A doença do sono é um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento das áreas rurais da África Subsaariana. O diagnóstico positivo da doença do sono, bem como o estágio em que ela se encontra, é essencial perante a severidade da doença e toxicidade dos medicamentos disponíveis para o tratamento. A eficiência do tratamento e diagnóstico depende do conhecimento do ciclo de vida, biologia do parasito e seu metabolismo. Os tripanossomatídeos possuem mecanismos conservados entre si como a expressão gênica, neste contexto o Trypanosoma brucei pode ser considerado um organismo modelo e o estudo do processamento de RNA mensageiro por splicing neste parasito pode ser extrapolado para outros tripanosomatídeos. O processo de excisão dos íntrons e junção dos éxons é chamado splicing, e tanto o cis quanto o trans-splicing são reações de transesterificação realizados pelo spliceosomo, que consiste de 5 partículas nucleares, as snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein) U1, U2, U4, U5 e U6 bem como proteínas não específicas de snRNPs. As snRNPs são complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) unidos fortemente a proteínas. São conhecidas oito proteínas específicas de U5 snRNP em humanos 220K, 200K, 116K, 102K, 100K, 52K, 40K e 15K. Foi mostrado que a U5-15K humana é essencial em diversos pontos da formação do spliceosomo. O objetivo desse trabalho foi a caracterização estrutural e da atividade de autoclivagem da proteína U5-15K de T. brucei. Essa proteína pertencente à família Dim1e é formada por 155 resíduos de aminoácido e massa molecular de 17,7 kDa. A proteína recombinante clonada no vetor de expressão pET SUMO (Invitrogen) foi expressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por íons metálico em resina de Cobalto. O produto foi usado para testes da atividade de auto-clivagem, contendo ou não inibidores de protease. A proteína pura também foi usada em estudos de suas propriedades em solução por experimentos de DLS, que mostrou uma maior homogeneidade da proteína na presença de MgCl2, DSF, que mostrou a estabilidade da U5-15K em solução com relação ao pH. As mudanças de conformação da estrutura secundária da U5-15K e U5-15K clivada foi estudada por experimentos de CD, que mostraram uma redução na porcentagem de folhas-β na estrutura terciária da U5-15K clivada, e foi construído um modelo tridimensional através da modelagem por homologia, que foi comparado com os resultados obtidos por experimentos de SAXS. Foram realizados ensaios de cristalização em diversas condições provenientes de kits comerciais com a proteína nas formas clivada e não clivada e em diferentes concentrações. Como perspectivas ficam a definição exata do ponto de clivagem por espectrometria de massas, proteólise da alça flexível para novos ensaios de cristalização e estudo das mutações nos possíveis sítios ativos e sítio de clivagem. / Sleep sickness is one the most important public health problem in the Africa and it causative agent, Trypanosma brucei, is an organism model for the study of different conserved process among the trypanosomatids. In trypanosomes, mRNAs are processed by trans-splicing, in which a common spliced leader sequence (SL) is acquired at the 5\' end of the mRNA to yield a mature transcript. RNA splicing is carried out by the spliceosome, which consists of the U1, U2, U4, U5 and U6 U snRNPs particles and non-snRNP proteins. The ribonucleoproteins are complexes that consist of small uridine-rich RNAs (U snRNAs) and interact with common Sm proteins and proteins that are specific for each snRNP. Seven U5 snRNP specific proteins are known in trypanosomes, 220K, 200K, 116K, 102K, Cwc21, 40K e 15K. The spliceosomal protein U5-15K is essential for the parasite viability and various evidences suggest participation of the member in spliceosome assembly. U5-15K presents a conserved domain dim1, its molecular weight is estimated of 17,7 kDa and 155 amino acids residues. In this work, U5-15K was cloned into pET SUMO (Invitrogen), transformed in BL21(DE3)pLysS and recombinant protein was purified by immobilized ion affinity chromatography. It was possible observe that U5-15K undergo self-cleavage, process inhibited by serine and cysteine protease inhibitors. Dynamic Light Scattering (DLS) experiments showed higher protein homogeneity in the presence of MgCl2 and Differential Scanning Fluorimetry (DSF) data demonstrated higher stability at neutral pH. Circular dichroism (CD) spectra obtained using U5-15K native and cleaved suggest a reduction in percentage of β-sheets at cleaved U5-15K secondary structure. Native and cleaved proteins at different concentrations were used in crystallization trials, however, no suitable protein crystals were observed. A tridimensional homology model for U5-15K from Trypanosoma brucei, using as template the human homologue, present a thioredoxin folding, although it has observed a possible central loop not present in the template. We intent to determine the exact cleavage point using mass spectrometry and new crystallization trials will be performed after removal of probable loops by limited proteolysis.

A doença do sono é um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento das áreas rurais da África Subsaariana. O diagnóstico positivo da doença do sono, bem como o estágio em que ela se encontra, é essencial perante a severidade da doença e toxicidade dos medicamentos disponíveis para o tratamento. A eficiência do tratamento e diagnóstico depende do conhecimento do ciclo de vida, biologia do parasito e seu metabolismo. Os tripanossomatídeos possuem mecanismos conservados entre si como a expressão gênica, neste contexto o Trypanosoma brucei pode ser considerado um organismo modelo e o estudo do processamento de RNA mensageiro por splicing neste parasito pode ser extrapolado para outros tripanosomatídeos. O processo de excisão dos íntrons e junção dos éxons é chamado splicing, e tanto o cis quanto o trans-splicing são reações de transesterificação realizados pelo spliceosomo, que consiste de 5 partículas nucleares, as snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein) U1, U2, U4, U5 e U6 bem como proteínas não específicas de snRNPs. As snRNPs são complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) unidos fortemente a proteínas. São conhecidas oito proteínas específicas de U5 snRNP em humanos 220K, 200K, 116K, 102K, 100K, 52K, 40K e 15K. Foi mostrado que a U5-15K humana é essencial em diversos pontos da formação do spliceosomo. O objetivo desse trabalho foi a caracterização estrutural e da atividade de autoclivagem da proteína U5-15K de T. brucei. Essa proteína pertencente à família Dim1e é formada por 155 resíduos de aminoácido e massa molecular de 17,7 kDa. A proteína recombinante clonada no vetor de expressão pET SUMO (Invitrogen) foi expressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por íons metálico em resina de Cobalto. O produto foi usado para testes da atividade de auto-clivagem, contendo ou não inibidores de protease. A proteína pura também foi usada em estudos de suas propriedades em solução por experimentos de DLS, que mostrou uma maior homogeneidade da proteína na presença de MgCl2, DSF, que mostrou a estabilidade da U5-15K em solução com relação ao pH. As mudanças de conformação da estrutura secundária da U5-15K e U5-15K clivada foi estudada por experimentos de CD, que mostraram uma redução na porcentagem de folhas-β na estrutura terciária da U5-15K clivada, e foi construído um modelo tridimensional através da modelagem por homologia, que foi comparado com os resultados obtidos por experimentos de SAXS. Foram realizados ensaios de cristalização em diversas condições provenientes de kits comerciais com a proteína nas formas clivada e não clivada e em diferentes concentrações. Como perspectivas ficam a definição exata do ponto de clivagem por espectrometria de massas, proteólise da alça flexível para novos ensaios de cristalização e estudo das mutações nos possíveis sítios ativos e sítio de clivagem. / Sleep sickness is one the most important public health problem in the Africa and it causative agent, Trypanosma brucei, is an organism model for the study of different conserved process among the trypanosomatids. In trypanosomes, mRNAs are processed by trans-splicing, in which a common spliced leader sequence (SL) is acquired at the 5\' end of the mRNA to yield a mature transcript. RNA splicing is carried out by the spliceosome, which consists of the U1, U2, U4, U5 and U6 U snRNPs particles and non-snRNP proteins. The ribonucleoproteins are complexes that consist of small uridine-rich RNAs (U snRNAs) and interact with common Sm proteins and proteins that are specific for each snRNP. Seven U5 snRNP specific proteins are known in trypanosomes, 220K, 200K, 116K, 102K, Cwc21, 40K e 15K. The spliceosomal protein U5-15K is essential for the parasite viability and various evidences suggest participation of the member in spliceosome assembly. U5-15K presents a conserved domain dim1, its molecular weight is estimated of 17,7 kDa and 155 amino acids residues. In this work, U5-15K was cloned into pET SUMO (Invitrogen), transformed in BL21(DE3)pLysS and recombinant protein was purified by immobilized ion affinity chromatography. It was possible observe that U5-15K undergo self-cleavage, process inhibited by serine and cysteine protease inhibitors. Dynamic Light Scattering (DLS) experiments showed higher protein homogeneity in the presence of MgCl2 and Differential Scanning Fluorimetry (DSF) data demonstrated higher stability at neutral pH. Circular dichroism (CD) spectra obtained using U5-15K native and cleaved suggest a reduction in percentage of β-sheets at cleaved U5-15K secondary structure. Native and cleaved proteins at different concentrations were used in crystallization trials, however, no suitable protein crystals were observed. A tridimensional homology model for U5-15K from Trypanosoma brucei, using as template the human homologue, present a thioredoxin folding, although it has observed a possible central loop not present in the template. We intent to determine the exact cleavage point using mass spectrometry and new crystallization trials will be performed after removal of probable loops by limited proteolysis.

Les dysferlinopathies sont des maladies musculaires dues à une déficience en protéine dysferline, codée par le gène DYSF. Dans ce travail de thèse, trois approches thérapeutiques ont été évaluées pour ces pathologies, sur des modèles cellulaires et murins. Un variant transcriptionnel court de la dysferline a été vectorisé dans un AAV8r et injecté dans le modèle murin Bla/J, déficient en dysferline. L’analyse des muscles des animaux traités montre une augmentation de la résistance des fibres musculaires au stress mécanique, mais n’apporte pas de correction histologique. Cette étude souligne également la toxicité de cette miniprotéine. L’anoctamine 5, impliquée dans des pathologies et des activités similaires à la dysferline, a été testée en tant que protéine compensatrice. L’anoctamine 5 surexprimée dans le modèle Bla/J ne permet pas la restauration d’un phénotype normal. La compensation de DYSF par ANO5 n’est donc pas une voie thérapeutique à exploiter pour les dysferlinopathies. Enfin, une thérapie génique par chirurgie de l’ARN dysferline a été évaluée en utilisant le trans-épissage médié par le splicéosome (SMaRT). La preuve de principe de la reprogrammation d’un minigène dysferline a été faite (ARN et protéine trans-épissée obtenus in vitro). L’efficacité du SMaRT dans un contexte endogène s’est en revanche révélée faible, et n’a pas permis la restauration d’une protéine dysferline fonctionnelle dans des myoblastes humains. De plus, l’observation de l’expression de protéines directement à partir du RTM (RNA-trans-splicing molecule) a fait apparaître des limites à l’utilisation du SMaRT pour la thérapie génique, et en particulier pour les dysferlinopathies. / Dysferlinopathies are muscular diseases due to mutations in DYSF gene, inducing dysferlin protein deficiency. In this thesis, three therapeutic approaches have been investigated for these pathologies, on cell or mice models. A short transcriptional dysferlin variant has been injected into Bla/J dysferlin deficient mouse model, using AAV8r vector. Muscle fibers of treated animals displayed an increased resistance to mechanical stress without therapeutic benefit. These experiments also pointed out the toxicity of this strategy. A protein compensation approach has been tested using anoctamin 5, known to be involved in pathologies and activities similar to dysferlin’s ones. AAVr mediated Anoctamin 5 overexpression in Bla/J model does not rescue their muscle phenotype. Overexpression of ANO5 does not seem to be a valuable therapeutic strategy for dysferlin deficiency. Dysferlin RNA surgery was evaluated as a possible genetic therapy using Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing (SMaRT). On a Minigene target, SMaRT is able to induce RNA reprogramming by trans-splicing, and produce the corresponding protein. But efficiency is by far decreased in endogenous context and not good enough to restore functional dysferlin in human myoblasts. Moreover, we described proteins resulting from RNA-trans-splicing molecule (RTM) self-expression, limiting the value of SMaRT as therapeutic strategy, especially for dysferlinopathies.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 5 uppsatser.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:29:39Z : No. of bitstreams: 1 ambrosio_dl_me_arafcf.pdf: 2442154 bytes, checksum: cc3386b51bef3a73071ee6043f88fc0e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Alguns fatores importantes no funcionamento das células eucarióticas correspondem à pequenos complexos de RNA e proteínas; essas partículas de ribonucleoproteínas (UsnRNPs) têm um papel essencial no processamento do pré-mRNA, principalmente durante o splicing (corte de íntrons e união de éxons). Embora as snRNPs estejam definidas em mamíferos, ainda não estão bem caracterizadas em certos tripanosomatídeos como o Trypanosoma cruzi. Assim, este trabalho propôs a caracterização molecular dos snRNAs (U2, U4, U5 e U6), por PCR e RT-PCR de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y). Essas seqüências amplificadas foram clonadas, seqüenciadas e comparadas entre os tripanosomatídeos e o alinhamento múltiplo apresentou mais de 70% de identidade, exceto da U5 snRNA, que se mostrou menos conservada. Árvores filogenéticas mostraram a proximidade evolutiva dos snRNAs analisados em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. As respectivas estruturas secundárias foram preditas, confirmando-se também as semelhanças com aquelas de T. brucei. O alinhamento das snRNAs de T. cruzi com as seqüências de Homo sapiens mostrou regiões únicas em U2, U4 e U5 snRNAs, nessa espécie, enquanto U6 mostrou-se fortemente conservada. Até o momento, ainda não foi possível a obtenção da seqüência completa de U1 snRNA de T. cruzi. / Some important factors in functioning of the eucariotic cells are the small complexes of RNA and proteins; these particles of ribonucleoproteins (UsnRNPs) have an essential role in the pre-mRNA processing, mainly during splicing (cut of introns and union of exons). Even though they are well defined in mammals, snRNPs are still not characterized in certain Trypanosomatids, as well, Trypanosoma cruzi. So, this work proposed the molecular characterization of the snRNAs (U2, U4, U5 and U6), by PCR and RT-PCR with T. cruzi epimastigote forms (Y strain). These amplified sequences were cloned, sequenced and compared among the Trypanosomatids and the multiple alignment presented more than 70% of identity, except for U5 snRNA, which showed less conserved. Phylogenetic trees showed the evolutionary proximity between the Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi snRNAs analysed. The respective secondary structures were predicted and also confirmed similarity with T. brucei. The alignment of T. cruzi snRNAs with Homo sapiens sequences showed unique regions in U2, U4 and U5 snRNAs in this species, while U6 was strongly conserved. Until this moment, it was not still possible to obtain U1 snRNA of T. cruzi complete sequence.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-26Bitstream added on 2014-06-13T19:19:51Z : No. of bitstreams: 1 silva_mta_dr_araiq.pdf: 3269290 bytes, checksum: 226805a8de91ee25f88e83234f61efa0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A família Trypanosomatidae inclui diversos parasitas protozoários responsáveis por diferentes doenças humanas. Várias evidências sugerem importantes diferenças entre a maquinária de tradução e processamento de mRNA (trans-splicing) em Tripanosomatídeos quando comparados com eucariótos superiores. Neste contexto, alguns fatores importantes para o funcionamento da célula eucarióticas são os pequenos complexos constituídos de proteínas e RNA, chamados de ribonucleoproteínas (U snRNPs). Esta partículas possuem papel essencial no processamento de RNA mensageiros e durante a reação de splicing apresenta um core comum composto por proteínas (proteínas Sm) and RNAs estruturais (U snRNAs) e um conjunto de proteínas específicas de cada complexo. Embora bem definidas em mamíferos, snRNPs permanecem pouco caracterizadas em Tripanosomatídeos. Ferramentos de bioinformática identificaram quatro possíveis proteínas específicas do complexo U5 snRNP (U5-15K, U5-40K, U5-102K e U5-116K), e importantes parâmetros foram determinados, como peso molecular estimado, domínios e motivos conservados. Este trabalho demonstrou que U5-15K e 45-102K são altamente conservadas entre o Tripanosomatídeos e os domínios Dim1 and Prp1 foram identificados, respectivamente. Técnicas de purificação de complexos (PTP-tag) revelaram que estas proteínas interagem com o U5 snRNA, sugerindo que participem do complexo U5 snRNP. Análises funcionais demonstraram que U5-15K é essencial para viabilidade celular e que de alguma forma esta asssociada tanta a reação de cis quanto de tras-splcing. Experimentos de imunolocalização de U5-15K and U5-102K corroboram este dados, uma vez que as protínas em questão possuem localização nuclear. / There are several protozoan parasites in Trypanosomatidae family, including different agents responsible for human diseases. Several evidences suggest important differences in the translational system and mRNA processing (trans-splicing) in Trypanosomatids when compared to higher eukaryotes. In this context, some important factors for the functioning of eukaryotic cells are the small complexes of RNA and proteins; these particles of ribonucleoproteins (UsnRNPs) have an essential role in the pre-mRNA processing, mainly during splicing. UsnRNP presents a common protein core associated between itself and with the snRNA, named Sm proteins and specific proteins of each snRNP. Even though they are well defined in mammals, snRNPs are still not well characterized in certain Trypanosomatids. Bioinformatics analysis identified four possible U5 snRNP specific proteins (U5-15K, U5-40K, U5-102K and U5-116K), and important parameters were determinated, as estimated molecular weight, motifs and conserved domains. This work shows that the U5-15K and U5-102K proteins are highly conserved among different Tryponosomatids species and Dim1 and Prp1 domains were identified, respectively. Tandem affinity pull-down assay revealed that these proteins interact with U5snRNA, suggesting its participation in U5snRNP particle, and functional analysis showed that U5-15K is essential for cell viability and it is associated in some way to trans and cis-splicing machinery. Immunolocalization experiments corroborated those data, showed U5-15K and U5-102K in the nucleus of the cell.

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:39:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tainah_paula_ioc_dout_2013.pdf: 4720016 bytes, checksum: abb2c1119571eec6ea090739b5bbc8a7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A regulação gênica em tripanossomatídeos é policistrônica e ocorre de maneira pós-transcricional. Nas extremidades 5' e 3' dos RNA mensageiros existem segmentos que podem conter elementos regulatórios chamados UTR (Untranslated Regions), os quais são regiões transcritas, porém não-traduzidas. Para verificar se UTR de tamanhos diferentes possuem impacto na transcrição e, por conseguinte, na tradução de proteínas, selecionou-se genes da família de trans-sialidases, devido à importância destas no processo de invasão celular. A metodologia envolveu a extração de RNA total de T. cruzi CL-Brener, seguido da síntese de cDNA, PCR, clonagem dos produtos amplificados e seqüenciamento por Sanger e pelo uso do 454 Junior (Next Generation Sequencing \2013 NSG). Como as trans-sialidases correspondem a uma família gênica de cópias múltiplas, usou-se a estratégia de sequenciamento de alto-desempenho na tentativa de cobrir o maior número possível de genes desta família. Para isso foram obtidos cDNAs de trans-sialidases de CL-Brener nas formas epimastigota e tripomastigota com o iniciador 5\2019UTRTCNA, os quais apresentaram UTR com tamanhos variados entre 65 \2013 187 pb, além da obtenção de cDNAs para esta família de proteínas, em epimastigotas CL-Brener, com o iniciador 5\2019TcTS, apresentando UTR variando de 171 a 221 pb, com similaridade de sequências entre elas. Com o intuito de avaliar a correspondência entre a transcrição dos RNAs de trans-sialidases e a sua tradução, houve a necessidade de identificação das proteínas. Desenvolvemos uma metodologia de lise celular e produção de extrato proteico (denominado TcS12) a partir de células de T. cruzi no estágio epimastigota. As cepas selecionadas para esse estudo foram CL-Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y (TcII) e 4167 (TcIV) O processo de lise celular foi otimizado para 107 parasitos/mL ressuspensos em 200 \03BCL de tampão de lise hipotônica (por 30 minutos a 40C), associado ao sonicador de banho (por 30 minutos a 40C). A eficiência da metodologia foi validada pela citometria de fluxo mostrando que aproximadamente 72% das células foram marcadas com iodeto de propídeo (PI). A qualidade dos extratos proteicos foi analisada por LCMS/MS usando-se a estratégia MSE label free para quantificação relativa de proteínas. Foram identificadas 1153 proteínas totais, cuja expressão proteica das cepas 4167, Dm28c e Y, quando comparada à CL-Brener (cepa referência), apresentou 32, 51 e 73 proteínas up-expressed, enquanto que 80, 92 e 60 proteínas mostraram-se down\2013expressed, respectivamente. Entre as trans-sialidases identificadas, a única cópia encontrada no extrato TcS12 (número de acesso no UniProt - Q4DGV8) apresentou seu RNAm correspondente no banco de dados de cDNA de CL-Brener, com UTR de 214 pb, estando, portanto, na faixa de tamanhos das outras UTR de trans-sialidases obtidas neste estudo. Esse resultado sugere que outros fatores, não necessariamente o tamanho per se das UTR, podem influenciar no fenômeno de tradução nesses tripanossomatídeos. Em relação aos extratos proteicos de epimastigotas gerados a partir das outras cepas, a quantidade de trans-sialidases identificadas foram de 1 (cepa 4167), 2 (cepa Dm28c) e 117 (cepa Y) cópias, indicando assim a tradução satisfatória de pelo menos uma das muitas cópias desta família gênica / Gene regulation in trypanosomatids is polycistronic and occurs in a post - transcriptional way. There are also regulatory elements named UTRs (Untranslated Regions) that are transcribed regions, but not translated. To verify the impact of UTRs presenting different sizes in the transcription machinery and protein translation, genes f rom trans - sialidas e family were selected due to its importance in the cell invasion process. The methodological strategies involved the extraction of total RNA from T. cruzi CL - Brener strain , followed by cDNA synthesis, PCR, cloning and sequencing of amplified products by Sanger and by using the 454 Junior (Next Generation Sequencing – N G S ). Considering that trans - sialidase is a multi - copy gene family, this high - throughput sequencing strategy was employed in an attempt to cover the largest number of trans - sialidase genes. Trans - sialidase cDNAs from CL - Brener epimastigote and tripomastigote were obtained with 5`UTRTCNA primer show ing UT R sizes between 65 - 187 bp. The cDNA from this protein fam ily were also obtained with the 5’TcTS primer from CL - Brener epimastigote s , generating UTRs with 171 - 221 bp . Both 5’UTR presented sequence similarit ies between them. In order to evaluate the correspondence between trans - sialidase gene transcription and t ranslation, it was necessary to accomplish the identification of proteins. Therefore, we developed a methodology for cell disruption, which resulted in a protein extract ( referred as TcS12 ) from epimastigote T. cruzi cells. The strains selected for this st udy were CL - Brener (TcVI), Dm28c (TcI), Y (TcII) and 4167 (TcIV). The process for lysing the cells was optimized to 10 7 parasites/mL resuspended in 200 μL hypotonic lysis buffer (30 minutes at 4 o C) , followed by water bath sonication (30 minut e s a t 4 o C) . The process effic acy was confirmed by FACS , showing that near 72% of the cells were successfully stained with propidium iodide solution (PI). The quality of the protein extracts was analyzed by LCMS/MS using the strategy MS E label free for relative quant ification of proteins. A totality of 1153 proteins were identified and the comparison of the expression profiles between the strains 4167, Dm28c and Y , using the CL - Brener as reference, showed 32, 51 and 73 proteins up - expressed, and 80, 92 and 60 proteins were shown to be down - expressed, respectively. We observed that 117 trans - sialidase s were identified in Y strain, whilst in 4167, Dm28c and CL - Brener were found 1, 2 and 1 trans - sialidases, respectively. Moreover only one copy of trans - sialidase found in the TcS12 extract (UniProt accession number - Q4DGV8), also met its corresponding mRNA in the CL - Brener cDNA database, presenting an UTR of 214 bp, in the size range of the others trans - sialidase UTRs obtained herein. This result suggests th at other facto r s, but not exclusively the UTR sizes per se , could be related to the translation phenomenon in these trypanosomes

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O SL trans-splicing (do inglês, spliced leader trans-splicing) catalisado pelo spliceossomo em Trypanosoma brucei é responsável pelo processamento dos pré-mRNAs policistrônicos em mRNAs maduros. Esta maquinaria é associada a partir de pequenas partículas ribonucleoproteicas nucleares (snRNPs) U1, U2, U4/U6 e U5 constituídas de pequenos RNAs nucleares (snRNAs), um complexo canônico de sete proteínas Sm (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF e SmG) e fatores proteicos específicos. O núcleo de proteínas Sm de T. brucei apresenta variações com funções desconhecidas, como a substituição do heterodímero SmD3/SmB por Sm16,5K/Sm15K na snRNP U2, e de SmD3 por SSm4 na snRNP U4. Na primeira parte deste trabalho, investigou-se a interação destes diferentes complexos Sm recombinantes com os snRNAs U2, U4 e U5 obtidos por transcrição in vitro. Todos os complexos apresentaram alta afinidade pelo snRNA cognato. Observou-se, ainda, que apenas o núcleo Sm que contém Sm16,5K/Sm15K associado ao snRNA U2 interage com alta afinidade com U2A/U2B. Adicionalmente, foi obtida a estrutura cristalográfica de U2A/U2B de T. brucei, que revela uma organização similar àquela já descrita para ortólogas de Homo sapiens. Entretanto, há um desvio de pelo menos 6 Å no ponto médio da alça carregada positivamente no domínio RRM de U2B para a acomodação do snRNA U2. Além disso, observou-se uma longa hélice-α adicional na extremidade C-terminal de U2A. A análise dos três núcleos Sm de T. brucei a partir da combinação de modelagem molecular e espalhamento de raios-X a baixo ângulo revela estruturas de barril-β altamente torcido com interior carregado positivamente para interação com snRNAs. A principal diferença entre as estruturas encontra-se nas extremidades C- e N-terminal dos variantes de proteínas Sm, possivelmente para interação com U2A no braço 1 do spliceossomo, no caso de Sm15K/Sm16,K, e com U5-220K e U5-200K no corpo do spliceossomo, no caso de SSm4. Na segunda parte deste trabalho, a expressão homóloga da proteína U5-200K de T. brucei completa e do produto truncado no seu cassete helicase/ATPase/Sec63 N-terminal levou à copurificação de um subcomplexo de snRNP U5 composto por U5-220K, U5-116K, U5-40K e U5-Cwc21, sendo que a proteína recombinante completa ainda copurificou as proteínas Sm. Experimentos de imunolocalização mostraram que a proteína U5-200K truncada não é direcionada ao núcleo, como é o caso da proteína completa. As células que expressam a proteína truncada apresentaram um defeito de crescimento significativo, e os processamentos de pré-mRNA por cis- e SL trans-splicing foram ligeiramente afetados, já que a proteína truncada não entra no núcleo, onde deveria exercer sua atividade. Os resultados apresentados indicam a formação de um subcomplexo de snRNP U5 ainda no citoplasma, sendo que as proteínas Sm devem ser um sinal para o seu transporte nuclear mediado por importina-β. Em leveduras, a proteína Aar2 substitui U5-200K no citoplasma, regulando assim a biogênese de snRNP U5, porém esta proteína não foi identificada em T. brucei. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem como o primeiro estudo estrutural de proteínas spliceossomais de um parasita do homem e também com novas informações sobre a biogênese das partículas ribonucleoproteicas U2 e U5 de T. brucei. / The spliced-leader (SL) trans-splicing catalyzed by the spliceosome in Trypanosoma brucei is responsible for processing polycistronic pre-mRNAs into mature mRNAs. The spliceosome machinery is assembled by small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4/U6 and U5 that are composed by small nuclear RNAs (snRNAs), a canonical complex of Sm proteins (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF, SmG) and specific factors. The Sm core peculiarly varies in T. brucei, where SmD3/SmB are replaced by Sm16.5K/Sm15K in U2 snRNP and SmD3 is substituted by SSm4 in U4 snRNP. In the first part of this thesis, we investigated the interaction of the different recombinant Sm cores with U2, U4 and U5 snRNAs obtained by in vitro transcription. All the protein complexes bind the cognate snRNA with high affinity. Only the Sm core that contains Sm16.5K/Sm15K associated with U2 snRNA interacts with the recombinant U2A/U2B subcomplex. Additionally, the crystallographic structure of T. brucei U2A/U2B was obtained, showing an overall organization similar to the one observed in the human counterpart. However, we observed a 6 Å deviation in the medium point of a positively charged turn in the RRM motif of U2B to accommodate U2 snRNA. Besides, a long α -helix was observed in the C-terminal region of U2A. Structural analysis of Sm core variations in T. brucei was proceeded using molecular modelling techniques associated with small angle X-ray scattering. The quaternary structure models show seven Sm proteins as β-barrels with positively charged interior for cognate snRNA interaction. The main difference among these Sm core structures resides in the C- and N-terminal regions of the variant proteins, probably enabling the interaction of Sm15K/Sm16,5K with U2A in the spliceosomes arm 1, and the association of SSm4 with U5-220K and U5-200K in the spliceosomes body. In the second part of this thesis, homologous expression of full-length and N-terminally truncated U5-200K from T. brucei led to the copurification of a U5 snRNP subcomplex containing U5-220K, U5-116K, U5-40K and U5-Cwc21. The full-length U5-200K construct also copurified Sm proteins. Immunolocalization experiments showed that the truncated U5-200K protein is not directed to the nucleus as is the case for the full-length protein. Cells that expressed the truncated protein showed a significant growth defect and the pre-mRNA processing by cis- and SL trans-splicing was negatively affected since the truncated protein did not enter the nucleus where it should be active. The results suggest that a subcomplex of U5 snRNP begins to be assembled in the cytoplasm and the Sm proteins may be the signal for the nuclear transport mediated by β-importin. In yeast, Aar2 replaces U5-200K in the cytoplasm in another regulation step. However, Aar2 has not been identified in T. brucei. The results presented here contribute with the first structural study of spliceosomal proteins of a human parasite and give new insights into the biogenesis of U2 and U5 snRNPs in T. brucei.

O SL trans-splicing (do inglês, spliced leader trans-splicing) catalisado pelo spliceossomo em Trypanosoma brucei é responsável pelo processamento dos pré-mRNAs policistrônicos em mRNAs maduros. Esta maquinaria é associada a partir de pequenas partículas ribonucleoproteicas nucleares (snRNPs) U1, U2, U4/U6 e U5 constituídas de pequenos RNAs nucleares (snRNAs), um complexo canônico de sete proteínas Sm (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF e SmG) e fatores proteicos específicos. O núcleo de proteínas Sm de T. brucei apresenta variações com funções desconhecidas, como a substituição do heterodímero SmD3/SmB por Sm16,5K/Sm15K na snRNP U2, e de SmD3 por SSm4 na snRNP U4. Na primeira parte deste trabalho, investigou-se a interação destes diferentes complexos Sm recombinantes com os snRNAs U2, U4 e U5 obtidos por transcrição in vitro. Todos os complexos apresentaram alta afinidade pelo snRNA cognato. Observou-se, ainda, que apenas o núcleo Sm que contém Sm16,5K/Sm15K associado ao snRNA U2 interage com alta afinidade com U2A/U2B. Adicionalmente, foi obtida a estrutura cristalográfica de U2A/U2B de T. brucei, que revela uma organização similar àquela já descrita para ortólogas de Homo sapiens. Entretanto, há um desvio de pelo menos 6 Å no ponto médio da alça carregada positivamente no domínio RRM de U2B para a acomodação do snRNA U2. Além disso, observou-se uma longa hélice-α adicional na extremidade C-terminal de U2A. A análise dos três núcleos Sm de T. brucei a partir da combinação de modelagem molecular e espalhamento de raios-X a baixo ângulo revela estruturas de barril-β altamente torcido com interior carregado positivamente para interação com snRNAs. A principal diferença entre as estruturas encontra-se nas extremidades C- e N-terminal dos variantes de proteínas Sm, possivelmente para interação com U2A no braço 1 do spliceossomo, no caso de Sm15K/Sm16,K, e com U5-220K e U5-200K no corpo do spliceossomo, no caso de SSm4. Na segunda parte deste trabalho, a expressão homóloga da proteína U5-200K de T. brucei completa e do produto truncado no seu cassete helicase/ATPase/Sec63 N-terminal levou à copurificação de um subcomplexo de snRNP U5 composto por U5-220K, U5-116K, U5-40K e U5-Cwc21, sendo que a proteína recombinante completa ainda copurificou as proteínas Sm. Experimentos de imunolocalização mostraram que a proteína U5-200K truncada não é direcionada ao núcleo, como é o caso da proteína completa. As células que expressam a proteína truncada apresentaram um defeito de crescimento significativo, e os processamentos de pré-mRNA por cis- e SL trans-splicing foram ligeiramente afetados, já que a proteína truncada não entra no núcleo, onde deveria exercer sua atividade. Os resultados apresentados indicam a formação de um subcomplexo de snRNP U5 ainda no citoplasma, sendo que as proteínas Sm devem ser um sinal para o seu transporte nuclear mediado por importina-β. Em leveduras, a proteína Aar2 substitui U5-200K no citoplasma, regulando assim a biogênese de snRNP U5, porém esta proteína não foi identificada em T. brucei. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem como o primeiro estudo estrutural de proteínas spliceossomais de um parasita do homem e também com novas informações sobre a biogênese das partículas ribonucleoproteicas U2 e U5 de T. brucei. / The spliced-leader (SL) trans-splicing catalyzed by the spliceosome in Trypanosoma brucei is responsible for processing polycistronic pre-mRNAs into mature mRNAs. The spliceosome machinery is assembled by small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4/U6 and U5 that are composed by small nuclear RNAs (snRNAs), a canonical complex of Sm proteins (SmB, SmD3, SmD1, SmD2, SmE, SmF, SmG) and specific factors. The Sm core peculiarly varies in T. brucei, where SmD3/SmB are replaced by Sm16.5K/Sm15K in U2 snRNP and SmD3 is substituted by SSm4 in U4 snRNP. In the first part of this thesis, we investigated the interaction of the different recombinant Sm cores with U2, U4 and U5 snRNAs obtained by in vitro transcription. All the protein complexes bind the cognate snRNA with high affinity. Only the Sm core that contains Sm16.5K/Sm15K associated with U2 snRNA interacts with the recombinant U2A/U2B subcomplex. Additionally, the crystallographic structure of T. brucei U2A/U2B was obtained, showing an overall organization similar to the one observed in the human counterpart. However, we observed a 6 Å deviation in the medium point of a positively charged turn in the RRM motif of U2B to accommodate U2 snRNA. Besides, a long α -helix was observed in the C-terminal region of U2A. Structural analysis of Sm core variations in T. brucei was proceeded using molecular modelling techniques associated with small angle X-ray scattering. The quaternary structure models show seven Sm proteins as β-barrels with positively charged interior for cognate snRNA interaction. The main difference among these Sm core structures resides in the C- and N-terminal regions of the variant proteins, probably enabling the interaction of Sm15K/Sm16,5K with U2A in the spliceosomes arm 1, and the association of SSm4 with U5-220K and U5-200K in the spliceosomes body. In the second part of this thesis, homologous expression of full-length and N-terminally truncated U5-200K from T. brucei led to the copurification of a U5 snRNP subcomplex containing U5-220K, U5-116K, U5-40K and U5-Cwc21. The full-length U5-200K construct also copurified Sm proteins. Immunolocalization experiments showed that the truncated U5-200K protein is not directed to the nucleus as is the case for the full-length protein. Cells that expressed the truncated protein showed a significant growth defect and the pre-mRNA processing by cis- and SL trans-splicing was negatively affected since the truncated protein did not enter the nucleus where it should be active. The results suggest that a subcomplex of U5 snRNP begins to be assembled in the cytoplasm and the Sm proteins may be the signal for the nuclear transport mediated by β-importin. In yeast, Aar2 replaces U5-200K in the cytoplasm in another regulation step. However, Aar2 has not been identified in T. brucei. The results presented here contribute with the first structural study of spliceosomal proteins of a human parasite and give new insights into the biogenesis of U2 and U5 snRNPs in T. brucei.