Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

Our understanding of the folding of membrane proteins lags behind that of soluble proteins due to the challenges posed by the exposure of hydrophobic regions during in vitro chemical denaturation and refolding experiments. While different folding models are accepted for soluble proteins, only the two-stage model and the long-range interactions model have been proposed so far for helical membrane proteins. To address our knowledge gap on how different membrane proteins traverse their folding landscapes, Chapter 2 investigates the structural features of SDS-denatured states and the kinetics for reversible unfolding of sensory rhodopsin II (pSRII), a retinal-binding photophobic receptor from Natronomonas pharaonis. pSRII is difficult to denature, and only SDS can dislodge the retinal chromophore without rapid aggregation. Even in 30% SDS (0.998 $\mathit{\Chi}_{SDS}$), pSRII retains the equivalent of six out of seven transmembrane helices, while the retinal binding pocket is disrupted, with transmembrane residues becoming more solvent-exposed. Folding of pSRII from an SDS-denatured state harbouring a covalently-bound retinal chromophore shows deviations from an apparent two-state behaviour. SDS denaturation to form the sensory opsin apo-protein is reversible. This chapter establishes pSRII as a new model protein which is suitable for membrane protein folding studies and has a unique folding mechanism that differs from those of bacteriorhodopsin and bovine rhodopsin. In Chapter 3, SDS-denatured pSRII, acid-denatured pSRII and sensory opsin obtained by hydroxylamine-mediated bleaching of pSRII were characterised by solution state NMR. 1D $^1$H and $^{19}$F NMR were first used to characterise global changes in backbone amide protons and tryptophan side-chains. Residue-specific changes in backbone amide chemical shifts and peak intensities in 2D [$^1$H,$^{15}$N]-correlation spectra were analysed. While only small changes in the chemical environment of backbone amides were detected, changes in backbone amide dynamics were identified as an important feature of SDS- and acid-denatured pSRII and sensory opsin. $^{15}$N relaxation experiments were performed to study the backbone amide dynamics of SDS-denatured pSRII, reflecting motions on different timescales, including fast fluctuations of NH bond vectors on the ps-ns timescale and the lack of exchange contributions on the µs timescale. These studies shed insight on differences in the unfolding pathways under different denaturing conditions and the crucial role of the retinal chromophore in governing the structural integrity and dynamics of the pSRII helical bundle. Hydrogen bonds play fundamental roles in stabilising protein secondary and tertiary structure, and regulating protein function. Successful detection of hydrogen bonds in denatured states and during protein folding would contribute towards our understanding on the unfolding and folding pathways of the protein. Previous studies have demonstrated residue-specific detection of stable and transient hydrogen bonds in small globular proteins by measuring $^1{\it J}_{NH}$ scalar coupling constants using NMR. In Chapter 4, different methods for measuring $^1{\it J}_{NH}$ scalar coupling were explored using RalA, a small GTPase with a mixed alpha/beta fold, as proof-of-concept. Detection of hydrogen bonds was then attempted with OmpX, a beta-barrel membrane protein, both in its folded state in DPC micelles and in the urea-denatured state. While $^1{\it J}_{NH}$ measurement holds promise for studying hydrogen bond formation, further optimisation of NMR experiments and utilisation of perdeuterated samples are required to improve the precision of such measurements in large detergent-membrane protein complexes. Naturally occurring split inteins can mediate spontaneous trans-splicing both in vivo and in vitro. Previous studies have demonstrated successful assembly of proteorhodopsin from two separate fragments consisting of helices A-B and helices C-G via a splicing site in the BC loop. To complement the in vitro unfolding/folding studies, pSRII assembly in vivo was attempted by introducing a splicing site in the loop region of the beta-hairpin constituting the BC loop of pSRII. The expression conditions for the N- and C-terminal pSRII-intein segments were optimised, and the two segments co-expressed. However, the native chromophore was not observed. Further optimisation is required for successful in vivo trans-splicing of pSRII and application of this approach towards understanding the roles of helices and loops in the folding of pSRII.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

Diplonema papillatum est un organisme unicellulaire qui vit dans l’océan. Son génome mitochondrial possède une caractéristique spéciale: tous les gènes sont brisés en de multiples fragments qui s’appellent modules. Chaque module est codé par un chromosome différent. L’expression d’un gène exige des épissages-en-trans qui assemblent un ARN messager complet à partir de tous les modules du gène. Nous avons précédemment montré que le gène cox1 est encodé dans neuf modules avec six Us non encodés entre le module 4 et le module 5 de l’ARN messager mature [1]. Nous n’avons identifié aucune séquence consensus connue de site d’épissage près des modules. Nous spéculons qu’un ARN guide (gRNA) a dirigé l’épissage-en-trans du gène cox1 par un mécanisme qui est semblable à l’édition d’ARN par l’insertion/la suppression des Us chez les kinétoplastides, le groupe sœur des diplonémides. Nous avons trouvé que les six Us sont ajoutés au bout 3’ de l’ARN d’une façon semblable à ceux ajoutés par le TUTase lors de l’édition de l’insertion des Us chez les kinétoplastides. Nous avons construit des profils de gRNA de l’épissage-en-trans avec les expressions régulières basé sur notre connaissance des gRNAs dans l’édition d’ARN chez les kinétoplastides. Selon la complémentarité partielle entre le gRNA et les deux modules adjacents, nous avons généré des amorces pour RT-PCR visant à détecter des séquences qui sont assorties à un des profils de gRNA. Une expérience pilote in vitro n’a pas permis de reconstituer l’épissage-en-trans des modules 3, 4, et 5, suggérant que nous devons améliorer nos techniques. / Diplonema papillatum is a single cellular organism that lives in the ocean. Its mitochondrial genome possesses a special feature: all genes are fragmented in multiple pieces that are called modules and each module is encoded by a different chromosome. Expression of a gene requires trans-splicing that successfully assemble a full-length mRNA from all modules of the gene. It was previously shown that the cox1 gene is encoded in nine modules that are all located on different chromosomes; moreover, a stretch of six non-encoded Us exist between Module 4 and 5 in the mature mRNA [1]. No consensus sequence of known splicing sites was identified near the modules. We speculate that trans-splicing of the cox1 gene is directed by guide RNAs (gRNAs) via a mechanism that is similar to U-insertion/deletion editing in kinetoplastids, the sister group of diplonemids. We have detected populations of small RNA molecules that could come from mitochondrial. We found that the six Us were added to the 3’ end of Module 4 in a similar way to the Us added by the TUTase in kinetoplastid U-insertional editing. Sequence profiles of possible trans-splicing gRNAs were constructed in regular expressions based on our knowledge of known gRNAs in kinetoplastid RNA editing. According to the complementarity between the gRNA and the two adjacent modules, primers were designed for RT-PCR that aims to detect gRNA sequences. Among the results, we identified sequences that match or partially match the gRNA profiles. A pilot in vitro assay did not reconstitute trans-splicing of module 3, 4 and 5, suggesting that further technical improvements are needed.