Thesis (Ph.D. (Tropical Medicine))--Mahidol University, 1999.

Thesis (M.S.)--University of North Carolina at Wilmington, 2005. / Includes bibliographical references (leaves: [55]-[58])

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 105-131).

Thesis (MSc (Paraclinical Sciences))--University of Pretoria, 2007. / Includes bibliographical references. Also available in print format.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 00738.pdf: 1846124 bytes, checksum: 6d5b678407c4a946c4b55ef4b823c2f4 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IEA/T / Instituto de Quimica, Universidade de Sao Paulo - IQ/USP

Orientador: Reinaldo Marchetto / Co-orientador: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Banca: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Esteban Nicolás Lorenzón / Resumo: Sistemas toxina-antitoxina (TA) são tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estável e uma antitoxina lábil. Esses módulos genéticos são diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I à VI) com base na natureza da antitoxina e no seu modo de interação com a toxina. O sistema TA GhoT/GhoS (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenômeno de persistência celular (tolerância temporária à antibióticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, os detalhes que envolvem a estrutura e os mecanismos de ação da toxina GhoT ainda não foram totalmente esclarecidos, sendo apenas demonstrado que a molécula in vivo ocasiona a formação de poros na membrana plasmática bacteriana, interrompendo a produção de ATP. Dessa maneira, considerando o potencial biotecnológico dos sistemas TA como alvos para o desenho de novos bactericidas, o presente trabalho caracterizou funcional e estruturalmente a proteína GhoT de Salmonella enterica e peptídeos derivados com capacidade de interação com membranas biológicas. Para isso, após a obtenção da sequência de aminoácidos da GhoT de S. enterica por BLAST e de sua predição estrutural in silico, a proteína e seus derivados (HN e HC) foram sintetizados pelo método químico em fase sólida, sendo purificados por cromatografia líquida de alta eficiência e identificados por espectrometria de massas. Em seguida, a capacidade de estruturação das moléculas foi avaliada com o auxílio da espectroscopia de dicroísmo circular. Já as suas funções foram investigadas através de ensaios de permeabilização de vesículas lipídicas, expressão heteróloga em bactéria e atividade antimicrobiana. Coletivamente, os estudos demonstraram que os polipeptídeos estão predominantemente enovelados em α-hélice, confirmando a modelagem estrutural realizada.... / Abstract: Toxin-antitoxin (TA) systems are typically formed by two genes encoding a stable toxin and a labile antitoxin. These genetic modules are diverse and abundant in prokaryotes and are grouped into six types (I to VI) based on the nature of the antitoxin and its mode of interaction with the toxin. The TA GhoT/GhoS system (type V) was identified in Escherichia coli, being implicated in the phenomenon of cell persistence (temporary tolerance to antibiotics). Although the antitoxin of this system (GhoS) has been well characterized, the details surrounding the structure and mechanisms of action of the GhoT toxin have not yet been fully elucidated, and it has only been shown that the molecule in vivo causes the formation of pores in the bacterial plasma membrane, disrupting the production of ATP. In this way, taking into account the biotechnological potential of TA systems as targets for the design of new bactericides, the present work characterized the GhoT protein of Salmonella enterica and derived peptides with interaction capacity with biological membranes. After obtaining the amino acid sequence of S. enterica GhoT by BLAST and its in silico structural prediction, the protein and analogues (HN and HC) were synthesized by the solid phase chemical method and were isolated by high performance liquid chromatography and identified by means of mass spectrometry. Then, the conformations of the molecules were evaluated with the help of circular dichroism (CD) spectroscopy. Its functions were investigated through lipid vesicle permeabilization assays, heterologous expression in bacteria and antimicrobial activity. Thus, collectively, the information revealed by the studies demonstrated that the polypeptides are predominantly anchored in α-helix, confirming the structural modeling performed. In addition, it was observed that the molecules retain the same lytic activity verified for the E. coli GhoT toxin, especially... / Mestre

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Guilherme Duarte Rossi / Banca: Agda Paula Facincani / Banca: Ana Maria Guidelli Thuler / Resumo: Bacillus thuringiensis é uma bactéria que pode conferir patogenicidade a uma ampla variedade de insetos, e que possui fatores associados à mortalidade de insetos por B. thuringiensis, que foram identificados e são utilizados no controle de insetos-praga como, por exemplo, as toxinas Cry, Vip e Cyt. Novos genes de B. thuringiensis que possam estar envolvidos no processo de patogenicidade a insetos têm sido identificados, entre estes, as quitinases. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas entre as unidades de N-acetil-glicosamina da quitina, e aparecem como uma interessante opção por também mostrarem potencial para serem utilizadas no controle de pragas. No presente trabalho, realizou-se o isolamento e a caracterização de um gene de quitinase do isolado de B. thuringiensis I_555 (chi_I555) e a produção e caracterização parcial da quitinase (Chi_I555). A análise de chi_I555 indicou uma fase de leitura aberta de 2025 pares de bases que codificam uma proteína com 674 aminoácidos e peso molecular de 74,24 kDa. Análises bioinformáticas indicaram a presença de um sítio ativo de quitinase, de um domínio de fribronectina e de um domínio ligante de quitina na proteína Chi_I555. A expressão heteróloga de Chi_I555 resultou na produção de uma quitinase ativa sobre o substrato "Chitin Azure" em uma faixa ótima de pH próxima do neutro. A proteína Chi_I555 utilizada neste estudo é altamente promissora para o uso em construções de plantas geneticamente modificadas / Abstract: Bacillus thuringiensis is a bacterium that can confer pathogenicity to a wide variety of insects, and has associated with mortality of insects by B. thuringiensis factors that have been identified and are used to control insect pests such as the Cry toxins, Vip and Cyt. New genes of B. thuringiensis that may be involved in the pathogenic process of insects have been identified among these chitinases. Enzymes capable of hydrolyzing glycosidic linkages between the units of N-acetyl-glucosamine from chitin, and appear as an interesting option to also show potential for use in pest control. In this study, we carried out the isolation and characterization of a chitinase gene from B. thuringiensis isolate I_555 (chi_I555) and the production and partial characterization of a chitinase (Chi_I555). Chi_I555 analysis indicated an open reading frame of 2025 base pairs encoding a protein of 674 amino acids and a molecular weight of 74.24 kDa. Bioinformatics analysis indicated the presence of an active site of chitinase, a fribronectin domain and a chitin binding domain of the protein Chi_I555. Heterologous expression of Chi_I555 resulted in the production of an active chitinase on the substrate "Chitin Azure" in a great range of pH close to neutral. The Chi_I555 protein used in this study is highly promising for use in construction of genetically modified plants / Mestre

Submitted by FERNANDO KAMIMURA COCCHI null (fecocchi@gmail.com) on 2016-03-30T19:44:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Fernando Kamimura Cocchi.pdf: 3236502 bytes, checksum: 436c4468ce72564ad0846615cbd9ce4a (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-01T20:12:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cocchi_fk_me_rcla.pdf: 3236502 bytes, checksum: 436c4468ce72564ad0846615cbd9ce4a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T20:12:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cocchi_fk_me_rcla.pdf: 3236502 bytes, checksum: 436c4468ce72564ad0846615cbd9ce4a (MD5) Previous issue date: 2016-03-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os escorpiões são artrópodes da classe Arachnida, ordem Scorpiones. São animais peçonhentos, ou seja, possuem órgão secretório ou glândulas conectadas a um dispositivo de injeção, o qual pode inocular o veneno produzido pela glândula ou células especializadas. O veneno pode ser descrito como sendo uma mistura complexa, contendo muco, sais inorgânicos, moléculas orgânicas de baixa massa molecular, muitos peptídeos neurotóxicos e proteínas. O envenenamento humano por picada de escorpião é um importante problema de saúde pública em vários países tropicais e subtropicais. No Brasil, Tityus serrulatus é uma das espécies mais perigosas, que causam grave envenenamento, podendo levar ao óbito. Em geral, o envenenamento pode causar sintomas de dor, febre, agitação psicomotora, salivação, lacrimejamento, aumento da mobilidade do trato gastrointestinal, insuficiência respiratória e arritmia cardíaca, hipertensão arterial seguida de hipotensão, insuficiência cardíaca, edema pulmonar e choque anafilático. O veneno dos escorpiões tem sido estudado ao longo dos anos, a fim de elucidar seus compostos juntamente com suas sequências e suas funções biológicas. Algumas espécies de escorpiões possuem em seu veneno compostos antimicrobianos, mediadores que ativam os processos inflamatórios, causam a desgranulação de mastócitos, como também, podem ser capazes de induzir quimiotaxia de neutrófilos. Até o presente momento a toxinologia de escorpiões tem concentrado o foco nas neurotoxinas, que são peptídeos contendo entre 30 e 70 resíduos de aminoácidos em suas sequências, com quatro ou cinco pontes dissulfeto em suas estruturas. A despeito de existir muitos pequenos peptídeos (apresentando entre 5 e 20 resíduos de aminoácidos em suas sequências), que apresentam conformações lineares, por não apresentarem pontes dissulfeto em suas estruturas, este grupo de toxinas tem sido negligenciado pela literatura, devido à dificuldade em isolar e determinar suas estruturas moleculares. O presente trabalho teve como objetivo sintetizar alguns destes peptídeos (Typep-14, -15, -16, -17, and -18), previamente isolados e sequenciados a partir do veneno do escorpião T. serrulatus, por nosso grupo de pesquisas, e caracterizá-los de acordo com suas possíveis funções biológicas através de ensaios de desgranulação de mastócitos e liberação de lactato desidrogenase, hemólise, antibiose, efeitos hiperalgésicos e edematogênicos, e teste de campo aberto. Nenhum peptídeo apresentou atividade hemolítica, antibiótica; ou apresentou atividade desgranuladora de mastócito e liberação de LDH em ratos. Apenas o TyPep 18 apresentou alterações na locomoção de camundongos. Em geral, todos apresentaram ações de hiperalgesia ou formação de edemas localizados. Conclui-se portanto, que os peptídeos ensaiados no presente trabalho estão relacionados à produção de dor e inflamação. / Scorpions are arthropods of the class Arachnida, order Scorpiones. They are venonous animals, i. e, they have secretory organ or gland connected to an injection apparatus, which can inoculate the venom produced by specialized cells. The venom can be described as a complex mixture containing mucus, inorganic salts, organic molecules of low molecular mass, many neurotoxic peptides and proteins. The human enenvenoming by scorpion sting is an important problem of public health in many tropical and subtropical countries. In Brazil, Tityus serrulatus is one of the most dangerous species, which cause severe enenvenoming, that can lead to death. In general, the envenoming can cause symptoms of pain, fever, agitation, salivation, lacrimation, increasing motility of the gastrointestinal tract, respiratory failure and cardiac arrhythmia, hypertension followed by hypotension, heart failure, pulmonary edema and anaphylaxis. The venom of scorpions has been studied over the years in order to elucidate their biochemical composition, along with their sequences and biological functions. Some species of scorpions have antimicrobial compounds in their venom, mediators that trigger inflammatory processes, causing mast cell degranulation, and also may be capable of inducing neutrophil chemotaxis. To date, the toxinology of scorpions has concentrated the focus on neurotoxins, which are peptides containing between 30 and 70 amino acid residues in their sequences, with four or five disulfide bonds in their structures. Despite the existence of many small peptides (having between 5 and 20 amino acid residues in their sequences), that have linear conformations for not having disulfide bonds in their structures, this group of toxins has been neglected in the literature, due to the difficulty in isolating and determine molecular structures of these toxins. This study aimed to synthesize some of these peptides (Typep-14, -15, -16, -17, and -18) previously isolated and sequenced from T. serrulatus scorpion venom, by our research group, and characterize them according to their possible biological functions through mast cell degranulation and lactate dehydrogenase release test, hemolysis, antibiosis, hyperalgesic and edematogênics effects and open field test. None of the peptides presented hemolytic, antibiotic activity, mast cell degranulation or LDH release in rats. Only TyPep 18 influenced the pattern of locomotion in mice. In general, all peptides had presented hyperalgesic and edematogenic effects. It may be concluded that the peptides tested in this study are related to the production of pain and inflammation. / CAPES: 1208/2011

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-18Bitstream added on 2015-03-03T12:07:12Z : No. of bitstreams: 1 000811933_20151218.pdf: 96939 bytes, checksum: 04a99a8168a4d1d45d4874efe4f2b497 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-18T13:57:58Z: 000811933_20151218.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-18T13:58:36Z : No. of bitstreams: 1 000811933.pdf: 896821 bytes, checksum: d95843628c2f7f0cc36797c46e5efaf7 (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria que pode conferir patogenicidade a uma ampla variedade de insetos, e que possui fatores associados à mortalidade de insetos por B. thuringiensis, que foram identificados e são utilizados no controle de insetos-praga como, por exemplo, as toxinas Cry, Vip e Cyt. Novos genes de B. thuringiensis que possam estar envolvidos no processo de patogenicidade a insetos têm sido identificados, entre estes, as quitinases. Enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas entre as unidades de N-acetil-glicosamina da quitina, e aparecem como uma interessante opção por também mostrarem potencial para serem utilizadas no controle de pragas. No presente trabalho, realizou-se o isolamento e a caracterização de um gene de quitinase do isolado de B. thuringiensis I_555 (chi_I555) e a produção e caracterização parcial da quitinase (Chi_I555). A análise de chi_I555 indicou uma fase de leitura aberta de 2025 pares de bases que codificam uma proteína com 674 aminoácidos e peso molecular de 74,24 kDa. Análises bioinformáticas indicaram a presença de um sítio ativo de quitinase, de um domínio de fribronectina e de um domínio ligante de quitina na proteína Chi_I555. A expressão heteróloga de Chi_I555 resultou na produção de uma quitinase ativa sobre o substrato “Chitin Azure” em uma faixa ótima de pH próxima do neutro. A proteína Chi_I555 utilizada neste estudo é altamente promissora para o uso em construções de plantas geneticamente modificadas / Bacillus thuringiensis is a bacterium that can confer pathogenicity to a wide variety of insects, and has associated with mortality of insects by B. thuringiensis factors that have been identified and are used to control insect pests such as the Cry toxins, Vip and Cyt. New genes of B. thuringiensis that may be involved in the pathogenic process of insects have been identified among these chitinases. Enzymes capable of hydrolyzing glycosidic linkages between the units of N-acetyl-glucosamine from chitin, and appear as an interesting option to also show potential for use in pest control. In this study, we carried out the isolation and characterization of a chitinase gene from B. thuringiensis isolate I_555 (chi_I555) and the production and partial characterization of a chitinase (Chi_I555). Chi_I555 analysis indicated an open reading frame of 2025 base pairs encoding a protein of 674 amino acids and a molecular weight of 74.24 kDa. Bioinformatics analysis indicated the presence of an active site of chitinase, a fribronectin domain and a chitin binding domain of the protein Chi_I555. Heterologous expression of Chi_I555 resulted in the production of an active chitinase on the substrate Chitin Azure in a great range of pH close to neutral. The Chi_I555 protein used in this study is highly promising for use in construction of genetically modified plants

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 04133.pdf: 1484751 bytes, checksum: 70d3b59e3be4faedca8ab4be9a1ad750 (MD5) / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP