As anfetaminas compreendem uma série de compostos com estrutura química semelhante à feniletilamina e que apresentam atividade estimulante do sistema nervoso central. Além de substâncias anorexígenas como o femproporex e a dietilpropiona, também estão incluídas nessa classe drogas ilícitas como a metanfetamina (ice, speed) e a metilenodioximetanfetamina (MDMA, ecstasy). Essas substâncias apresentam grande potencial de abuso, podendo ser utilizadas por diversos grupos sociais como motoristas profissionais (onde são conhecidas por \"rebite\"), estudantes, jovens (utilizando ecstasy em festas denominadas \"raves\") e pessoas que abusam de moderadores de apetite para o controle de peso. Interessantemente, há também a possibilidade de alguns indivíduos utilizarem anfetaminas em associação com benzodiazepínicos. Embora a comercialização dos derivados anfetamínicos tenha sido proibida no Brasil desde 2011, é de conhecimento que algumas pessoas ainda utilizam anorexígenos e recorram ao uso concomitante com benzodiazepínicos como forma de controlar a insônia provocada pelas anfetaminas. Outra situação de uso das duas substâncias ao mesmo tempo seria a de motoristas profissionais, usuários de \"rebite\", que também tentariam controlar os ciclos de sono utilizando benzodiazepínicos. Em vista dessa situação, seria interessante o monitoramento do uso desses grupos de fármacos através de análises toxicológicas. As análises toxicológicas convencionais (realizadas sobremaneira em sangue e urina) geralmente fornecem uma pequena janela de detecção, o que faz com que o uso intermitente possa não ser detectado. Quando se deseja informação de uso em longo prazo ou ainda sobre os padrões de uso de determinada droga, a matriz mais eficiente para realização das análises é o cabelo. No presente projeto, métodos analíticos foram desenvolvidos visando a detecção de fármacos da classe das anfetaminas (anfetamina, metanfetamina, MDMA, MDA e femproporex) e benzodiazepínicos (diazepam, nordiazepam, clordiazepóxido, oxazepam, clonazepam e temazepam) em amostras de cabelo. A microextração em fase líquida (LPME) e a extração em fase sólida (SPE) foram utilizadas como técnicas de preparação de amostras. Os analitos de interesse foram identificados por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). Após o desenvolvimento, otimização e validação, os métodos foram aplicados em amostras reais de voluntários suspeitos de utilizar alguma das substâncias em estudo, provenientes de um centro para tratamento de dependência química. Os resultados obtidos com a aplicação dos métodos mostraram sua eficácia para o fim que se destinam. / Amphetamines are a class of compounds with chemical structures similar to phenylethylamines that present stimulant activity in the central nervous system. Anorectic drugs such as fenproporex and diethylpropion and some illicit drugs as methamphetamine (ice, speed) and metilenodioximetamphetamine (MDMA, ecstasy) are also included in this class. These substances have a high abuse potential, and they can be used by various social groups, for example, professional drivers (who call them \"rebites\"), young students (using ecstasy in \"rave\" parties) and people who abuses anorectics to weight control. Interestingly, there is also a possibility of some people using anorectics and benzodiazepines in association. Although the commercialization of amphetamine derivatives has been recently banned in Brazil (2011), it is known that some people still use anorectic drugs and benzodiazepines to control insomnia induced by amphetamines. Another case of concomitant use would be professional drivers, who use \"rebites\", which also try to control their sleep cycles using benzodiazepines. Because of this situation, it would be interesting to monitoring the use of these drugs by toxicological analysis. The conventional toxicological analyses (performed in most cases in blood and urine) generally provide small window detection. In this case, intermittent drug use may not be detected. When long term information about drug use is needed, the most efficient matrix to carry out the analysis is hair. In this project, analytical methods were developed for the determination of amphetamines (amphetamine, methamphetamine, MDMA, MDA and fenproporex) and benzodiazepines (diazepam, nordiazepam, chlordiazepoxide, oxazepam, clonazepam and temazepam) in hair samples. Liquid-phase microextraction (LPME) and solid phase extraction (SPE) were used as sample preparation techniques in these methods. Analites were identified by gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS). After the development, optimization and validation, the methods were applied in hair samples collected from patients of a drug rehabilitation clinic. The results obtained with the application of the developed methods showed their efficacy for the intended purpose.

Os praguicidas podem ser responsáveis por intoxicações exógenas intencionais ou não intencionais, tanto em seres humanos como em animais, em virtude de sua ampla toxicidade e fácil obtenção do produto, nem sempre por vias legais. O carbofurano é um praguicida carbamato amplamente utilizado no Brasil, como inseticida e nematicida, para o controle de pragas agrícolas; é comercializado na forma de grânulos, vulgarmente conhecido como “chumbinho”. Esse praguicida em animais superiores inibe a enzima acetilcolinesterase, promovendo efeitos tóxicos que podem levar a óbito. Considerando que o carbofurano poderia estar implicado com quadros intoxicações exógenas de animais, no presente estudo se propôs desenvolver e validar um método analítico para detectar e/ou quantificar esse praguicida e seu metabólito, 3-hiroxicarbofurano, em matrizes biológicas de diferentes espécies animais por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD), a fim de utilizá-lo no Laboratório de Diagnóstico Toxicológico (LADTOX) do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP). Para desenvolver esse método foram utilizadas amostras biológicas proveniente de fragmentos de, no mínimo, seis animais diferentes, de espécies distintas (cão, gato, porco, boi, rato, camundongo e ave), isentas de suspeita de intoxicação. Realizou-se a fortificação dessas amostras biológicas, previamente homogeneizadas, com soluções contendo o praguicida e seu metabolito, 3-hidroxicarbofurano, em 6 níveis de fortificação que variaram de 6,25 a 100 µg/mL. Avaliaram-se os seguintes parâmetros para validação do método: seletividade, efeito matriz, precisão, exatidão, curva de calibração e efeito residual, limite de detecção (LD) e limite inferior de quantificação (LIQ). Para estabelecer a seletividade do método, verificou-se as respostas de picos interferentes próximo ao tempo de retenção dos analitos, as quais foram inferiores a 20% da resposta do analito nas amostras do LIQ. Quanto ao efeito matriz, não houve interferência relevante entre as matrizes analisadas. Em relação a precisão e exatidão do método, foi possível observar que o coeficiente de variação (CV) e o erro padrão relativo (EPR) não excederam ao limite máximo de 15%. Considerando a curva de calibração, o coeficiente de correlação (r2) apresentou valores iguais ou superiores que 0,99 nas diferentes matrizes para o carbofurano, enquanto para o 3-hidroxicarbofurano duas matrizes (fígado e conteúdo estomacal) apresentaram o valor de 0,98 e as demais superior a 0,99. A extração líquido-líquido forneceu valores de recuperação entre 74,29 a 100,1% para o carbofurano e entre 64,72 a 100,61% para o 3-hidroxicarbofurano, sendo o LIQ de 6,25 µg/mL. Conclui-se que o método se mostrou adequado para identificar e quantificar o carbofurano e seu metabólito em amostras biológicas, apresentando sensibilidade e seletividade adequadas, e os parâmetros de validação encontram-se de acordo com os limites sugeridos para validação de métodos bioanaliticos, sendo, assim, implantado no LADTOX / Pesticides are responsible for intentional or unintentional exogenous poisoning, in both humans and animals, because of their broad toxicity and prompt availability, not always legally. Carbofuran is a carbamate pesticide widely used in Brazil as an insecticide and nematicide for the control of agricultural pests. It is marketed in the form of beads, commonly known as "pellet". This pesticide inhibits acetylcholinesterase enzyme on higher animals, promoting toxic effects, which can lead to death. Considering that carbofuran could be implicated in cases of exogenous poisoning of animals, in the present study we aimed to develop and validate an analytical method for detecting and/or quantifying this pesticide and its metabolite, 3-hiroxicarbofuran, in biological matrices of different animal species by high performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) in order to use it in the Toxicology Diagnostics Laboratory (LADTOX) of the Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science (FMVZ), University of São Paulo (USP). To develop this method biological samples obtained from fragments of at least six different animals of different species (dog, cat, pig, ox, rat, mouse and bird), free from suspicion of poisoning. Biological samples were fortified with previously homogenized solutions containing the pesticide and its metabolite, 3-hidroxicarbofurano, in 6 fortification levels ranging from 6.25 to 100 µg/mL We evaluated the following parameters for method validation: selectivity, matrix effects, precision, accuracy, calibration curve and residual effect, limit of detection (LOD) and lower limit of quantitation (LLQ). To establish selectivity of the method, we verified the responses of interfering peaks near the retention times of analytes, which were less than 20% of the analyte response in LLQ samples. As to matrix effects, there was no significant interference between the matrices analyzed. Regarding the precision and accuracy of the method, it was observed that the coefficient of variation (CV) and the relative standard error (RSE) did not exceed the ceiling of 15%. In regard to the calibration curve, the correlation coefficient (r2) presented values that equal or exceed 0.99 in different arrays to carbofuran, while for the 3-hidroxicarbofuran two arrays - liver and stomach contents - had a value of 0.98 while the remaining matrices 0,99. The liquid-liquid extraction recovery values varied between 74.29 to 100.1% for carbofuran and between 64.72 to 100.61% for 3-hidroxicarbofuran, and LOQ of 6.25 µg/ml. We concluded that the method was adequate to identify and quantify carbofuran and its metabolite in biological samples, with adequate sensitivity and selectivity, and the validation parameters are in accordance to the suggested limits for validation of bioanalytical methods, and, thus implanted in LADTOX

As intoxicações letais, via de regra, estão comumente relacionadas com a área médico-legal; alguns agentes tóxicos ocupam lugar de destaque como os principais responsáveis pela ocorrência desses óbitos. Em medicina legal, tanto humana quanto animal, o grande desafio enfrentado é a elucidação da causa mortis e do tempo da ocorrência da morte quando os cadáveres são encontrados, indicando possível exposição aos agentes tóxicos, os quais são adicionados intencionalmente, na maior parte das vezes, com a finalidade de causar danos irreversíveis à vítima. No último relatório do Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX), no ano de 2012, foram relatadas no Brasil 102.854 intoxicações envolvendo seres humanos e animais, sendo que desse total 1.199 (1,17%) intoxicações foram relatadas em animais. Dentre os principais agentes responsáveis por intoxicação, tanto em seres humanos, como em animais, estão os praguicidas e, em particular, os nticolinesterásicos, sendo importante causa de óbitos intencionais e não intencionais em animais. Métodos de análises toxicológicas envolvendo intoxicações em seres humanos são amplamente estudados e divulgados, o que é menos usual na medicina veterinária legal. Portanto, a existência de laboratórios que atendam as legislações relacionadas as análises toxicológicas forenses, bem como a pesquisa das características da forma de apresentação e do potencial toxicológico dos anticolinesterásicos e o desenvolvimento e validação de técnicas analíticas mais sofisticadas se fazem necessária e contribuirão para os avanços nesse aspecto forense da toxicologia veterinária. Assim, o presente trabalho foi distribuído em quatro capítulos distintos. No primeiro capítulo discute-se o recebimento de amostras e um modelo de formulário de Requisição de Análise Toxicológica num laboratório veterinário de análises toxicológicas que recebe amostras biológicas de interesse forense. O segundo capítulo apresenta a possibilidade de utilização de uma técnica enzimática com a finalidade de avaliar o potencial de inibição dos praguicidas anticolinesterásicos; o método se mostrou eficiente para avaliar a inibição da atividade da acetilcolinesterase (AChE) causada pelo aldicarbe e pelo seu metabólito, o aldicarbe-sulfona. O terceiro capítulo trata-se do teste de dissolução in vitro da forma acabada do grânulo comercial do praguicida aldicarbe (Temik 150®), a fim de avaliar a cinética de liberação do princípio ativo tóxico, bem como a cinética de formação dos seus principais metabólitos ativos, considerando que cães e gatos encontrados mortos com suspeita de intoxicação exógena apresentam chumbinho no conteúdo estomacal. O perfil de dissolução dos grânulos do Temik 150® em meio ácido foi capaz mostrar a presença in vitro dos metabólitos aldicarbe-sulfóxido e o aldicarbe-sulfona, o que não ocorre quando apenas o princípio ativo passou pelo mesmo perfil de dissolução, mostrando que essa forma disponível no comércio contribui para a toxicidade deste praguicida. O quarto capítulo apresenta o desenvolvimento de um método para determinação de praguicidas anticolinesterásicos, bem como os seus produtos biotransformados em diversas matrizes biológicas, baseada em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por arranjo de diodos (DAD). Foi, então, desenvolvido e validado um método de extração e identificação de praguicidas anticolinesterásicos em matrizes biológicas, cujas figuras de mérito atendem a RDC 27 de 2012 da ANVISA (Brasil, 2012). O método permitiu a extração e identificação de aldicarbe e seus metabólitos (aldicarbe-sulfóxido e aldicarbe-sulfona), carbofurano e seu metabólito (3-OH carbofurano), forato e seu metabólito (forato-sulfóxido) e aldicarbe. Esse método foi aplicado em amostras reais encaminhadas ao Laboratório de Diagnóstico Toxicológico (LADTOX) e se mostrou eficiente para identificação de aldicarbe / Lethal poisonings, as a rule, are commonly related to the forensic area; some toxic agents are commonly found as the main agent responsible for these deaths. In forensic medicine, both human and animal, the major challenge faced is the elucidation of cause of death and the time elapsed when the bodies are found, indicating possible exposure to toxic agents, which are intentionally added, most of the times in order to cause irreversible damage to the victim. In the latest report of the Toxic-Pharmacologic National Information System (SINITOX) in the year 2012, 102 854 poisonings involving humans and animals were reported in Brazil, and of this total 1,199 (1.17%) poisonings have been reported in animals. Among the main agents responsible for toxicity, both in humans and in animals, pesticides are common and, in particular, cholinesterase inhibitors, which is important because of intentional and unintentional deaths in animals. Methods of toxicological analyzes involving poisoning in humans are widely studied and published, but less so in legal veterinary medicine. Therefore, the existence of laboratories that meet the legislation related to forensic toxicological analysis and research of the characteristics of the presentation and toxicological potential of cholinesterase inhibitors and the development and validation of more sophisticated analytical techniques are necessary and can contribute to advances in the forensic aspect of veterinary toxicology. Thus, this work was distributed into four distinct chapters. The first chapter discusses the receipt of samples and a Request Form template for Toxicological analysis in a Toxicological analysis veterinary laboratory that receives biological samples of forensic interest. The second section presents the possibility of using an enzymatic technique in order to assess the potential inhibition of cholinesterase inhibitors pesticides; the method was efficient to evaluate the inhibition of the activity of acetylcholinesterase (AChE) caused by aldicarb and its metabolite, aldicarb sulfone. The third chapter it is the in vitro dissolution test of the finished form of commercial bead pesticide aldicarb (Temik 150®) in order to assess the kinetics of release of toxic active ingredient, as well as the formation kinetics of its main metabolites assets, whereas dogs and cats found dead with suspected exogenous intoxication present \"pellets\" in the stomach contents. The dissolution profile of the Temik 150® beads in acid was able to show the presence of in vitro metabolites aldicarb sulfoxide and aldicarb sulfone, which does not occur when only the active ingredient went through the same dissolution profile, showing that this market-available form contributes to the toxicity of this pesticide. The fourth chapter presents the development of a method for determining cholinesterase inhibitors pesticides, as well as their biotransformation products in various biological matrices, based on high-performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detection (DAD).Then, a method of extraction and identification of anticholinesterase pesticides in biological matrices was developed and validated, meeting current standards RDC 27, 2012 ANVISA (Brazil, 2012). The method allowed the extraction and identification of aldicarb and its metabolites (aldicarb sulfoxide and aldicarb sulfone), carbofuran and its metabolite (3-OH carbofuran), phorate and its metabolite (phorate sulfoxide) and aldicarb. This method was applied to real samples sent to the Toxicology Laboratory Diagnostics (LADTOX) and was efficient in aldicarb identification

Apesar da ampla demonstração do potencial tóxico do benzeno ao sistema imune, os mecanismos envolvidos nos seus diferentes efeitos não estão totalmente esclarecidos. Desta forma, o presente trabalho avaliou a mobilização e função de leucócitos polimorfonucleares (PMN) na vigência de resposta inflamatória aguda em ratos expostos a metabólitos do benzeno. Ratos Wistar, machos foram tratados por período de tempo prolongado (50 mg/kg; i. p.; 1 uma vez ao dia, 13 ou 16 doses diárias com intervalos de 2 dias a cada 5 doses) com hidroquinona (HQ), fenol (FE) ou veículo. As respostas inflamatória inata ou adquirida foram induzidas 24 hs após a última dose dos tratamentos. Para avaliar a intensidade de intoxicação, um método analítico foi padronizado para a extração de HQ e FE da urina dos animais por microextração em fase sólida, para subseqüente análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. Os dados da validação mostraram que a técnica analítica é adequada, e a análise das amostras demonstrou o aumento na concentração urinária de HQ, FE e catecol (CAT) em urina dos ratos expostos, confirmando assim a exposição ao FE ou a HQ. A avaliação da resposta inflamatória inata demonstrou que o tratamento com HQ acarretou aumento acentuado no influxo de PMN para a cavidade inflamada. A análise do leucograma mostrou que o tratamento com HQ promoveu neutrofilia, que pode ser decorrente da mobilização destas células da medula, uma vez que número menor de células segmentadas na última etapa de maturação foi encontrado nestes animais. No entanto, durante a vigência de resposta inflamatória, a neutrofilia esperada para este processo não foi detectada nestes animais. Espécies reativas de nitrogênio podem participar dos efeitos aqui detectados em animais tratados com HQ, já que valores aumentados de óxido nítrico (NO) foram mensurados no sangue após o tratamento e no exsudato inflamatório. Diferentemente da exposição à HQ, a administração de FE não alterou a migração de PMN para o foco de lesão na vigência de reposta inflamatória aguda inata. Apesar do tratamento com FE ter acarretado linfocitopenia, a produção das células brancas no compartimento medular e a leucocitose em resposta ao processo inflamatório foram equivalentes ao encontrado em animais controles. No que concerne à resposta inflamatória alérgica, ambos os tratamentos inibiram o influxo de leucócitos para o lavado bronco-alveolar (LBA) e para o tecido pulmonar. A investigação dos mecanismos envolvidos que a exposição à HQ interfere com a síntese de imunoglobulina E e, eventualmente, com a desgranulação de mastócitos. Por outro lado, a exposição ao PHE não alterou estes parâmetros. Em conjunto, os dados aqui apresentados sugerem que os tratamentos com HQ ou FE provocam efeitos distintos na gênese de respostas inflamatórias de diferentes origens quanto à migração leucocitária, e que os mecanismos envolvidos com a imunotoxicidade induzida pelo benzeno é altamente complexa. / Despite toxicity of benzene has been fully demonstrated, the mechanisms involved on its immunotoxicity are not fully comprehended. Then, the present work studied the mobilization and functions of polymorphonuclear cells (PMN) during acute inflammatory reactions in rats exposed to benzene metabolites. Male Wistar rats were treated with hydroquinone (HQ) or phenol (Phe) for prolonged period of time (50 mg/Kg; i.p.; once a day, 13 or 16 doses, 2 days intervals after each 5 doses). Innate or acquired inflammatory reactions were carried out 24 hours after the last dose of treatments. Animals treated with vehicle were employed as control. In order to determine the intensity of intoxications, an extraction method was developed in urine using a solid phase micro-extraction fiber. The subsequent analysis was performed on gas chromatography coupled to mass spectrometry. Data from validation showed the adequacy of methodology and demonstrated the presence of HQ, PHE and CAT in urine from exposed rats, corroborating the exposition to PHE or HQ. The evaluation of innate inflammatory reaction showed that HQ exposition promoted increment on the number of PMN cells to inflamed area. The leucogram demonstrated that treatment evoked neutrophilia, probably due to mobilizations of segmented cells in the last phase of maturation from bone marrow. However, during the inflammatory process, the characteristic neutrophilia was not detected. Nitrogen reactive species may participate of the intoxication, since elevated values of nitric oxide (NO) were found in blood after intoxication and in inflammatory exudates. Differentially from HQ exposition, administrations of PHE did not alter the migration of PMN into inflammatory focus. Despite the treatment promoted reductions on number of lymphocytes, the production of white cells on bone marrow and the neutrophilia during and inflammatory process were equivalent to those found in control animals. Regarding acquired inflammation, both treatments significantly inhibited the influx of leukocytes to bronchoalveolar fluid. This pattern of response did not reflect the accumulation of PMN cells on pulmonary tissue, since the myeloperoxidase activity was not higher when compared to control rats. The investigations of the mechanisms involved in the inhibited leukocyte recruitment, showed that HQ treatment probably impairs the immunoglobulin E synthesis and mast cell degranulation. On the other hand, FE exposition did not present these effects. Together, data herein suggest that HQ or PHE treatments promete singular effects on PMN recruitment during inflammatory reactions elicited by different agents, and the complexity of mechanisms responsible for the immunotoxicity induced by benzene.

As microcistinas constituem uma família de heptapeptídeos cíclicos com cerca de 70 variantes caracterizadas. São biossintetizadas em condições específicas por cianobactérias, principalmente em corpos d\'água eutrofizados. Apresentam organotropismo ao fígado e DL50 entre 50-500 µg.kg-1 peso (rato, i.p.). A exposição aguda pode impactar a saúde humana ao desarranjar o parênquima hepatocelular por hiperfosforilação do citoesqueleto e produzir intenso sangramento, podendo levar à morte por choque hipovulêmico um homem adulto e são promotoras tumorais, quando ocorre exposição crônica, por inibição de fosfatases 1 e 2A. Os congêneres das microcistinas apresentam toxicidades distintas e é importante caracterizá-los em corpos d\'água para se estimar o risco à saúde humana. Na literatura, não há convergência quanto à forma de extração das toxinas, preparo das amostras para análise e condições cromatográficas para o isolamento e quantificação. Neste trabalho, diversas análises foram conduzidas para se determinar as melhores formas de extração das toxinas, clean up da amostra e condições cromatográficas para amostras de campo ou cultura de cianobactérias. A extração hidro-alcoólica (MeOH:H2O, 3:1, v/v) parece ser a melhor forma de extração, seguida de partição líquido-líquido para amostras de campo (florações) e extração em fase sólida (cartuchos C18) para algas cultivadas em laboratório. Por meio de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detectores UV-VIS e pela análise do padrão de fragmentação das moléculas por espectrometria de massas (MS) com ionização por eletrospray em Tandem (ESI-MS/MS) determinou-se a presença das variantes de microcistinas MC-RR, MC-LR, MC-YR e MC-hRhR na amostra de água do Reservatório Billings e [Asp3]MC-LR na cepa Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. Este método parece ser adequado para a extração e caracterização de microcistinas presente em corpos d\'água e em cultura de laboratório e a variante MC-hRhR foi caracterizada pela primeira vez na literatura mundial. / It is well known that eutrophicated lakes and water reservoirs can be a serious concern to wildlife, domestic livestock and human health since cyanobacterial blooms are prone to occur. Some cyanobacteria (blue-green algae) species which form bloom may biosynthesize a family of hepatotoxic peptides named microcystins under certain circumstances, related specially to nitrogen: phosphorus ratio, temperature, pH and light intensity of the water body. There are at least 70 variants of microcystins with different toxicity, DL50 ranging from 50 to 500 µg.kg-1 (in mouse, i.p.). Acute exposure provoke hyperphosphorylation of the cytoskeleton, in liver cells, leading to cellular disruption with haemorrhage and the long term exposure can cause tumor promotion by inactivation of serine/threonine phosphatases 1 and 2A (PP1 and PP2A). Therefore, it is very important to determine and quantify microcystin variants present in water reservoirs. There are several methods available to evaluate qualitative and quantitatively microcystin and its variants in water reservoir and estimate human risks. Such methods comprise biological, biochemical and physico-chemical assays. In this work, we have isolated and analyzed hepatotoxins by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with photodiode array (PDA) detector and their structures were elucidated by Tandem - MS/MS with eletrospray ionization (ESI-MS/MS). MC-RR, MC-LR, MC-YR and MC-hRhR were determined in samples collected at Billings reservoir and [Asp3]MC-LR was found in the strain Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. The procedures developed herein can be a powerful tool for isolation and determination of microcistin and its derivatives founded in water reservoirs. Also, we have described for the first time a new variant of microcistin: MC-hRhR.

Foram desenvolvidos métodos de determinação de urina e trítio em urina. Para o urânio foi adaptada a técnica de análise por fluorimetria em meio sólido. O limite de sensibilidade foi de 5. 10-4µg U/0,1 ml e o erro foi de cerca de 10% para concentrações em torno de 0,05 µg U/0,1 ml. Foi padronizado para o trítio o método de análise por cintilação em meio líquido. O método determina quantidades de trítio até pelo menos 8,10-3µCi/ml e o erro foi de cerca de 4% para concentrações de trítio em torno de 0,34 µCi/l. Depois de adaptadas, as técnicas foram aplicadas a amostras de urinas de trabalhadores expostos a compostos de urânio ou trítio com a finalidade de verificar possível contaminação interna por estes radioisótopos. / Abstract not available.

Development and validation of methods for analysis of several drugs or their metabolites are decribed in this thesis. The document is presented as a commentary to the original papers, which were published in peer reviewed journals. Discussion on the optimization of each method is presented and covers also method development and influence of preanalytical aspects. Additionally, examples of the application of the developed methods in clinical pharmacology and toxicology are shown. This dissertation consists of three parts: enantiomeric determination of tramadol and its metabolite, determination of some antihypertensive drugs, and qualitative analysis of benzodiazepines. Development of a method for chiral analysis of tramadol and its desmethylated metabolite O- desmethyltramadol (ODT) in human urine and plasma is described in the first part of the thesis. Tramadol is a centrally acting analgetic drug, which is used as racemate in clinical practise. Each enantiomer displays different binding properties for various receptors: (+)-tramadol preferentially inhibits serotonin reuptake while (-)-tramadol mainly inhibits noradrenalin reuptake. (+)-tramadol is considered 10-times more potent than (-)-tramadol. Major active metabolite (ODT), which is considered to be the main agent responsible for the...

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-16T19:32:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GuilhermeMachadoDoCarmo.pdf: 2147674 bytes, checksum: 6db50f6c5cba00b3abea6c659b4a8c51 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-16T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_GuilhermeMachadoDoCarmo.pdf: 2147674 bytes, checksum: 6db50f6c5cba00b3abea6c659b4a8c51 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / This study aimed to verify the stability and toxicological profile in Wistar rats of nanocapsules containing mangiferin (NCM). Three batches of NCM were produced and stored at three different temperatures (room temperature, 2 to 8 °C and 40 °C). Particle size, zeta potential, drug content and pH were analyzed (at 0, 15, 30, 60 days) in order to evaluate the stability. Regarding the toxicological profile, a subchronic treatment of 24 days was applied. Two administration routes (orally and intraperitoneally) were evaluated. The animals were divided into 5 groups (n=8). After the period of 24 days, the animals were killed, the blood was collected for hematological and biochemical analysis, the organs were removed for histological analysis. After the storage, it could be observed that NCM stored in room temperature and 2 - 8 °C remained with their original particle size, zeta potential, polydispersity index and pH for 60 days. NCM stored at 40 °C, it could be observed a significantly increase in the particle size after 15 days, however zeta power and polydispersity index remained unchanged. The hematological analysis showed a significant increase (p<0.001) in total leukocytes in the groups white nanocapsules (BNCs) and NCM, and a significant decrease (p<0.01) in hemoglobin concentration and hematocrit in the group NCM after the intraperitoneal administrations. The biochemical analysis showed a significant increase (p<0.001) in the serum levels of urea and a significant decrease (p<0.001) in the serum levels of uric acid in the groups BNCs and NCM after the intraperitoneal administration. The histological analysis showed that only the group BNCs presented an inflammatory infiltrate of lymphocytes in the liver. It was also observed an inflammatory process in the abdominal cavity of the groups BNCs and NCM, after intraperitoneal administration. It was not observed significant changes in hematological, biochemical and histological analysis after the oral administration. In conclusion, the treatment of NCM for oral route did not cause toxicity according to the evaluated parameters and was considered safe for the use during 24 day period. However, the intraperitoneal route was not appropriate for administrating Eudragit nanocapsules. / O objetivo deste estudo foi realizar a estabilidade e o perfil toxicológico em ratos Wistar de nanocápsulas com mangiferina (NCM). Foram produzidos três lotes de NCM e armazenado em temperaturas distintas (temperatura de 25 °C, temperatura de 2 a 8 °C e temperatura de 40 °C), o tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencia zeta, teor do fármaco e o pH foram analisados (0, 15, 30, 60 dias) para a avaliação da estabilidade. Para avaliar a o perfil toxicológico foi realizado um tratamento subcrônico de 24 dias. Para isto foi realizado o tratamento por duas vias de administração (via oral e via intraperitoneal), os quais foram divididos em 5 grupos com n=8. Após o período de 24 dias os animais foram mortos por decapitação, o sangue foi recolhido para as análises hematológicas e bioquímicas, os órgãos foram retirados para as analises histológicas. Após a realização da estabilidade foi observado que NCM armazenadas em temperatura de 25 °C e em temperatura de 2 a 8 °C mantiveram seus diâmetros de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta e pH ao longo do período analisado. Entretanto, NCM armazenadas em temperatura de 40 °C demonstraram um aumento significativo do tamanho de partícula após 15 dias a sua produção e mantiveram inalterados o índice de polidispersão, o potencial zeta e o pH. As análises hematológicas demonstraram um aumento significativo (p<0,001) nos leucócitos totais nos grupos Branco Nanocápsulas (BNCs) e NCM, e uma redução significante (p<0,01) na concentração de hemoglobina e no hematócrito no grupo NCM após o tratamento intraperitoneal. Nas análises bioquímicas foi observado um aumento significativo (p<0,001) dos níveis séricos de ureia, uma redução (p<0,001) dos níveis plasmáticos de ácido úrico nos grupos BNCs e NCM após o tratamento intraperitoneal. As análises histológicas demonstraram que apenas o fígado do grupo BNCs foi constatado infiltrado inflamatório de linfócitos aleatório leve no tratamento oral e que na parede abdominal dos grupos BNCs e NCM foi verificado um processo inflamatório após o tratamento intraperitoneal. No entanto não foram observadas diferenças significativas nas análises hematológicas, bioquímicas e histológicas após a administração oral. No entanto, a via intraperitoneal não é apropriada para administração de nanocápsulas com Eudragit.

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The process of development of new drug requires numerous preclinical studies that generate information regarding safety profile in vivo determinants for making the decision to start clinical trials. Although it is a conventional practice, the use of animals in scientific research should happen consciously, always considering the ethical issues of animal experimentation. In this study, we investigated the basal cytotoxicity against 3T3 cells of seven pyrazole compounds (LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, and LQFM023 LQFM024) and classified then in GHS system. Whereas the compound LQFM021 proved to be the most effective in the tests performed in parallel pharmacodynamic study, we investigated whether acute oral toxicity, subacute and mutagenicity of this compound. The results showed that the compounds have low cytotoxicity profile in basal cell line (3T3). The estimated LD50 values for compounds LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, and LQFM023 LQFM024 were 548, 551, 568, 533, 457, 482, 565 mg / kg, respectively. The compounds LQFM020, LQFM023 LQFM024 were classified in category 5 GHS system and LQFM021 was classified in category 4. The subacute toxicological research for 28 days LQFM021 the compound showed that this compound did not affect the metabolic, hematological and biochemical animal parameters in any of the doses of exposure However, the histopathology indicated hepatotoxic and nephrotoxic potential of this compound and interference in the process of hematopoiesis, but did not indicate mutagenic potential. . Given the above, we conside / As doenças cardiovasculares estão entre as doenças de maior letalidade no Brasil e no mundo. Em contrapartida, vê-se um quadro redução das mortes atribuídas às enfermidades cardiovasculares devido, em grande parte, à produção de medicamentos capazes de controlar seus fatores de risco, porém, o vasto relato de efeitos colaterais e contraindicações persistem e interferem negativamente no quadro de morbimortalidade dessas doenças. Neste sentindo, é imprescindível buscar novos fármacos mais efetivos e seguros. O processo de desenvolvimento de um novo fármaco exige numerosos estudos pré-clínicos que geram informações quanto ao seu perfil de segurança in vivo, determinantes para a tomada de decisão de se iniciar os estudos clínicos. Embora seja uma prática convencional, o uso de animais em pesquisas científicas deve ocorrer de forma consciente, considerando sempre as questões éticas de experimentação animal. Neste trabalho, investigou-se a citotoxicidade basal frente as células 3T3 de sete compostos pirazolínicos (LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, LQFM023 e LQFM024) e suas classificações no sistema GHS. Considerando que o composto LQFM021 demonstrou ser o mais eficaz nos ensaios realizados em paralelo de farmacodinâmica, investigou-se toxicidade oral aguda, subaguda e mutagenicidade do composto. Os resultados mostraram que os compostos possuem perfil de baixa citotoxicidade em linhagem basal (3T3). Os valores de DL50 estimados para os compostos LQFM011, LQFM012, LQFM020, LQFM021, LQFM022, LQFM023 e LQFM024 foram 548, 551, 568, 533, 457, 482, 565 mg/kg, respectivamente. Os compostos LQFM020, LQFM023 e LQFM024 foram classificadas na categoria 5 do sistema GHS e o composto LQFM021 foi classificado na categoria 4. A investigação toxicológica subaguda por 28 dias do composto LQFM021 mostrou que este composto não interferiu nos parâmetros metabólico, hematológico e bioquímico dos animais em nenhuma das doses de exposição. No entanto, o estudo histopatológico indicou potencial nefrotóxico e hepatotóxico deste composto e interferência sobre o processo de hematopoiese, entretanto, não apresentou potencial mutagênico. Diante do exposto, consideramos que o composto LQFM021 apresenta um baixo perfil de toxicidade e os estudos de continuidade devem ser encorajados.

Determinou-se a análise dos teores de benzeno em 74 amostras de solventes orgânicos industriais e produtos formulados como thinners e produtos gráficos, em amostras coletadas orientadamente em oito estados do país, com a finalidade de obter dados sobre a exposição ocupacional de trabalhadores. A análise conjunta dos resultados analíticos, das condições de trabalho encontradas e do mercado desses produtos, forneceu o subsídio técnico inicial para uma reflexão mais ampla de como atuar, via Química Analítica, em Saúde Ocupacional, garantindo critérios de confiabilidade analítica e eficácia para o objeto acercado. Do ponto de vista metodológico, a observação de confiabilidade analítica garante situar o trabalho. no domínio químico-analítico e a eficácia alcança a natureza interdisciplinar em relação ao objeto em Saúde Ocupacional. A seleção desses parâmetros e a observância constante de sua relação com o objeto investigado foi orientando os estudos e ações interdisciplinares e interinstitucionais descritas nos capítulos dois e três deste trabalho, que permitiram explicitar um quadro de elevada complexidade, referente à exposição ocupacional ao benzeno no país. Esse \"Sistema Global Complexo\" como o denominamos, é definido pelo modo de produção, distribuição e uso do benzeno e está representado em diagrama próprio. Procura-se mostrar que as respostas às demandas químico-analíticas surgidas no interior desse sistema, exigem a \"internalização\" dos instrumentos específicos, para garantia simultânea de confiabilidade e eficácia. Foi preciso diferenciar e explicitar os principais sub-sistemas para evidenciar as relações e interdependências estruturais na utilização do benzeno, a fim de eliminar demandas inadequadas e acercar variáveis e interferências a serem consideradas no domínio analítico. Segue-se detalhando no âmbito da Química o sub-sistema \"Indústrias Misturadoras de Solventes\". Mostram-se as ações e os estudos químico-analíticos desenvolvidos para fiscalização dos teores de benzeno em solventes e produtos formulados, regulamentados por portaria interministerial própria. Descreve-se o planejamento estatístico para coleta de amostras e a metodologia de análise dos teores de benzeno testada em caráter interlaboratorial. Sugere-se a extensão dessa abordagem metodológica para estudo da exposição ocupacional a outros produtos químicos que venham definir quadros complexos. / The presence of benzene has been assessed in 74 samples of industrial organic solvents and products formulated as thinners and graphic products, properly collected in 8 states of Brazil, with the purpose of acquiring data on occupational exposure by workers. The analysis of the analytical results together with the labor conditions found and the market for these products, has provided the starting technical subsidies whose goal was a broader discussion on how to deal with Occupational Health, via Analytical Chemistry, in order to assure the criteria of analytical reliability and efficacy for the object approached. From the point of view of methodology, the maintenance of analytical reliability criteria permits to place this work within the domain of Analytical Chemistry, and thus the efficacy as a parameter reaches the interdisciplinary nature relative to the object which is target of Occupational Health. The selection of these instruments and the permanent observation of its relation towards the object researched has orientated the interdisciplinary and interinstitucional studies and actions described in chapters 2 and 3 of this work. They allow us to evolve a frame of high complexity, regarding the occupational exposure to benzene in Brazil. This \"Global Complex System\", as we call it, is defined by the way benzene is produced, distributed and used, which has been illustrated by means of a diagram. The point we try to make, is that the answers to the demands faced by the analytical chemistry within this system, requires the \"internalization\" of specific instruments in order to ensure both reliability and efficacy. It was necessary to perform the differentiation and make explicit the main subsystems so that the structural relations and interdependence in the benzene use would become evident. Thus, inadequate demands would be put away and variables and interferences could be approached and analytically considered. An effort is then made in order to detail, within the chemistry field, the subsystem called \"Solvent Mixing Industry\". Chemical analytical actions and studies are described as they have been developed to check the presence of benzene in solvents and formulated products. Such inspection is ruled by specific governmental by-laws. The statistical planning is then described, regarding the collection of samples and the methodology of analysis which was tested on an interlaboratorial level. It is suggested that this methodological approach could be extended to studies on occupational exposure to other chemical products which may give rise to other complex frameworks.