Morphine withdrawal increases the HPA axis activity, which is dependent on a hyperactivity of noradrenergic pathways (NTS-A2) innervating the PVN. In this Thesis we found that morphine withdrawal resulted in an increase in ACTH and corticosterone secretion and a neuronal activation in the PVN. Additionally, we found robust increases in CRF and AVP hnRNAs in the PVN, concomitantly with an increase in c-Fos expression. Morphine withdrawal activated ERK1/2 in PVN and NTS, which could be involved in the c-Fos expression. Morphine withdrawal induced an increase in TH mRNA levels in the NTS-A2, total TH protein in the NTS and TH phosphorylation at Ser31 in PVN and NTS-A2, which resulted in an augmentation of TH activity in the PVN. The enhancement in TH phosphorylated at Ser31 was blocked by SL327 in both nuclei. Finally, we have found that adrenalectomy eliminated the hyperactivity of noradrenergic pathways innervating the PVN during morphine withdrawal. / La abstinencia a morfina aumenta la actividad del eje HHA, que depende de la hiperactivación de las vías noradrenérgicas (NTS-A2) que inervan al PVN. En esta Tesis encontramos que la abstinencia a morfina induce la liberación de ACTH y corticosterona y la activación neuronal del PVN. Además, observamos un aumento en los niveles de hnRNA para CRF y AVP en el PVN, concomitantemente con un incremento en la expresión de c-Fos. El síndrome de abstinencia a morfina activó a ERK1/2 en PVN y NTS. También indujo un incremento en el mRNA para TH en el NTS-A2, proteína TH total y fosforilación de TH en su Ser31 en PVN y NTS-A2, que se tradujo en un aumento en su actividad enzimática. El aumento de TH fosforilada en Ser31 fue bloqueado por SL327. Finalmente, la adrenalectomía eliminó la hiperactividad de las vías noradrenérgicas que inervan al PVN durante la abstinencia a morfina.

[ES] Las bacterias resistentes a múltiples antibióticos, como el Enterococo resistente a vancomicina (ERV), son un problema creciente en los pacientes hospitalizados, por lo que se necesita estrategias alternativas para combatir estos patógenos. Las infecciones causadas por ERV suelen comenzar con la colonización del tracto intestinal, un paso crucial que se afectado por la presencia de la microbiota. Sin embargo, los antibióticos alteran la microbiota y esto promueve la colonización de ERV. Una vez que el patógeno ha colonizado el intestino, alcanza niveles muy altos pudiendo diseminar a otros órganos y pacientes. A pesar de su importancia, se sabe muy poco sobre los genes que codifica para colonizar el intestino y sobre el mecanismo por el cual la microbiota suprime su colonización intestinal, siendo los dos objetivos principales. En primer lugar hemos utilizado una metodología previamente descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generación de una librería de mutantes por transposición junto a secuenciación masiva, con el fin de identificar los genes codificados por ERV necesarios para la colonización del intestino en ratones. Además, hemos realizado análisis metatranscriptómicos para identificar aquellos genes más expresados. El análisis ha identificado genes cuya interrupción reduce significativamente la colonización intestinal en el intestino grueso. Los genes que más afectaron a la colonización codifican proteínas relacionadas con la absorción o el transporte de diversos nutrientes como los carbohidratos (subunidad EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la familia LacI, ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa) o iones (proteína transportadora dependiente de ATP (ABC) y proteínas del grupo [Fe-S]). El papel de estos genes en la colonización se ha confirmado mediante experimentos de mutagénesis directa y de competición con la cepa salvaje. Además, estos genes afectan a la colonización intestinal con diferentes antibióticos (clindamicina y vancomicina). Para identificar el mecanismo molecular por el cual cada gen afecta a la colonización, hemos realizado experimentos in vitro y ex vivo además del análisis transcriptómico. Los experimentos in vitro confirman que las proteínas del grupo [Fe-S] están involucradas en el transporte iones de hierro, principalmente Fe3+. Por otra parte, los genes de la subunidad EIIAB del transportador de manosa y del ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa son necesarios para la utilización de la manosa y el ácido N-acetilmurámico, respectivamente, azúcares que suelen estar presentes en el intestino. También confirmamos que el regulador transcripcional de la familia LacI es un represor que afecta a proteínas transportadoras ABC, probablemente implicadas en la absorción de carbohidratos. Además, algunos de estos genes están codificados principalmente por cepas clínicas de E. faecium y en menor medida por cepas comensales. En segundo lugar, estudiamos los mecanismos de protección de un consorcio de cinco bacterias comensales, que anteriormente se había demostrado que disminuían la colonización intestinal por ERV en ratones. Mediante transcriptómica, metabolómica y los ensayos in vivo observamos que el consorcio bacteriano inhibe el crecimiento de ERV mediante la reducción de nutrientes, concretamente fructosa. Por último, el análisis ARN-Seq in vivo de cada aislado en combinación con los ensayos ex vivo e in vivo demostraron que una sola bacteria (Olsenella sp.) proporciona protección. En conjunto, los resultados obtenidos han identificado la función de genes específicos requeridos por ERV para colonizar el intestino. Además, hemos identificado un mecanismo mediante el cual la microbiota confiere protección. Estos resultados podrían conducir a nuevos enfoques terapéuticos para prevenir las infecciones causadas por este patógeno multiresistente a los antibióticos. / [CA] Els bacteris resistents a múltiples antibiòtics, com el Enterococo resistent a vancomicina (ERV), són un problema creixent en els pacients hospitalitzats, que són resistents a la majoria d'antibiòtics disponibles per la qual cosa es necessita estratègies alternatives per a combatre aquests patògens. Les infeccions causades per ERV solen començar amb la colonització del tracte intestinal, un pas crucial que es veu afectat per la presència de la microbiota. No obstant això, els antibiòtics alteren la microbiota i això promou la colonització de ERV. Una vegada que el patogen ha colonitzat l'intestí, aconsegueix nivells molt alts podent disseminar a altres òrgans i pacients. Malgrat la seua importància, se sap molt poc sobre els gens que codifica ERV per a colonitzar l'intestí i sobre el mecanisme pel qual la microbiota suprimeix la seua colonització intestinal. En primer lloc hem utilitzat una metodologia prèviament descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generació d'una llibreria de mutants per transposició junt amb seqüenciació massiva, amb la finalitat d'identificar els gens codificats per ERV necessaris per a la colonització de l'intestí en ratolins. A més a més, hem realitzat anàlisi metatranscriptòmics per a identificar aquells gens més expressats. L'anàlisi ha identificat gens quina interrupció redueix significativament la colonització intestinal en l'intestí gros. Els gens que més van afectar la colonització codifiquen proteïnes relacionades amb l'absorció o el transport de diversos nutrients com els carbohidrats (subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la família LacI, àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa) o ions (proteïna transportadora dependent d'ATP (ABC) i proteïnes del grup [Fe-S]). El paper d'aquests gens en la colonització s'ha confirmat mitjançant experiments de mutagènesis directa i de competició amb el cep salvatge. A més, aquests gens afecten la colonització intestinal amb diferents antibiòtics (clindamicina i vancomicina). Per a identificar el mecanisme molecular pel qual cada gen afecta a la colonització, hem realitzat experiments in vitro i ex viu a més de l'anàlisi transcriptòmic. Els experiments in vitro confirmen que les proteïnes del grup [Fe-S] estan involucrades en el transport d'ions de ferro, principalment Fe3+. D'altra banda, els gens de la subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa i de l'àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa són necessaris per a la utilització de la manosa i l'àcid N-acetilmuràmic, respectivament, sucres que solen estar presents en l'intestí. També confirmem que el regulador transcripcional de la família LacI és un repressor que afecta proteïnes transportadores ABC, probablement implicades en l'absorció de carbohidrats. A més a més, alguns d'aquests gens estan codificats principalment per ceps clínics de E. faecium i en menor mesura per ceps comensals. En segon lloc, estudiem els mecanismes de protecció d'un consorci de cinc bacteris comensals, que adès s'havia demostrat que disminuïen la colonització intestinal per ERV en ratolins. Amb l'ús de transcriptòmica, metabolòmica i els assajos in vivo observem que el consorci bacterià inhibeix el creixement de ERV mitjançant la reducció de nutrients, concretament fructosa. Finalment, l'anàlisi ARN-Seq in vivo de cada aïllat en combinació amb els assajos ex viu i in vivo van demostrar que un sol bacteri (Olsenella sp.) proporciona protecció. En conjunt, els resultats obtinguts han identificat la funció de gens específics requerits per ERV per a colonitzar l'intestí. A més, hem identificat un mecanisme mitjançant el qual la microbiota confereix protecció. Aquests resultats podrien conduir a nous enfocaments terapèutics per a previndre les infeccions causades per aquest patogen multiresistent als antibiòtics. / [EN] Multidrug-resistant bacteria, such as vancomycin-resistant-Enterococcus (VRE), are an increasing problem in hospitalized patients. Some VRE strains can be resistant to most available antibiotics, thus, alternative strategies to antibiotics are urgently needed to combat these challenging pathogens. Infections caused by VRE frequently start by colonization of the intestinal tract, a crucial step that is impaired by the presence of the intestinal microbiota. Administration of antibiotics disrupts the microbiota, which promotes VRE intestinal colonization. Once VRE has colonized the gut, it reaches very high levels, which promotes its dissemination to other organs and its transfer to other patients. Despite the relevance of VRE gut colonization, very little is known about the genes encoded by this pathogen to colonize the gut and about the mechanisms by which the microbiota suppresses VRE gut colonization. In this thesis, we have utilized a previously described methodology (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), based on the generation of a transposon mutant library coupled with high-throughput sequencing, in order to identify VRE encoded genes required for colonization of the mouse intestinal tract. In addition, we have performed metatranscriptomic analysis in mice to identify VRE genes specifically expressed in the gut. Our analysis has identified genes whose disruption significantly reduces VRE gut colonization in the large intestine. The genes that most affected VRE gut colonization encoded for proteins related to the uptake or transport of diverse nutrients such as carbohydrates (PTS mannose transporter subunit EIIAB, LacI family DNA-binding transcriptional regulator, N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase) or ions (phosphate ABC transporter ATP-binding protein and proteins from [Fe-S] cluster). The role of these genes in gut colonization has been confirmed through targeted mutagenesis and competition experiments against a wild type strain. Moreover, these genes affect gut colonization under different antibiotic treatments (clindamycin and vancomycin). To elucidate the mechanism by which each gene influences gut colonization, we have performed in vitro and ex vivo experiments besides transcriptomic analysis. In vitro experiments confirm that proteins from [Fe-S] cluster are involved in the transport of different forms of iron ions, mostly Fe3+. On the other hand, the PTS mannose transporter subunit EIIAB and N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase genes are required for the utilization of mannose and N-acetyl-muramic acid, respectively, sugars that are usually present in the intestinal environment. We have also confirmed that LacI family DNA-binding transcriptional regulator is a repressor that affects the expression of genes encoding for an ABC transporter probably involved in the uptake of carbohydrates. Furthermore, we have confirmed that some of these genes are encoded mainly by E. faecium clinical strains but not or to a lower extent by commensal strains. Secondly, we studied the mechanisms of protection of a consortium of five commensals bacteria, previously shown to restrict VRE gut colonization in mice. Functional transcriptomics in combination with targeted metabolomics and in vivo assays performed in this thesis indicated that the bacterial consortium inhibits VRE growth through nutrient depletion, specifically by reducing the levels of fructose. Finally, in vivo RNA-Seq analysis of each bacterial isolate of the consortium in combination with ex vivo and in vivo assays demonstrated that a single bacterium (Olsenella sp.) could recapitulate the protective effect. Altogether, the results obtained have identified the function of specific genes required by VRE to colonize the gut. In addition, we have identified a specific mechanism by which the microbiota confers protection against VRE colonization. These results could lead to novel therapeutic approaches to prevent infections caused by this pathogen. / Flor Duro, A. (2021). Characterization of Genes and Functions Required by Multidrug-resistant Enterococci to Colonize the Intestine [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166494

Tesis por compendio / [ES] En la presente tesis doctoral, se llevaron a cabo diferentes experimentos en dorada (Sparus aurata) y trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), con el objetivo contribuir a la optimización de los piensos acuícolas con alta y total sustitución de la harina de pescado (HP), así como la inclusión de aditivos evaluando el crecimiento, la eficiencia nutritiva y la salud intestinal de los peces. Además, se realizó un análisis del ciclo de vida para evaluar la sostenibilidad de las diferentes formulaciones de piensos. El primer experimento se llevó a cabo con truchas arco iris de 13 g de peso medio inicial y finalizó tras 11 semanas. Los animales fueron alimentados con piensos con tres niveles de sustitución de la HP (100%, 90% y 80%, denominadas FM0, FM10 y FM20, respectivamente) por fuentes de proteínas vegetales (gluten de trigo y torta de soja), considerándose la dieta FM20 como dieta control. Se evaluó el crecimiento, la mortalidad y la salud intestinal de la trucha arco iris. Se encontraron diferencias significativas en el crecimiento, con un menor peso final y TCI para los peces alimentados con la dieta FM0. La TAD y el ICA también variaron de acuerdo al tratamiento, siendo mayor para la dieta FM0. A nivel histológico, el grupo FM0 registró los valores más altos de AV, espesor de la lámina propia (LP) y el valor más bajo de CC. Los peces alimentados con la dieta FM0 presentaron una mayor expresión tanto en los genes inmunes como inflamatorios. Estos resultados indican que el 90% de la sustitución de HP en piensos para esta especie es posible cuando se usa una mezcla de proteínas vegetales. En un segundo experimento, se evaluó el uso de dos aditivos (mucosa porcina hidrolizada-MPH y un concentrado de nucleótidos-NT) en piensos para doradas con sustitución total de la HP, con el objetivo de determinar los efectos sobre el crecimiento, eficiencia alimenticia, digestibilidad de la proteína e histología intestinal. El experimento inició con doradas de 11 g de peso medio y finalizó tras 134 días. Se formularon seis dietas, FM100 y AA0 como dietas control (proteína basada 100% en HP y harinas vegetales, respectivamente), P1 y P2 (1% y 2% de MPH), N250 y N500 (250 mg/kg y 500 mg/kg de NT). Todos los grupos mostraron una mejora significativa en el peso corporal final y la tasa de crecimiento instantáneo (TCI) en comparación con el grupo control (AA0). A nivel histológico se observaron diferencias significativas tanto en la anchura de las vellosidades (AV) como en el recuento de células caliciformes (CC). Las actividades enzimáticas digestivas presentaron diferencias significativas. Los resultados señalaron que, tanto la suplementación con MPH y NT, puede mejorar el crecimiento de los peces y que su inclusión en bajas dosis, mejora los parámetros nutritivos y la capacidad digestiva. Un tercer experimento evaluó el efecto de la sustitución parcial y total de HP en dietas para doradas. La dieta control (FM100) contenía HP como principal fuente proteica, en las dietas FM25, FM10 y FM0 se sustituyó la HP en un 75%, 90% y 100% por una mezcla de harinas proteicas vegetales y animal (cerdo ibérico), y en la dieta FM0+ (misma formulación que FM0) se incluyeron 50 g/kg de la microalga Isochrysis aff. galbana (T-Iso). El experimento inició con peces de 64 g de peso medio. Tras 88 días de experimento, los peces alimentados con los piensos FM25 y FM100 presentaron el mejor crecimiento y los peces alimentados con las dietas FM0+ y FM10 alcanzaron un mayor peso y TCI que los alimentados con la dieta FM0. El valor productivo de la proteína (VPP) y el valor productivo de la energía (VPE) fueron más bajos en los peces alimentados con la dieta FM0. Con estos resultados se pudo concluir que hasta un 75% de sustitución de HP por una mezcla de proteínas vegetales y animal en dietas para dorada es factible para un óptimo crecimiento y la inclusión de Isochrysis aff. galbana (T-Iso) a los niveles ensayados mejoró las eficiencias de crecimiento. / [CA] En la present tesi doctoral, es van dur a terme diferents experiments en orades (Sparus aurata) i truites arc iris (Oncorhynchus mykiss), amb l'objectiu contribuir a l'optimització dels pinsos aqüícoles amb alta i total substitució de la farina de peix (FP), així com la inclusió d'additius avaluant el creixement, l'eficiència nutritiva i la salut intestinal dels peixos. A més, es va realitzar una anàlisi del cicle de vida per avaluar la sostenibilitat de les diferents formulacions de pinsos. El primer experiment es va dur a terme amb truites arc iris de 13 g de pes mitjà inicial i va finalitzar després d'11 setmanes. Els animals van ser alimentats amb pinsos amb tres nivells de substitució de la FP (100%, 90% i 80%, denominades FM0, FM10 i FM20, respectivament) per fonts de proteïnes vegetals (gluten de blat i tortó de soja), considerant-se la dieta FM20 com a dieta control. Es va avaluar el creixement, la mortalitat i la salut intestinal dels peixos. Es van trobar diferències significatives en el creixement, amb un menor pes final i TCI per als peixos alimentats amb la dieta FM0. La TAD i el ICA també van variar d'acord amb el tractament, sent major per a la dieta FM0. A nivell histològic, el grup FM0 va registrar els valors més alts de AV, grossària de la làmina pròpia (LP) i el valor més baix de CC. Els peixos alimentats amb la dieta FM0 van presentar una major expressió tant en els gens immunes com inflamatoris. Aquests resultats indiquen que el 90% de la substitució de FP en pinsos per a aquesta espècie és possible quan s'utilitza una mescla de proteïnes vegetals. Un segon experiment va avaluar l'ús de dos additius (mucosa porcina hidrolitzada-MPH i un concentrat de nucleòtids-NT) en pinsos per a orades amb substitució total de la FP, amb l'objectiu de determinar els efectes sobre el creixement, eficiència alimentosa, digestibilitat proteica i histologia intestinal. L'experiment es va iniciar amb orades d'11 g de pes mitjà i es va finalitzar després de 134 dies. Es van formular sis dietes, FM100 i AA0 com a dietes control (proteïna basada 100% en FP i farines vegetals, respectivament), P1 i P2 (1% i 2% de MPH), N250 i N500 (250 mg/kg i 500 mg/ kg de NT). Tots els grups van mostrar una millora significativa en el pes corporal final i la taxa de creixement instantani (TCI) en comparació del grup control (AA0). A nivell histològic es van observar diferències significatives tant en l'amplària de les vellositats (AV) com en el recompte de cèl·lules caliciformes (CC). Les activitats enzimàtiques digestives van presentar diferències significatives. Els resultats van assenyalar que, tant la suplementació amb MPH i NT, pot millorar el creixement dels peixos i que la seua inclusió en baixes dosis, millora els paràmetres nutritius i la capacitat digestiva. En un tercer experiment, es va avaluar l'efecte de la substitució parcial i total de FP en dietes per a orades. La dieta control (FM100) contenia FP com a principal font proteica, en les dietes FM25, FM10 i FM0 es va substituir la FP en un 75%, 90% i 100% per una mescla de farines proteiques vegetals i animal (porc ibèric), i en la dieta FM0+ (mateixa formulació que FM0) es van incloure 50 g/kg de la microalga Isochrysis aff. galbana (T-Iso). L'experiment es va iniciar amb peixos de 64 g de pes mitjà. Després de 88 dies d'experiment, els peixos alimentats amb els pinsos FM25 i FM100 van presentar el millor creixement i els peixos alimentats amb les dietes FM0+ i FM10 van aconseguir un major pes i TCI que els alimentats amb la dieta FM0. El valor productiu de la proteïna (VPP) i el valor productiu de l'energia (VPE) van ser més baixos en els peixos alimentats amb la dieta FM0. Amb aquests resultats es va poder concloure que fins a un 75% de substitució de FP per una mescla de proteïnes vegetals i animal en dietes per a orada és factible per a un òptim creixement i la inclusió de Isochrysis aff. galbana (T-Iso) als nivells assajats va millorar les eficiències de creixement. / [EN] In the present doctoral thesis, different experiments were carried out on gilthead seabream (Sparus aurata) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), to contribute to the optimization of aquafeeds with high and total fishmeal (FM) replacement, as well as the additives inclusion evaluating the growth, nutritional efficiency and intestinal health of fish. In addition, a life cycle assessment was performed to assess the sustainability of different feed formulations. The first experiment was carried out with rainbow trout of 13 g mean initial weight and ended after 11 weeks. The animals were fed feeds with three levels of FM replacement (100%, 90% and 80%, called FM0, FM10 and FM20, respectively) by plant protein sources (wheat gluten and soybean meal), with the FM20 diet being considered as the control diet. Growth, mortality, and intestinal health of rainbow trout were evaluated. Significant differences were found in growth, with a lower final weight and SGR for the fish fed with the FM0 diet. The FI and the FCR also varied according to the treatment, being higher for the FM0 diet. At the histological level, the FM0 group recorded the highest values of VT, lamina propria thickness (LP) and the lowest value of GC. Fish fed the FM0 diet had higher expression of both immune and inflammatory genes. These results indicate that 90% of FM replacement in feed for this species is possible when a plant protein blend is used. A second experiment evaluated the use of two feed additives (hydrolyzed porcine mucosa-HPM and a nucleotide concentrate-NT) as supplements in feeds for gilthead seabream with total FM replacement, intending to determine the possible effects on growth, feed efficiency, protein digestion and gut histology. The experiment started with gilthead seabream of 11 g average weight and ended after 134 days. Six diets were formulated, FM100 and AA0 as control diets (100% FM-based protein and vegetable meals, respectively), P1 and P2 (1% and 2% HPM), N250 and N500 (250 mg/kg and 500 mg/kg NT). All groups showed a significant improvement in final body weight and specific growth rate (SGR) compared to the control group (AA0). Significant differences were observed at the histological level in villi thickness (VT) and goblet cells (GC). Digestive enzyme activities showed significant differences. The results indicated that HPM and NT supplementation can improve fish growth and that their inclusion in low doses improves nutritional parameters and digestive capacity. The effect of partial and total FM replacement in gilthead seabream diets was evaluated in a third experiment. The control diet (FM100) contained FM as the main protein source, in the FM25, FM10 and FM0 diets, 75%, 90% and 100% of the FM was replaced by a plant and animal (Iberian pig) proteins blend, and in the FM0+ diet (same formulation as FM0) 50 g/kg of the microalgae Isochrysis aff. galbana (T-Iso) was included. The experiment was started with fish of 64 g average weight. After 88 days of the experiment, the fish fed with the FM25 and FM100 diets showed the best growth and the fish fed with FM0+ and FM10 diets reached a higher weight and SGR than those fed FM0 diet. The retention efficiency of protein (PIR) and energy intake (EIR) were lowest in the fish fed with the FM0 diet. With these results, it was possible to conclude that up to 75% FM replacement by a plant and animal proteins blend in diets for gilthead seabream is feasible for optimal growth and the inclusion of Isochrysis aff. galbana (T-Iso) at the levels tested improved growth efficiencies. / Vélez Calabria, GM. (2024). Optimización del crecimiento de peces carnívoros alimentados con piensos con alta sustitución de harina de pescado [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/206739 / Compendio