Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno zoonótico emergente, que puede causar enfermedades severas en humanos, como colitis hemorrágica (CH) y síndrome hemolítico urémico (SHU). Se han reportado infecciones con STEC en personas producto del contacto directo con animales de compañía, y de estos se han aislado cepas de este patógeno con virulotipo asociado a enfermedad severa. Sin embargo, en Chile a la fecha no se encuentra información disponible al respecto. Por esta razón, este proyecto busca aportar con información sobre la caracterización de cepas de STEC circulantes en parte de la población canina y felina nacional. Para cumplir con lo anterior, se recolectaron torulados rectales de 300 perros y 300 gatos mascotas, entre octubre y diciembre del año 2018. Se realizaron dos rondas de cultivo, en caldo tripticasa de soya y en agar MacConkey; y mediante PCR se buscó determinar la presencia de los genes stx1 y stx2 con el fin de identificar cepas de STEC en las muestras obtenidas. Además, se contempló la detección de los genes eae, lpf, saa y hlyA en las cepas de STEC aisladas. Sin embargo, con esta metodología no fue posible el aislamiento de cepas de STEC en las muestras procesadas. En vista de los resultados obtenidos podemos concluir que los perros y gatos con dueño en algunas comunas de la Región Metropolitana representarían un riesgo bajo en la transmisión de cepas de STEC con determinantes de virulencia asociados a CH y SHU en las personas. Sin embargo, es necesaria la realización de otros estudios, con un mayor tamaño muestreal y que analicen las distintas variables que puedan afectar la colonización de STEC en estos animales. / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is an emerging zoonotic pathogen, which can cause severe diseases in humans, such as hemorrhagic colitis (HC) and haemolytic uraemic syndrome (HUS). Infections have been reported in people as a result of direct contact with companion animals, and from these STEC strains with virulotype associated with severe disease have been isolated. However, to date in Chile there is no information available about it. For this reason, this project seeks to provide information on the characterization of circulating STEC strains in part of the national dog and cat population. In order to comply with the above, rectal swabs from 300 dogs and 300 pet cats were collected between October and December of 2018. Two rounds of culture were carried out in tripticase soy broth and on MacConkey agar; and by means of PCR, the presence of the stx1 and stx2 genes was attempted in order to identify STEC strains in the samples obtained. In addition, the detection of eae, lpf, saa and hlyA genes in the isolated STEC strains was contemplated. However, with this methodology it was not possible to isolate STEC strains in the processed samples. In view of the results obtained, we can conclude that household dogs and cats in some communes of the Metropolitan Region would represent a low risk in the transmission of STEC strains with virulence determinants associated with HC and HUS in people. However, it is necessary to carry out further studies, with a larger sample size and that address the different variables that may affect the colonization of STEC in these animals. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt Iniciación N° 11170363

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-29Bitstream added on 2014-06-13T20:44:10Z : No. of bitstreams: 1 pigatto_cp_dr_jabo.pdf: 841661 bytes, checksum: 288fcbc74e176eac0befc1827d1bc15e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) são reconhecidas como agentes causadores de infecções em humanos em todo o mundo. O principal reservatório é o bovino. Neste trabalho, cepas de STEC previamente isoladas de fezes bovinas foram caracterizadas usando PCR multiplex para determinar os genes de virulência (stx1, stx2, ehxA, eaeA e saa), soroaglutinação passiva reversa em látex (RPLA-VTEC screen) para avaliar a expressão da toxina Shiga, PCR-RFLP e sequenciamento para obter os subtipos e a variabilidade dos genes stx2, respectivamente. Foram determinados também os sorotipos, o perfil de sensibilidade e a viabilidade das cepas de STEC em queijo minas frescal. A freqüência de STEC nas amostras de fezes bovinas foi de 37%. Foram encontrados trinta e quatro sorotipos de STEC sendo os mais freqüentes o ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 e ONT:H21 (7% cada). Onze sorotipos encontrados não tinham sido associados com STEC até o momento. A maioria das STEC (96%) foi susceptível a todos os antimicrobianos testados. A produção de toxina Shiga determinada pelo ensaio RPLA foi de 89%. Os marcadores de virulência foram encontrados em 11 diferentes combinações, a mais freqüente foi stx2 (27%), stx1 stx2 e stx1 stx2 ehxA saa (16% cada). Foram detectados 8 subtipos de stx2: stx2OX3a/O111; stx2; stx2c; stx2(vha); stx2(vhb); stx2OX3b; stx2vnb/vhc e stx2O48. Os genes que apresentaram maior freqüência foram: stx2 e stx2c. As seqüências parciais obtidas sugerem a presença de elevada variabilidade nos genes do tipo stx2 nas STEC analisadas. A viabilidade de STEC não-O157 em queijo minas revelou que diferentes cepas de STEC podem ser detectadas nos queijos após 10 dias de armazenamento sob refrigeração. Os dados encontrados neste trabalho sugerem isolados com alto potencial de patogenicidade oferecendo risco de desencadear graves infecções à população. / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is recognize worldwide as an organism capable to cause human diseases. Cattle are the main source of STEC. In this research, STEC strains previously isolated were analyzed using multiplex-PCR for virulence genes, the RPLA assay to detect the Shiga toxin production and serotyping. PCR-RFLP and nucleotide sequence were analyzed to detect stx2 genes subtypes and their variability. Moreover tests for antimicrobial susceptibility and the vialbility of STEC in Minas Frescal cheese were done. The frequency of cattle shedding STEC was 37%. Thirty-four serotypes of STEC were found, the most frequent being ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 and ONT:H21 (7% each). Eleven serotypes had not been associate with STEC until the moment. Most of the strains (96%) were susceptible to all antimicrobial agents tested. Production of Shiga toxin by the RPLA assay was detected in most (89%) of the STEC strains. The frequency of virulence markers were found in 11 diferent combinations: stx2 (27%), stx1 stx2 e stx1 stx2 ehxA saa (16% each). Eigth stx2 subtypes were detect (stx2OX3a/O111; stx2; stx2c; stx2(vha); stx2(vhb); stx2OX3b; stx2vnb/vhc; stx2O48) and the most frequent were: stx2; stx2c. The partial sequences of stx2 genes suggested a high variability of stx2 types in the STEC analyzed. The STEC viability in cheese could be detected after 10 days of storage under refrigeration. The results found in this work suggest strains with high potential of pathogenicity offering risk to lead serious infections to the population.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente que puede provocar casos esporádicos y brotes de diarreas con y sin sangre, colitis hemorrágica y/o síndrome hemolítico urémico en humanos, especialmente niños y ancianos. La bacteria es transmitida por alimentos, principalmente a través de productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos. El objetivo del presente estudio fue determinar la prevalencia de STEC en carne molida de vacuno obtenida en diferentes áreas del Gran Santiago y caracterizar los aislados obtenidos. Se recolectaron 430 muestras de carne molida de vacuno desde carnicerías y supermercados de la ciudad entre los meses de Marzo del 2016 a Enero de 2017, dividiendo en 4 zonas geográficas a la ciudad. Las muestras fueron sometidas a un tamizaje a través de PCR para los genes stx1 y stx2 y desde las muestras positivas se aislaron colonias sospechosas a E. coli. La confirmación de los aislados se realizó mediante PCR para los genes stx1 y stx2 y pruebas bioquímicas para E. coli, además de un PCR para E. coli. Los aislados se caracterizaron para la presencia de los factores de virulencia de la intimina (eae) y hemolisina (hlyA), junto a la determinación de serotipos O157 y Big Six (O26, O45, O103, O111, O121, O145). Un 9,3% (40/430) de las muestras resultaron positivas a STEC; 10,2% provenientes (22/215) de carnicerías y 8,4% (18/215) de supermercados. No se detectaron diferencias significativas entre las prevalencias de cada área de la ciudad. Desde las 40 muestras positivas se recuperaron 47 aislados de STEC, de las cuales 12,8% (6/47) contenía el gen stx1, 74,5% (35/47) stx2 y 12,8% (6/47) tenía ambos genes de virulencia. Ninguna de los aislados contenía el gen de la intimina (eae), y un 40% fue positivo al factor de virulencia hlyA. Ninguno de los aislados fue de los serogrupos de STEC O157 o “Big Six”. En conclusión, la carne molida ofrecida en Santiago es un vector de STEC, sin embargo, se requieren más estudios para determinar el potencial patogénico de las cepas y el riesgo que representa la carne molida para la población / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is an emerging pathogen that can cause sporadic cases and outbreaks of diarrhea, hemorrhagic colitis and / or hemolytic uremic syndrome in humans, especially children and the elderly. The bacterium is transmitted by food, especially through raw or undercooked meat products. The objective of the study was to determine the prevalence of STEC in ground beef obtained in the city of Santiago, Chile, and to characterize the isolates. We collected 430 ground beef samples from butcher shops and supermarkets across Santiago, from March 2016 to January 2017. The samples were screened through a PCR for the genes stx1 and stx2, and presumptive E. coli colonies were isolated from each positive sample. STEC confirmation was carried out by PCR for the stx1 and stx2 genes and biochemical tests for E. coli. All the isolates were characterized for the presence of the virulence factors intimin (eae) and hemolysin (hlyA) and tested for the presence of serotypes O157 and Big Six (O26, O45, O103, O111, O121, O145). From the ground beef samples, 9.3% (40/430) were positive to STEC: 10.2% (22/215) were from butcher shops and 8.4% (18/215) from supermarkets. No significant differences were detected among the prevalence of each area. From the 40 positive samples, 47 STEC isolates were recovered. Among the isolates, stx1 gene was present in 12.8%, 74.5% carried stx2, and 12.8% had both virulence genes. None of the isolates contained the intimin (eae) gene, and 40% were positive for the hlyA virulence factor. None belonged to the serogroups STEC O157 or Big Six. In conclusion, ground meat sold in Santiago, Chile carries STEC; however, more studies are required to determine the pathogenic potential of the strains and the risk that ground beef represents for the population / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11150491

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-11. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:12Z : No. of bitstreams: 1 000866878.pdf: 819016 bytes, checksum: f4b074f87450614f386b1be1ec42f77b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Também foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros / Beef can be an important vehicle for various pathogens to humans, especially Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), associated to human and animal diarrhea. In this study, the prevalence of different pathotypes of diarrheagenic E. coli, and virulence profiles of STEC were investigated among feces of cattle slaughtered in São Paulo state, southeast of Brazil. From a total of 431 animals, STEC was identified from 116 (26,9%) samples, being 111 (25,8%) STEC eae- and 5 (1,1%) STEC eae+. EPEC pathotype was detected among 20 (4,6%) of animals. The other pathotypes of diarrheagenic E. coli were not identified. Of the 95 STEC isolates assessed for virulence profile, all harbored stx2, while 28 (29,5%) contained stx1. Iha and saa, genes encoding adhesins, were found at 93,7% (89/95) and 66,3% (63/95), respectively. EspP, gene which encoding a protease related with intestinal colonization, was detected in 61,1% (58/95) and ehxA hemolysin was present in 54,7% (52/95). SubAB, nleE and nleB genes were also detected in lower rates. STEC is widespread in cattle herds of São Paulo, containing commonly isolated genes from human pathogens, which reinforces the importance of inspection and surveillance in the slaughterhouses

Orientador: Cristiano Gallina Moreira / Banca: Waldir Pereira Elias Nunes / Banca: Carla Raquel Fontana Mendonça / Resumo: A sinalização química é o mecanismo através do qual bactérias patogênicas interagem com o hospedeiro e sua microbiota, de modo a promover a regulação dos seus mecanismos de virulência. O estudo da sinalização química, em bactérias entéricas, do sistema de 2-componentes QseBC via autoindutor-3 (AI-3), epinefrina (Epi) e norepinefrina (NE), tem aberto perspectivas para desvendar novos mecanismos. Escherichia coli O104:H4 possui características fenotípicas clássicas de E. coli enteroagregativa (EAEC) e se apresenta positiva para toxina de Shiga, encontrada em cepas de E. coli enterohemorrágica (EHEC). A presença dessa toxina pode levar o hospedeiro ao desenvolvimento de complicações mais graves, como a síndrome hemolítica urêmica (SHU). Dessa forma, essa combinação se torna altamente perigosa e patogênica a humanos, conforme observado no surto epidêmico em 2011 na Europa. O presente estudo teve como objetivo investigar a sinalização química e os mecanismos de patogenicidade em EAEC O104:H4 C227-11, já descritos em EAEC e EHEC, bem como buscar mecanismos ainda não elucidados na literatura. Comparada com cepas protótipos de E. coli diarreiogênicas, os resultados demonstraram que a cepa C227-11 possui um fenótipo de adesão e formação de biofilme acentuados. Em meio ácido, apresentou mais robustez na sobrevivência e maior motilidade em relação à EAEC 042. Também foi possível observar que o nível de expressão gênica para qseC apresentou-se semelhante ao de EHEC e exerce um importante... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chemical signalling is the mechanism through which pathogenic bacteria interact with the host microbiota, in order to promote regulation of virulence mechanisms. The study of chemical signalling in two-component system QseBC in enteric bacteria, by autoinducer3 (AI-3), epinephrine (Epi) e norepinephrine (NE), has opened perspectives to discover new mechanisms. Escherichia coli O104:H4 has classic phenotypic characteristics of enteroaggregative E. coli (EAEC) and presents itself positive for Shiga toxin, which is found in enterohemorrhagic E. coli strains (EHEC). This toxin may lead the host to the development of more serious diseases, such as the Hemolytic Uremic Syndrome (HUS). Therefore, this combination is highly dangerous and pathogenic to humans, as observed during the epidemic outbreak in Europe in 2011. This study aimed to investigate chemical signalling and mechanisms of pathogenicity in EAEC O104:H4 C227-11, already described in EAEC and EHEC, as well as mechanisms still not elucidated in literature. Compared to prototype strains of diarrheagenic E. coli, the results have shown that C227- 11 has accentuated phenotype of adhesion and biofilm formation. In acid medium, it presented more strength of survival and more motility than EAEC 042. In addition, gene expression level in qseC was found similar to EHEC and it holds an important participation in activation of virulence factors expression, highlighting, thereby, the possibility of its participation in related mechanisms. Through in vivo tests, it was noticed considerable variation of microbiota, compared to C227-11, just as significant differences among other EAEC that mostly did not present great alterations during analysed days, with predominance of Bacteroidetes over Firmicutes Phylum. The conclusion was that its large profile of adhesion and its elevated tolerance... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Vera Lúcia Mores Rall / Resumo: A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Também foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros / Abstract: Beef can be an important vehicle for various pathogens to humans, especially Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), associated to human and animal diarrhea. In this study, the prevalence of different pathotypes of diarrheagenic E. coli, and virulence profiles of STEC were investigated among feces of cattle slaughtered in São Paulo state, southeast of Brazil. From a total of 431 animals, STEC was identified from 116 (26,9%) samples, being 111 (25,8%) STEC eae- and 5 (1,1%) STEC eae+. EPEC pathotype was detected among 20 (4,6%) of animals. The other pathotypes of diarrheagenic E. coli were not identified. Of the 95 STEC isolates assessed for virulence profile, all harbored stx2, while 28 (29,5%) contained stx1. Iha and saa, genes encoding adhesins, were found at 93,7% (89/95) and 66,3% (63/95), respectively. EspP, gene which encoding a protease related with intestinal colonization, was detected in 61,1% (58/95) and ehxA hemolysin was present in 54,7% (52/95). SubAB, nleE and nleB genes were also detected in lower rates. STEC is widespread in cattle herds of São Paulo, containing commonly isolated genes from human pathogens, which reinforces the importance of inspection and surveillance in the slaughterhouses / Mestre