, were identified, including 3 Escherichia coli, 2 Klebsiella pneumoniae and 1 Citrobacter freundii. Five isolates had an identical qnrB2 sequence and one isolate, C. freundii 79, possessed the qnrB8. A single Enterobacter cloacae carrying a plasmid encoding qnrA gene was identified (0.37%). All isolates were negative for the qnrS genes. Plasmid-mediated quinolone resistance ranged from 55- to 180-kb in size. Sequence analysis of the genetic structures surrounding of the qnrA and qnrB genes identified an ISCR1 element at the left-hand boundary and a partial copy of the 3-end segment of class 1 integrons. Concerning the changes of DNA gyrase and topoisomerase IV, the most common modification in the enterobacterial isolates analyzed were present at codons 83 and 87 in GyrA and in ParC at codons 80 and 84. All isolates that exhibited mutations in gyrA gene showed nalidixic-acid MIC 16 µg/mL. The finding of different MIC values to fluoroquinolones in enterobacterial isolates with the same GyrA and ParC modification was explained by a decreasing in the level of porin expression. Regarding -lactam resistance mechanisms, twenty four (9.3%) ESBL-producing enterobacterial isolates were detected. Sequencing of the CTX-M-encoding genes identified 18 determinants belonging to CTX-M-2 (n=13), CTX-M-8 (n=2) and CTX-M-9 (n=3) groups. CTX-M-2 group determinants included blaCTX-M-2 and the two novel variants. Plasmids harboring blaCTX-M genes ranged from 48- to 180- kb in size and were not transferable, in their majority. The blaSHV-5 genes were detected in all the 6 blaCTX-M negative isolates. All alleles belonging to the group 2 were associated with ISCR1 element, while all blaCTX-M-9 genes were related to ISEcp1 element. In conclusion, alterations in the targets of quinolones, GyrA and ParC was the main mechanism of quinolone resistance identified in this study, although a decreasing of the porins expression had been identified among nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates. In the surveyed area, the prevalence of ESBL producers was important (9.3%), provided that this finding was related to a large diversity of genotypes circulating in the community, mainly CTX-M-producing isolates. This study constituted the first epidemiological survey of QnrA and QnrB determinants among Brazilian isolates. Interestingly, the qnrB2 gene was identified in non ESBL producers isolates and qnrS genes were not found.

Este estudo foi elaborado com o objetivo de elucidar os mecanismos de resistência às quinolonas presentes em enterobactérias isoladas de pacientes de duas regiões metropolitanas brasileiras. Foram avaliadas possíveis alterações nas proteínas relacionadas com o sítio de ação das quinolonas, bem como a presença de plasmídeos e integrons que carregam determinantes gênicos que codificam resistência às quinolonas. A associação destes com mecanismos plasmideais de resistência aos antibióticos -lactâmicos também foi analisada. Foram avaliadas 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico isoladas de pacientes hospitalizados e da comunidade no período de 2000 a 2005. Por PCR e seqüenciamento, foram analisadas as mutações presentes nos genes cromossômicos gyrA e parC e as estruturas gênicas associadas com determinantes plasmideais de resistência às quinolonas, Qnr, e aos -lactâmicos de amplo espectro. Foram determinados os perfis plasmideais e a transferabilidade dos plasmídeos que carrearam estes determinantes. A extração e a análise das proteínas de membrana externa foi realizada para avaliar uma possível perda ou diminuição da expressão de porinas, também relacionada com os mecanismos de resistência avaliados. Todas as amostras foram resistentes ao ácido nalidíxico, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) superior a 16 g/mL, e em média, 70% apresentaram diminuição de sensibilidade às fluoroquinolonas testadas. De 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico, em seis enterobactérias (2,3%), incluindo 3 E. coli, 2 K. pneumoniae e 1 C. freundii foi encontrado o gene qnrB. Cinco linhagens apresentaram suas seqüências idênticas ao gene qnrB2, e uma linhagem, C. freundii JF79, apresentou uma seqüência idêntica ao gene qnrB8. Em uma linhagem de E. cloacae foi detectado o gene qnrA1 (0,37%). Os genes qnrA e qnrB apresentaram-se localizados em plasmídeos que apresentaram de 55 a 180 kilobases. A análise da estrutura gênica indicou que os genes qnrA1 e qnrB2 estavam associados com um integron classe 1 e localizados entre o elemento ISCR1 e a segunda cópia do segmento conservado 3. Na coleção bacteriana avaliada, as principais mutações observadas foram nos códons 83 e 87 em gyrA, e nos códons 80 e 84 em parC. Todas as enterobactérias que exibiram unicamente mutações no gene gyrA apresentaram CIM 16 µg/mL para o ácido nalidíxico. A diferença encontrada nos valores da CIM de fluoroquinolonas em enterobactérias que apresentaram as mesmas substituições em GyrA e ParC foi explicada pela ausência ou diminuição da expressão de porinas. Em relação à produção de -lactamase de espectro ampliado (ESBL), sua presença foi comprovada em 24 (9,3%) enterobactérias. O seqüenciamento de blaCTX-M identificou 18 determinantes: CTX-M-2 (n=13), incluindo dois novos variantes, CTX-M-8 (n=2) e CTX-M-9 (n=3) mediados por plasmídeos de 48 a 180 kilobases, não conjugativos, em maioria. O gene blaSHV-5 foi detectado em seis enterobactérias. Todos os determinantes do grupo 2 apresentaram-se associados com um elemento ISCR1, enquanto que aqueles do grupo 9 estiveram relacionados com ISEcp1. Concluindo, o principal mecanismo de resistência às quinolonas detectado foi a presença de substituições em GyrA e ParC, apesar de outros mecanismos, como a diminuição da expressão de porinas estarem envolvidos nas enterobactérias avaliadas. A associação da produção de ESBL foi significativa devido ao encontro de uma grande diversidade de genótipos circulando na comunidade, com uma predominância de enterobactérias produtoras de CTX-M. Quanto aos determinantes Qnr descritos neste estudo, que notoriamente foram os primeiros relatos no Brasil, somente dois deles apresentaram-se relacionados com a produção de ESBL. / The aim of this study was to investigate the main mechanisms of quinolone resistance among enterobacterial isolates recovered from hospitalized patients and outpatients in Brazil. The modification of the quinolone targets with changes of DNA gyrase and of topoisomerase IV genes and the presence of determinants codifying plasmid- mediated quinolone and oxymino- cephalosporins resistance were investigated. Two hundred fifty seven non-duplicate nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates recovered from January 2000 to May 2005 were analysed. Mutations in the topoisomerases gyrA and parC genes and the genetic structures surrounding Qnr and CTX-M determinants were recognized by PCR and sequencing. Conjugation experiments were performed to determine whether the qnr- and blaCTX-M carrying plasmids were self transferable. Also, decrease in the level of porin expression related to quinolone resistance was assessed. All enterobacterial isolates were resistant to nalidixic-acid, showing minimal inhibitory concentrations (MIC) 16 g/mL and 70% of these isolates showed decreased susceptibility to fluoroquinolone. Six qnrB-positive (2.3%) out of 257 nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates, were identified, including 3 Escherichia coli, 2 Klebsiella pneumoniae and 1 Citrobacter freundii. Five isolates had an identical qnrB2 sequence and one isolate, C. freundii 79, possessed the qnrB8. A single Enterobacter cloacae carrying a plasmid encoding qnrA gene was identified (0.37%). All isolates were negative for the qnrS genes. Plasmid-mediated quinolone resistance ranged from 55- to 180-kb in size. Sequence analysis of the genetic structures surrounding of the qnrA and qnrB genes identified an ISCR1 element at the left-hand boundary and a partial copy of the 3-end segment of class 1 integrons. Concerning the changes of DNA gyrase and topoisomerase IV, the most common modification in the enterobacterial isolates analyzed were present at codons 83 and 87 in GyrA and in ParC at codons 80 and 84. All isolates that exhibited mutations in gyrA gene showed nalidixic-acid MIC 16 µg/mL. The finding of different MIC values to fluoroquinolones in enterobacterial isolates with the same GyrA and ParC modification was explained by a decreasing in the level of porin expression. Regarding -lactam resistance mechanisms, twenty four (9.3%) ESBL-producing enterobacterial isolates were detected. Sequencing of the CTX-M-encoding genes identified 18 determinants belonging to CTX-M-2 (n=13), CTX-M-8 (n=2) and CTX-M-9 (n=3) groups. CTX-M-2 group determinants included blaCTX-M-2 and the two novel variants. Plasmids harboring blaCTX-M genes ranged from 48- to 180- kb in size and were not transferable, in their majority. The blaSHV-5 genes were detected in all the 6 blaCTX-M negative isolates. All alleles belonging to the group 2 were associated with ISCR1 element, while all blaCTX-M-9 genes were related to ISEcp1 element. In conclusion, alterations in the targets of quinolones, GyrA and ParC was the main mechanism of quinolone resistance identified in this study, although a decreasing of the porins expression had been identified among nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates. In the surveyed area, the prevalence of ESBL producers was important (9.3%), provided that this finding was related to a large diversity of genotypes circulating in the community, mainly CTX-M-producing isolates. This study constituted the first epidemiological survey of QnrA and QnrB determinants among Brazilian isolates. Interestingly, the qnrB2 gene was identified in non ESBL producers isolates and qnrS genes were not found.

The degree of DNA supercoiling in the cell is carefully controlled by DNA topoisomerases. These enzymes catalyze the passage of individual DNA strands (Type I DNA topoisomerases), or double helices (Type II DNA topoisomerases) through one another. The purpose of the present study is to conduct a detailed analysis of the topo llα and β mRNAs expressed in several vertebrate cell lines. The final aim of this project is to analyze the relative roles of topo llα in chromatin condensation and chromosome segregation during mitosis, by performing topo llα gene targeting experiments in the DT 40 chicken lymphoblastoid cell line. The knock-out strategy was based on the observation of a high rate of homologous recombination versus random integration in the DT40 cell line. The topo llα gene was shown to be located on the chicken chromosome 2 (APM unpublished), for which the DT40 cell line is trisomic. The targeting vector completely replaced the 32 kb topo IIα genomic locus, generating a topo llα (-/+/+)cell line, which showed an increased resistance to topo II inhibitors. Paradoxically, 150 uM etoposide or 100 uM mitoxanthrone induced apoptosis within 5 hours in the topo llα (-1+1+) cell line, more rapidly as compared to the normal DT 40 cells. A topo IIα (-I-I+) cell line has also been generated. This study revealed the presence of evolutionarily conserved alternatively spliced forms of both topo llα and β isoforms between birds and humans. Hybridization screening of two chicken cDNA libraries, MSB-1 and DU249, revealed the presence of two distinct forms of both topo llα and β cDNAs. One form of topo llα, designated topo llα-1, encodes the chicken topo llα amino acid sequence previously reported (dbjiAB007445) in the database (unpublished). The second form, designated topo llα-2, encodes a protein containing an additional 35 amino acids inserted after Lysine-322 of chicken topo IIα-1 protein sequence. In the case of topo 11(3 mANA, one form, designated topo IIβ-1, encodes the protein already described (dbjiAB007446). The second form, tapa IIβ-2, would encode a protein missing the next 86 amino acids after Valine-25 in tapa II β-1 protein sequence. The tapa 11β variant is positioned similarly to one previously described in human (Hela) cells. The 5 amino acid insertion in the human tapa 11β-2 variant follows v23. In chicken cells, a longer insertion of 86 amino acids sequence follows v25, the homologous position in the tapa 11β protein. In human cells, the situation with tapa llα is more complex, as revealed by RT-PCR experiments (APM, unpublished) which generated several bands. One of these amplified species was found to contain a 36 amino acids insertion, positioned after residue K321 in the human tapa IIα cDNA, similarly to chicken tapa IIα-2 variant. The second human tapa llα spliced form cDNA was shown to contain a 26 amino acids insertion after residue A401 in the canonical human tapa llα protein sequence. The third cDNA variant isolated from human cells was described to encode a 81 amino acids insertion after residue Q355 positioned within the known human tapa IIα protein. It appears possible that the posttranslational modifications of the a-2 and β-2 isoforms may differ substantially from those of the canonical a-1 and β-1 isoforms. Such variant proteins could fulfil specialized functions, which might be tissue or cell-type specific. In summary, two novel forms of tapa llα and β cDNAs have been identified in three chicken cell lines. These spliced versions of both tapa llα and 13 isoforms seem to be evolutionary conserved, with similar forms occurring in their human counterparts. Future functional analysis of vertebrate tapa IIα and β will have to account for the existence of these novel isoforms, which might encode proteins that may exhibit different regulation of their subcellular localization, interaction with other proteins, or catalytic activity.

published_or_final_version / Chemistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

Thesis (M.S.)--Rutgers University, 2009. / "Graduate Program in Microbiology and Molecular Genetics." Includes bibliographical references (p. 49-53).

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