Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ariane Bocaletto Frare.pdf: 1200781 bytes, checksum: 8bd7ce42ea14c46d6e84c7f5311b07ca (MD5) Previous issue date: 2011-06-16 / Endometriosis is a benign gynecological pathology dependent on estrogen, which affects 10% of women of reproductive age, it is characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. Its etiology remains unknown, thus an increasing number of researches have been conducted in the search for associations between endometriosis and alterations or polymorphisms in candidate genes, among these genes are the GSTM1 and GSTT1. This study aimed to verify the possible correlation between endometriosis and polymorphisms of presence / absence of GSTM1 and GSTT1, and the association between GSTM1 and GSTT1 polymorphisms and p53 Arg / Pro. We analyzed the frequency of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms in 50 women diagnosed with endometriosis and in control group with 46 women without complaints related to this pathology, the genotypes for these polymorphisms were determined using PCR. We found an increased frequency of absence of GSTM1 (61%) and presence of GSTT1 genes (55%) in the group of women studied, which corroborate with the literature. When we relate the endometriosis with the studied polymorphisms we verified that the endometriosis group had a higher presence of both polymorphisms 50% of GTSM1 and 68% of GSTT1 whereas in the control group there was the opposite, a higher absence of polymorphisms, 74% of GSTM1 and 59% of GSTT1, showing that these polymorphisms has no relation to the proliferation of endometriosis, however the analysis of the pathology with the association of GSTM1, GSTT1 polymorphisms with the p53 codon 72 gene was statistically significant. / A endometriose é uma patologia ginecológica benigna dependente de estrógeno, que afeta 10% das mulheres em idade reprodutiva, é caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina. Sua etiologia permanece desconhecida, com isso um número cada vez maior de pesquisas tem sido realizado na procura de associações entre endometriose e alterações ou polimorfismo em genes candidatos, entre esses genes estão o GSTM1 e o GSTT1. Este estudo teve como objetivo verificar a possível correlação entre a endometriose e os polimorfismos de presença/ausência GSTM1 e GSTT1. Nós analisamos a freqüência dos polimorfismos GSTM1 e GSTT1 em 50 mulheres diagnosticadas com endometriose e no grupo controle, com 46 mulheres sem queixas relacionadas com a patologia, os genótipos para esses polimorfismos foram determinados por PCR. Encontramos maior freqüência de ausência dos genes GSTM1 (61%) e de presença do GSTT1 (55%) no grupo de mulheres estudadas, o que corroboram com a literatura. Quando relacionamos endometriose com os polimorfismos estudados verificamos que o grupo endometriose apresentou maior presença de ambos os polimorfismo 50% GTSM1 e 68% GSTT1, enquanto que no grupo controle verificou-se o contrário, maior ausência dos polimorfismos, 74% do GSTM1 e 59% do GSTT1, mostrando que esses polimorfismos não tem relação com a proliferação da endometriose.

Uma das formas de se quantificar os possíveis efeitos de metais sobre o estado de saúde de organismo é analisar os biomarcadores do estresse oxidativo. Bioensaios foram realizados com a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) com concentrações de cádmio (4,25 \'mü\'g/L), cobre (45,0 \'mü\'g/L ) e zinco (260,0 \'mü\'g/L). Os peixes foram expostos aos metais separados (\'CD\', \'CU\' e \'ZN\'), associados dois a dois (\'CD\'/\'CU\', \'CD\'/\'ZN\' e \'CU\'/\'ZN\') e aos três metais juntos (\'CD\'/\'CU\'/\'ZN\'), por doze dias. Foram retiradas amostras de rim, fígado e brânquias para análise de biomarcadores de estresse oxidativo, a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), o efeito da peroxidação de lipídios (HP), a glutationa S-transferase (GST) e a metalotionéina (MT). Pelos reusltados obtidos constatou-se que, mesmo nas baixas concentrações de exposição aos metais, ocorreram alterações no sitema de defesa antioxidante de O. niloticus. A primeira barreira antioxidante, composta pela SOD, não foi suficiente para barrar os efeitos da exposição aos metais. Em brânquias, onde a ativação desta enzima foi proeminente, formação de HP ocorreu. E, mesmo inicialmente em rim e fígado, tecidos onde ocorreu diminuição da atividade da SOD, ocorreu também a formaçao de HP nas etapas seguintes. A CAT e a GPx também atuaram no sentido de tentar evitar o aparecimento de HP, mas não foram bem sucedidas neste processo. A GST, como enzima da fase II de biotransformação pode ter auxiliado no processo de eliminação dos metais, mas como ocorre de forma tardia em relação à defesa antioxidante, acarretando danos celulares. Em relação às enzimas que compõem o sistema de defesa antioxidante não se verificou também especificidade de tecidos nas respostas. No entanto, a brânquia foi o órgão que teve maior intensidade nas respostas (em termos de ativação das enzimas), nos tratamentos de metais combinados dois a dois, evidenciando que este órgão, por estar em contato com a água e ser sede de processos fisiológicos de homeostase, desempenhou papel importante na tentativa de neutralizar os efeitos dos metais. / One way of quantifying metals effects upon organisms\' health state is to analyse oxidative stress biomarkers. Bioassays were conducted with Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with cadmium (4,25 \'mü\'g/L), copper (45,0 \'mü\'g/L ) and zinc (260,0 \'mü\'g/L). Fishes were exposed to metals separatelly (\'CD\', \'CU\' e \'ZN\'), associated two by two (\'CD\'/\'CU\', \'CD\'/\'ZN\' e \'CU\'/\'ZN\') and to three metals together (\'CD\'/\'CU\'/\'ZN\'), for twelve days. Gills, liver and kidney samples were taken to analyse oxidative stress biomarkers, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx), the effect of lipid peroxidation (HP), an enzyme of phase II biotransformation, glutathione S-transferase (GST) and metallothionein (MT). From results obtained, it was stablished that, even in low concentrations of metals, O. niloticus antioxidant defense system was modified. The first antioxidant barrier, SOD, wasn\'t able to minimize metal exposition effects. In gills, where activaton of this enzyme was prominent, didn\'t avoi HP formation. And even in liver and kidney, tissues where SOD activity decreased, HP formation also occurred. CAT and GPx also acted trying to avoid HP formation, but weren\'t successfull. GST, like a phase I enzyme, could help eliminating metals, but in a late moment in relation to antioxidant defense, leading to cell damage. For antioxidant enzymes no relation to tissue-specificity response was observed. But gills were the organ which had more intense responses (in terms of enzyme activation), mainly in metals combined two by two, evidencing that gills are important like a first organ in antioxidant defense because it is in direct contact with water and determine the main processes in homeostasis, trying to neutralize metals effects.

INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A a-Glutathiona-S-transferase (aGST) vem sendo proposta como um marcador sensível e não-invasivo de lesão hepática em pacientes com Hepatite pelo vírus C. Avaliamos neste trabalho como a (aGST) se correlaciona com características bioquímicas e histológicas em pacientes com HCV. MATERIAL E MÉTODOS: Realizamos a determinação da concentração plasmática das aGST, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e gama-glutamyltransferase (gGT) em 114 pacientes com HCV, dos quais 97 foram submetidos à biópsia hepática em até 6 meses da realização dos testes bioquímicos. Avaliamos também os níveis de aGST em 66 doadores de sangue sadios, que serviram como controles. Comparamos os níveis de aGST com as demais provas bioquímicas e a histologia hepática. RESULTADOS: A aGST estava elevada em 85.96% dos pacientes com HCV e mostrou associação com a elevação das aminotransferases (p<0.01). O valor de 4mg/dL mostrou as melhores sensibilidade (85,96%) e especificidade (92,42%) para determinar a normalidade do teste aGST. aGST ³ 8mg/dL mostrou a melhor especificidade para determinar lesão histológica hepática mais agressiva e o melhor valor preditivo positivo e razão de verossimilhança positiva para inflamação portal e atividade parenquimatosa mais agressiva nos pacientes com HCV. CONCLUSÕES: A aGST está relacionada à lesão hepática na infecção pelo HCV (valor de corte = 4mg/dL) e lesões histológicas hepáticas mais agressivas (valor de corte = 8mg/dL). Neste contexto, a aGST poderia ser utilizada em pacientes com Hepatite pelo HCV com ALT elevada, como um indicador complementar de lesão histopatológica mais agressiva. Entretanto, seu valor preditivo positivo não é suficientemente elevado para evitar a necessidade de realizar a biópsia hepática, mesmo quando está acima de 8mg/dL. / BACKGROUND/AIMS: a-Glutathione-S-transferase (aGST) has been proposed as a sensitive non-invasive indicator of hepatocellular injury due to Hepatitis C virus (HCV) infection. In this work, we evaluate how alpha-GST concentration correlates with biochemical and histological features in HCV patients. METHODS: We assayed plasma aGST, alanine aminotransferase (ALT), spartate aminotransferase (AST) and gama-glutamyl-transferase (gGT) in 114 HCV+ patients, among whom liver biopsy was performed in 97, within 6 months of the biochemical evaluation. We also assessed aGST levels in 66 health blood donors, aimed to serve as control. We compared aGST levels with other biochemical tests and liver histology. RESULTS: In 85.96% of HCV patients aGST was elevated and showed association with serum aminotransferases (p<0.01). The value of 4mg/dL (or lower) showed the best sensitivity (85.96%) and specificity (92.42%) to determine normality on the aGST test. aGST levels 8mg/dL and higher showed the best specificity to determine the presence of more aggressive liver histological damage among HCV patients and the best predictive positive value and positive likelihood for more aggressive portal inflammation and lobular activity. CONCLUSION: aGST is related to HCV infection (cut-off = 4mg/dL) and more aggressive liver histological damage (cut-off = 8mg/dL). In this sense, aGST could be used in HCV patients with altered ALT levels as an indicator of more aggressive hystopathological damage. However, its positive predictive value (PPV) is not high enough to preclude the decision of performing hepatic biopsy, even when it is above 8mg/dL.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Uma das formas de se quantificar os possíveis efeitos de metais sobre o estado de saúde de organismo é analisar os biomarcadores do estresse oxidativo. Bioensaios foram realizados com a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) com concentrações de cádmio (4,25 \'mü\'g/L), cobre (45,0 \'mü\'g/L ) e zinco (260,0 \'mü\'g/L). Os peixes foram expostos aos metais separados (\'CD\', \'CU\' e \'ZN\'), associados dois a dois (\'CD\'/\'CU\', \'CD\'/\'ZN\' e \'CU\'/\'ZN\') e aos três metais juntos (\'CD\'/\'CU\'/\'ZN\'), por doze dias. Foram retiradas amostras de rim, fígado e brânquias para análise de biomarcadores de estresse oxidativo, a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), o efeito da peroxidação de lipídios (HP), a glutationa S-transferase (GST) e a metalotionéina (MT). Pelos reusltados obtidos constatou-se que, mesmo nas baixas concentrações de exposição aos metais, ocorreram alterações no sitema de defesa antioxidante de O. niloticus. A primeira barreira antioxidante, composta pela SOD, não foi suficiente para barrar os efeitos da exposição aos metais. Em brânquias, onde a ativação desta enzima foi proeminente, formação de HP ocorreu. E, mesmo inicialmente em rim e fígado, tecidos onde ocorreu diminuição da atividade da SOD, ocorreu também a formaçao de HP nas etapas seguintes. A CAT e a GPx também atuaram no sentido de tentar evitar o aparecimento de HP, mas não foram bem sucedidas neste processo. A GST, como enzima da fase II de biotransformação pode ter auxiliado no processo de eliminação dos metais, mas como ocorre de forma tardia em relação à defesa antioxidante, acarretando danos celulares. Em relação às enzimas que compõem o sistema de defesa antioxidante não se verificou também especificidade de tecidos nas respostas. No entanto, a brânquia foi o órgão que teve maior intensidade nas respostas (em termos de ativação das enzimas), nos tratamentos de metais combinados dois a dois, evidenciando que este órgão, por estar em contato com a água e ser sede de processos fisiológicos de homeostase, desempenhou papel importante na tentativa de neutralizar os efeitos dos metais. / One way of quantifying metals effects upon organisms\' health state is to analyse oxidative stress biomarkers. Bioassays were conducted with Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with cadmium (4,25 \'mü\'g/L), copper (45,0 \'mü\'g/L ) and zinc (260,0 \'mü\'g/L). Fishes were exposed to metals separatelly (\'CD\', \'CU\' e \'ZN\'), associated two by two (\'CD\'/\'CU\', \'CD\'/\'ZN\' e \'CU\'/\'ZN\') and to three metals together (\'CD\'/\'CU\'/\'ZN\'), for twelve days. Gills, liver and kidney samples were taken to analyse oxidative stress biomarkers, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx), the effect of lipid peroxidation (HP), an enzyme of phase II biotransformation, glutathione S-transferase (GST) and metallothionein (MT). From results obtained, it was stablished that, even in low concentrations of metals, O. niloticus antioxidant defense system was modified. The first antioxidant barrier, SOD, wasn\'t able to minimize metal exposition effects. In gills, where activaton of this enzyme was prominent, didn\'t avoi HP formation. And even in liver and kidney, tissues where SOD activity decreased, HP formation also occurred. CAT and GPx also acted trying to avoid HP formation, but weren\'t successfull. GST, like a phase I enzyme, could help eliminating metals, but in a late moment in relation to antioxidant defense, leading to cell damage. For antioxidant enzymes no relation to tissue-specificity response was observed. But gills were the organ which had more intense responses (in terms of enzyme activation), mainly in metals combined two by two, evidencing that gills are important like a first organ in antioxidant defense because it is in direct contact with water and determine the main processes in homeostasis, trying to neutralize metals effects.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3640.pdf: 5869617 bytes, checksum: 4643e7ab6ff128afd74bd3d51d8588f3 (MD5) Previous issue date: 2011-03-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / This study, based on molecular docking, describes the search for the most favorable conformations when complexes between herbicides, used in soybean cultivation, and an enzyme involved in the detoxification process are formed and based on these results some guidelines for the developing of new compounds are proposed. The glutathione transferase Tau, GmGSTU4-4, from soybean was the target protein, and diclofop, fluazifop, Clethodim, clomazone, diquat, paraquat, atrazine, diuron, bentazone, acifluorofem, fomesafem, sulfentrazone, glyphosate and clorimurom, the 14 herbicides studied. These last ones were chosen based on the list of those that are used in soybean crops and are registered with the Ministry of Agriculture and Supply of Brasil. For all of them the GmGSTU4-4-herbicide complexes were obtained. The protein binding site, analyzed by molecular visualization, presents an almost cylindrical shape, open and exposed to the solvent and is composed of two sites G and H. Three water molecules were observed in the G-site in that participate in molecular interactions with several of the studied herbicides, This finding suggests that new compounds that could, and should, be developed need to have in their structure chemical groups capable of interacting with the water, both as donors and acceptors of hydrogen bonds. Another interesting finding was that the largest herbicides may occupy both the G and H sites, and seem to be most promising in the activity of detoxification. / Este estudo, baseado em docking molecular, descreve a busca das conformações mais favoráveis para a formação dos complexos alvo-ligante com herbicidas utilizados no cultivo de soja e uma enzima envolvida no processo de desintoxicação, e baseado nestes resultados são propostas algumas diretrizes para o desenvolvimento de novos compostos. A proteína estudada foi a glutationa transferase Tau de soja, a GmGSTU4-4. Foram estudados 14 herbicidas: diclofope, fluazifope, cletodim, clomazona, diquate, paraquate, atrazina, diurom, bentazona, acifluorofem, fomesafem, sulfentrazona, clorimurom e glifosato. A escolha dos herbicidas se baseou na lista daqueles que são utilizados na cultura da soja e estão registrados no Ministério da Agricultura e Abastecimento do Brasil. Foram obtidos os complexos GmGSTU4-4-herbicidas. O sítio de ligação analisado por visualização molecular mostra uma forma quase cilíndrica, aberta e exposta ao solvente e composto de dois sítios G e H. No sítio G foram observadas três moléculas de água que participam de interações moleculares com vários dos herbicidas estudados o que sugere que novos compostos poderiam ser desenvolvidos observando a necessidade da presença de grupos químicos capazes de interagir com a água, tanto como doadores como aceptores de ligações de hidrogênio. Os herbicidas maiores podem ocupar os sítio G e H e parecem ser mais promissores na atividade de desintoxicação.

Orientador: Anete Pereira de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:23:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_JoseSergiodeMacedo_M.pdf: 3092877 bytes, checksum: 85276ce21b221869d2fb74dc6cef8444 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O fitopatogeno Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema que causa uma variedade de doenças economicamente importantes em plantas, incluindo uma doença chamada Clorose Variegada de Citrus (CVC). Recentemente, os dados de sequenciamento do DNA fornecidos pelo projeto genoma da Xylella fastidiosa permitiram uma aproximação da área genoma funcional para investigar a função de diversas proteínas baseadas na informação sobre suas estruturas. Avanços recentes na área genoma estrutural não somente nos ajudou a compreender funções da proteína, mas também causou um grande impacto na indústria farmacêutica. Nos últimos anos, o uso da informação estrutural de proteínas na pesquisa de descoberta de novas drogas tem amadurecido, e é usado agora em todos os níveis, variando da identificação e da seleção de alvos do genoma a candidatos apropriados. Esta emergente área é poderoso meio para compreender mais profundamente os mecanismos a patogenicidade da bactéria. Este trabalho visa adicionar novas informações sobre proteínas que podem ser relacionadas a patogenicidade de Xylella fastidiosa, necessárias para o desenvolvimento de novos métodos de combate à CVC. A fim de recolher informações sobre as proteínas envolvidas nos mecanismos do patogenicidade da bactéria, nós escolhemos as orf xf2148 e orf xf1524 de Xylella fastidiosa para estudos de caracterização. A orf xf2148, apresenta 47% de similaridade com o gene ksgA de Escherichia coli. O gene ksgA codifica uma Dimetiladenosina transferase da classe de proteínas metiltransferases. Já a orf xf1524, apresenta 55% de similaridade com o gene xpsL de Xanthomonas campestris, que codifica uma proteína transmembrana da via de secreção do tipo II. Ambas as proteínas foram clonadas no vetor pET32Xa/LIC e expressas na bactéria Escherichia coli linhagem BL21(DE3). A proteína XPSL foi purificada através de uma cromatografia de afinidade (IMAC) e teve sua identidade determinada por SDS-PAGE e Espectrometria de Massas (MALDITOF). Para investigar a integridade estrutural da proteína XPSL purificada, a técnica espectroscópica de Dicroísmo Circular (CD) foi realizada. O espectro de CD da proteína XPSL mostrou sinais predominantemente de 'alfa'hélices indicando um perfil de estrutura secundária devidamente enovelada viável para estudos estruturais e funcionais. A proteína XF2148, expressa em sua forma insolúvel, foi resolubilizada usando 8M de uréia como agente desnaturante. A proteína foi purificada através de uma cromatografia de troca iônica e sua pureza e identidade verificadas por SDS-PAGE e Espectrometria de Massas (MALDI-TOF). Seu correto enovelamento por espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD) indicou uma composição predominantemente de 'alfa'hélices. O alinhamento da seqüência primária e modelagem por homologia da proteína XF2148 com uma proteína de estrutura tridimensional resolvida, KsgA de E. coli, revelaram um local da molécula que envolve resíduos altamente conservados no domínio C-terminal e cinco dos oito motivos estruturais encontrados geralmente em Metiltransferases / Abstract: The phytopathogen Xylella fastidiosa is a xylem-limited bacterium that causes a range of economically important plant diseases, including a serious disease of orange trees called citrus variegated chlorosis (CVC). Recently, DNA sequence data provided by the Xylella fastidiosa Brazilian genome project have allowed a functional genomic approach to investigate the function of several proteins based on the information about their structures. Recent advances in structural genomics not only help us to understand protein functions but also have a big impact on the pharmaceutical industry. In the last few years, the use of protein structural information in drug discovery research has matured, and it is now used at all levels, ranging from genomics target identification and selection to the final design of suitable drug candidates. This emergent area is a powerful means to more deeply understand the mechanisms of the bacterium pathogenicity. This work aims at adding new information on proteins that may be related to the X. fastidiosa pathogenesis, necessary for new approaches towards the combat of CVC. In order to gather information about the proteins involved in the mechanisms of the bacterium pathogenicity, we chose orf xf2148 and orf xf1524 from Xylella fastidiosa for characterization studies. Orf xf2148, presents 47% of similarity with the gene ksgA of Escherichia coli. The ksgA gene encodes a dimethyladenosine transferase from the methyl transferase proteins class. On the other hand orf xf1524, presents 55% of similarity with the xpsL gene of Xanthomonas campestris, which encodes a transmembrane protein of the type II secretion machinary. Both proteins were cloned into the pET32Xa/LIC vector to overexpress the protein in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed XpsL protein was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and had its identity determined by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MALDI-TOF). To investigate the structural integrity of the purified XPSL, the protein was analyzed by Circular Dichroism (CD) spectroscopy. The XpsL CD spectrum showed that it contains predominantly signal of 'alfa'helices suggesting that the XpsL recombinant protein maintains secondary structures, is viable to functional and structural studies and remained folded. The XF2148 protein was expressed in the insoluble form and refolded using 8M Urea as denaturating agent. The protein was purified in one step by cation-exchange chromatography and its purity and identity were verified by SDS-PAGE and Mass Spectrometry (MALDI-TOF). Its correct folding was verified by Circular Dichroism Spectroscopy analysis that indicated a secondary structure composed mainly of 'alfa'helices. The alignment of the XF2148 primary sequence and homology modeling with one ksgA structure solved protein from E. coli, revealed a site involving highly conserved residues in the C-terminal domain and five of the eight structural motifs usually found in AdoMetdependent methyltransferases / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Menossi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:11:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cancado_GeraldoMageladeAlmeida_D.pdf: 5945955 bytes, checksum: bf1d61ab84a403512834994e49e96bf1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Solos ácidos são encontrados em todas as regiões do planeta e em grandes proporções nas regiões tropicais e subtropicais. Como conseqüência da acidez do solo, o alumínio (Al), metal mais abundante da crosta terrestre, torna-se solúvel e atinge concentrações tóxicas para a maioria das espécies de plantas cultivadas. O primeiro dano provocado pelo Al iônico é a redução do desenvolvimento radicular, causando distúrbios fisiológicos que acarretam na redução da produção. Devido às limitações dos métodos convencionais de correção do pH do solo e a necessidade de longos períodos de tempo para o desenvolvimento de novas cultivares pelo melhoramento genético clássico, muita ênfase tem sido dada para a compreensão dos mecanismos de toxidez e de tolerância ao Al em plantas. Pois, com a aquisição destes conhecimentos, espera-se mais sucesso na obtenção de plantas tolerantes ao Al com o emprego da tecnologia de DNA recombinante e da seleção assistida por marcadores moleculares. Neste trabalho utilizamos duas linhagens de milho contrastantes para tolerância ao Al: Cat100-6 (tolerante ao Al) e S1587-17 (sensível ao Al), com o objetivo de estudar as alterações na expressão gênica promovidas pelo estresse de Al no ápice radicular. A presente tese esta dividida em três linhas de pesquisa: i) identificação, clonagem e caracterização de um gene codificando uma enzima glutationa S-transferase e avaliação dos efeitos do Al na sua expressão gênica; ii) avaliação das alterações na expressão gênica em ápices de raízes de duas linhagens de milho quando submetidos ao estresse de Al, utilizando um sistema de hibridização heterólogo com ESTs (expressed sequence tags) de cana-de-açúcar; e iii) clonagem e caracterização em milho do gene ALMT1, pertencente a uma nova classe de proteína transportadora de moléculas orgânicas especificamente ativada pelo Al. No trabalho com o gene GST27.2 observamos que este gene foi induzido pelo estresse provocado por Al e por Cd (cadmio) e que mutações que provocavam alterações na composição de aminoácidos da proteína poderiam promover alterações vi na atividade e na especificidade desta enzima. Além disso, o gene GST27.2 parece ser um novo alelo do gene GST27 estando presente como cópia única no genoma das linhagens de milho estudadas. Já no trabalho de avaliação da expressão gênica em larga escala, foram identificados 85 genes nos ápices radiculares das duas linhagens de milho cuja expressão foi diferencialmente alterada pela presença do Al. Embora alguns dos genes já tivessem sido descritos como responsivos ao Al, para a maior parte dos genes identificados neste trabalho, este foi o primeiro relato descrevendo seu envolvimento com o estresse de Al. A clonagem em milho do gene homológo ao gene ALMT1, demonstrou que o milho também deve ter uma proteína de membrana presente em células do ápice radicular que pode estar envolvida com transporte de moléculas orgânicas. Embora a proteína não esteja envolvida com o transporte de malato, a mesma teve sua atividade melhorada pela presença do Al. Entretanto, o gene que codifica esta proteína é reprimido no tecido do ápice radicular das linhagens de milho tolerante e sensível ao Al, o que pode indicar a existência de regulação pós-transcricional. Os resultados obtidos a partir destas três abordagens contribuíram para a compreensão dos mecanismos de tolerância e toxidez ao Al em raízes de milho. Futuramente, essas informações auxiliarão na escolha de genes mais apropriados para a criação de plantas geneticamente alteradas mais adaptadas a presença do Al no solo / Abstract: Acid soils are found worldwide but most of them are located in tropical and subtropical regions. Aluminum (Al), the most abundant metal on the earth surface, becomes soluble in the soil solution as consequence of low pH in acid soils and achieves phytotoxic levels for most of the cultivated plant species. The first symptom of Al toxicity is the inhibition of the root growth that promote physiological disturbs reducing crop yield. Because of limitations of correcting soil pH by liming and the time-consuming process of traditional plant breeding, the elucidation of the mechanisms involved with plant Al-tolerance and Al-toxicity has received more attention, since the production of genetically altered plants has emerged as an effective and fast strategy to the production of improved cultivars. Two maize lines, Cat100-6 (Al-tolerant) and S1587-17 (Al-sensitive), were used in this study with the aim of understanding at the transcriptional level the alterations promoted by Al on the roots. The research was divided in three main sections: i) detection, cloning and characterization of a gene encoding a Glutathione S-transferase in maize and evaluation of Al effects on its expression; ii) Large-scale evaluation of gene expression in root tips of maize under Al stress using a heterologous system with Expressed Sequence Tags (ESTs) of sugarcane; and iii) cloning and characterization of the ALMT1 gene in maize and evaluation of Al-effects on its activity. In the first section was observed that Al and Cd-stress induced the GST27.2 gene. Two mutations present on the nucleotide chain of this gene promoted alteration on the amino acid compositions. These alterations might be responsible by alterations on the specificity and activity of the GST enzyme. Besides that, the GST27.2 is a single copy gene in maize and seem to be a new allele of GST27. In the section of large-scale gene expression evaluation were identified 85 genes in root tips of two Al-tolerant contrasting maize lines whose expression was altered by Al stress. Although several of the genes identified here were previously described as Al responsive in other works, to most of them this study is the first report about the involvement of these genes with Al stress. The cloning of the ALMT1 homologue in tissue from the root apex of maize shown that maize has a gene encoding a membrane protein that might be involved with organic molecules transport. Although the protein encoded by the maize homologue gene was not associated with malate transport the activity of this protein was stimulated by the presence of Al. Interestingly, the gene expression of the this gene was repressed by Al in the Al-tolerant and Al-sensitive genotype. This result might be an indicative of existence of posttranscriptional regulation. The results accomplished with the experiments described here launched new light into the understanding of the Al-tolerance and Al-toxicity mechanisms in maize roots. Furthermore, the information presented here will contribute to a more accurate selection of genes that will be used to produce transgenic plants better adapted to soils with high Al concentration / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brena de Lourdes Aguiar Lima.pdf: 1248497 bytes, checksum: d14922a8c86943653012f0ea3e3818cf (MD5) Previous issue date: 2013-04-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Plasmodium vivax threatens ~40% of the world s population, with a wide spectrum of asymptomatic to severe clinical manifestations. Glutathione S-transferase (GST) gene polymorphisms have been shown to influence their ability to reduce oxidative stress. Using molecular tools we identified and compared GSTM1, GSTT1 and GSTP1 gene polymorphism in 175 uncomplicated (n=118) and severe (n=57) vivax patients. There were no differences in the frequency of GST alleles between uncomplicated and severe malaria. Nevertheless, a comparison of biochemical and hematological parameters in severe malaria, we observed patients with GSTM1 double-deletion had more platelets (p<0.04) suggesting a decreased risk of thrombocytopenia. In addition, patients with single and/or double deletion of GSTT1 and GSTM1 also had a reduced risk for thrombocytopenia (p<0.045, p<0.026, respectively) compared to wild type allele. In contrast, individuals with GSTP1 heterozygous or homozygous A313G mutation had an increased risk of jaundice (p<0.034, p<0.022) and anemia as observed with decreased RBCs (p<0.008), hemoglobin (p<0.019) and hematocrit (p<0.008) levels in serum. Our results, not only indicate a direct influence of GST polymorphism on biochemical parameters but also its diagnostic potential in assessing disease progression during clinical malaria. / Plasmodium vivax acomete aproximadamente 40% da população mundial, com um amplo espectro de manifestações clínicas, desde formas assintomáticas a infecções graves. Polimorfismos nos genes da Glutationa S-transferase (GST) influenciam a capacidade das isoenzimas de reduzir o estresse oxidativo. Usando métodos moleculares nós identificamos e comparamos polimorfismos nos genes da GST em 175 pacientes com malária vivax não-grave (n=118) e grave (n=57). Não houve diferenças estatísticas nas freqüências alélicas das GSTs entre os pacientes com malária não grave e grave. No entanto, guando comparou-se os parâmetros bioquímicos e hematológicos no grupo com malária grave, observamos que pacientes com deleção no gene GSTM1 apresentaram maior contagem plaquetária (p˂0.04), sugerindo menor risco de trombocitopenia. Além disso, pacientes com deleção única e/ou dupla nos genes GSTT1 e GSTM1 demonstraram menor risco de desenvolverem trombocitopenia (p˂0.045, p˂0.026, respectivamente) em comparação com os pacientes portadores do genótipo selvagem. Em contraste, indivíduos com malária grave e portadores dos genótipos heterozigotos ou homozigotos para a mutação A313G no gene GSTP1 apresentaram maior risco de desenvolverem icterícia (p˂0.034, p˂0.022, respectivamente) e anemia, como demonstrado pelos menores níveis de hemácias (p˂0.008, p˂0.019, respectivamente) e hematócrito (p˂0.008). Nossos resultados não indicam apenas uma influência direta dos polimorfismos das GSTs nos parâmetros bioquímicos e hematológicos, mas também o seu potencial de avaliar a progressão da doença.

Einleitung: Vitamin B12 hat wichtige Funktionen im Energiestoffwechsel sowie bei der Erythropoese. Beide Funktionskreise werden bei Hochleistungskühen besonders beansprucht und können bei Belastungen und ungenügender Vitamin-B12-Versorgung Ausgangspunkt für klinische Störungen werden. Ziele der Untersuchungen: In den vorliegenden Studien wurde der Fragestellung nachgegangen, wie sich die Vitamin-B12-Konzentration im Blutserum von Milchkühen in der Frühlaktation verhält und welche Zusammenhänge zu Stoffwechselparametern, dem Erythrogramm sowie dem Gesundheitsstatus der Kühe bestehen. Des Weiteren wurde geprüft, inwieweit der postpartale Stoffwechsel und der Gesundheitsstatus durch orale Vitamin-B12-Substitutionen stabilisiert werden können. Material und Methoden: Die Untersuchungen zur Vitamin-B12-Statuserhebung erfolgten an 157 Kühen der Rasse Holstein Friesian. Blutproben zur Stoffwechselanalytik wurden 2-6 Tage p.p. sowie 4-5 Wochen p.p. entnommen. Parallel dazu wurden klinische Daten zu Leistung und Gesundheitsstatus bis 3 Monate p.p. erhoben. In einem zweiten Versuch wurden die Kühe in 2 Gruppen eingeteilt, wobei die Versuchsgruppe (65 Kühe) eine orale Vitamin-B12-Substitution in Höhe von 0,5 g Cyanocobalamin/Kuh/Tag 4-6 Wochen a.p. beginnend bis zur Kalbung erhielt. 71 Kühe, die das stallübliche Mineralfutter erhielten, dienten als Kontrollgruppe. Auch hier erfolgten die Blutkontrollen 2-6 Tage p.p. sowie 4-5 Wochen p.p. Es wurden die Milchleistung sowie auftretende Erkrankungen dokumentiert. Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena caudalis mediana. Neben den hämatologischen Untersuchungen wurden folgende Parameter aus dem Serum bestimmt: Freie Fettsäuren (FFS), Betahydroxybutyrat (BHB), Glukose, Bilirubin, Cholesterol, Gamma-Glutamyltransferase (GGT), Creatinkinase (CK), Harnstoff, Calcium, Eisen, anorganisches Phosphat (Pi), Cyanocobalamin und Cobalt. Ergebnisse: Die Vitamin-B12-Konzentration zeigt eine signifikante Laktationsdynamik. Alle untersuchten Kühe hatten 4 Wochen p. p. gegenüber 2–6 Tage p. p. erniedrigte Vitamin-B12-Konzentrationen (p ≤ 0,05). Bei den p.p. kranken Kühen sank gegenüber den gesunden Kühen die Vitamin-B12-Konzentration weniger stark ab (p ≤ 0,05), d.h., höhere Vitamin-B12-Konzentrationen können auf klinische Probleme hinweisen. Gesunde sowie auch p.p. kranke Kühe wiesen 2–6 Tage p. p. höhere Werte für die Parameter Erythrozytenzahl, Hämatokrit und Hämoglobinkonzentration auf als 4 Wochen p. p. Die BHB-, FFS- und Bilirubin-Konzentrationen waren bei allen Kühen 2–6 Tage p. p. infolge der partusbedingten Lipolysesteigerung erhöht (p ≤ 0,05). Bei allen Kühen korrelierte die Aktivität der cholestaseanzeigenden GGT eng mit der Vitamin-B12-Konzentration (p ≤ 0,01). Aufgrund dieser engen Korrelation mit der GGT-Aktivität sowie der Bilirubinkonzentration kann Vitamin B12 bei einer Serumkonzentration ≥ 227 ng/l bei Kühen cholestatische Stoffwechselbelastungen anzeigen. Nach Vitamin-B12-Substitution blieben in der Versuchsgruppe 60 % und in der Kontrollgruppe 47,9 % der Kühe in der Frühlaktation gesund. In der Kontrollgruppe hatten 12,7 % eine Nachgeburtsverhaltung und 40,8 % eine Mastitis, in der Versuchsgruppe betrugen die Anteile 21,5 % sowie 26,2 %. Mit x̃ = 320 pg/ml war die Vitamin-B12-Konzentration 2-6 Tage p.p. in der Vitamin-B12-substituierten Gruppe gegenüber x̃ = 224 pg/ml in der Kontrollgruppe gesichert höher. Auch vier Wochen p.p. war die Differenz noch signifikant. Cobalt, die Parameter des Leber- und Energiestoffwechsels sowie Harnstoff und CK unterschieden sich zwischen der Vitamin-B12-substituierten Gruppe und der Kontrollgruppe nicht gesichert. Die Erythrozytenzahlen sowie die Hämoglobin-Konzentrationen waren in der Vitamin-B12-substituierten Gruppe gesichert höher. Der Milchfettgehalt (%) war bei den Vitamin-B12-substituierten Kühen gegenüber den Kontrollkühen signifikant erhöht (p = 0,022), die Milchleistung unterschied sich unwesentlich. Schlussfolgerungen: Signifikant höhere Vitamin-B12- und Hämoglobin-Konzentrationen, höhere Erythrozytenzahlen sowie geringere Morbidität sprechen für positive Effekte der Vitamin-B12-Substitution. Anhand der Parameter des Leber-Energiestoffwechsels sowie der Milchleistung ließ sich dies nicht bestätigen. Cholestase stört die Vitamin-B12-Bewertung im Blut bzw. ist bei der Interpretation zu beachten. / Introduction: Vitamin B12 has important functions in energy metabolism and erythropoiesis. Both functional groups are particularly stressed in high-yielding dairy cows and can be a starting point for clinical disorders under stress and insufficient vitamin B12 supply. Objective: The studies presented were designed to ascertain the characteristics of the serum vitamin B12 concentration of dairy cows in early lactation and to check the relations with metabolic parameters, the erythrogram as well as the health status of the cows. Furthermore, it was examined to what extent the postpartum metabolism can be stabilized by oral vitamin B12 substitutions. Material and methods: The investigations on vitamin B12 status survey were carried out on 157 cows of the Holstein Friesian breed. Blood samples were taken for metabolic analysis at 2-6 days p.p. and at 4-5 weeks p.p. In parallel, clinical findings on the milk yield and the health status were compiled up to 3 months p.p. In a second trial the cows were divided into 2 groups in which the experimental group (65 cows) received an oral vitamin B12 substitution in the amount of 0.5 g cyanocobalamin/cow/day starting 4-6 weeks a.p. up to calving. 71 cows, which recieved the common mineral feed, served as control group. Again the blood tests were performed at 2-6 days p.p. and at 4-5 weeks p.p. The milk yield and emerging diseases were documented. The blood samples werde taken from the Vena caudalis mediana. In addition to haematological investigations the following parameteres were measured: Non-esterified fatty acids (NEFA), beta-hydroxybutyrate (BHB), glucose, bilirubin, cholesterol, gamma-glutamyl transferase (GGT), creatinkinase (CK), urea, calcium, ferric, anorganic phosphor, cyanocobalamin and cobalt. Results: The vitamin B12 concentration shows a significant dynamic in lactation. All examined cows had decreased vitamin B12 concentrations at 4 weeks p. p. compared to 2-6 days p. p. (p ≤ 0.05). In the p.p. morbid cows the vitamin B12 concentration fell less than in the healthy cows (p ≤ 0.05), which means higher vitamin B12 concentrations may indicate clinical problems. Healthy as well as p.p. morbid cows showed higher values for the parameters erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin concentration at 2-6 days p.p. than 4 weeks p.p. BHB, FFS, and bilirubin levels were increased in all cows at 2-6 days p.p. as a result of partus related rise in lipolysis (p ≤ 0.05). In all cows, the activity of the GGT, which indicates cholestasis, was closely correlated with the vitamin B12 concentration p ≤ 0.01). Because of this close correlation with GGT activity and bilirubin concentration, vitamin B12 may show cholestatic metabolic stress in cows at a serum concentration ≥ 227 ng/l. After vitamin B12 substitution 60 % of the cows in the experimental group and 47.9 % of the cows in the control group remained healthy during early lactation. In the control group 12.7 % had a Retentio secundinarum and 40.8 % had a mastitis, in the experimental group the proportions were 21.5 % and 26.2 %. At two to six days p.p. the vitamin B12 concentration in the vitamin B12 substituted group was significant higher (x̃ = 320 pg/ml) than in the control group (x̃ = 224 pg/ml). This difference was still significant at four weeks p.p. Cobalt, parameters of liver and energy metabolism as well as urea and CK did not differ significantly between the vitamin B12 substituted group and the control group. Erythrocyte counts and hemoglobin concentrations were significant higher in the vitamin B12 substituted group. Milk fat content (%) was significant higher in the vitamin B12 substituted group compared to the control group (p = 0.022), the milk yield did not differ significantly. Conclusions: Significant higher vitamin B12 and hemoglobin concentrations, higher erythrocyte counts as well as lower morbidity speak for positive effects of vitamin B12 substitution. Based on the parameters of hepatic and energy metabolism as well as milk yield this could not be confirmed. Cholestasis interferes with the evaluation of vitamin B12 in the blood respectively should be considered in the interpretation.