Thrombozyten enthalten und sezernieren eine Vielzahl von Wachstumfaktoren, deren Mitwirkung an der Knochenbildung und –regeneration als gesichert gilt. Platelet-rich plasma (PRP) enthält eine hohe Thrombozytenkonzentration und somit auch dementsprechend hohe Spiegel von Wachstumsfaktoren. Ziel dieser Arbeit war eine Evaluation des Einflusses von PRP auf die Qualität und Quantität der interkorporellen knöchernen Fusion im Rahmen der ventralen Spondylodese von Wirbelkörperverletzungen mit Cage-Implantaten und autologer Spongiosa. In einer prospektiven Studie wurden 15 Patienten mit traumatischer Fraktur der BWS oder LWS ventral mit einem Cage-Implantat und autologer Spongiosa stabilisiert. Indikationsabhängig wurden additiv dorsale Fixateur interne und/oder ventrale Plattensysteme implantiert. Intraoperativ erfolgte die Kombination der autologen Spongiosa mit PRP. Dieses wurde direkt perioperativ aus max. 110 ml venösem Eigenblut des Patienten mit dem kommerziell erhältlichen GPS™-System (Biomet Deutschland GmbH, Berlin) hergestellt. Als Kontrollgruppe fungiert ein zufällig ausgewähltes Kollektiv von 20 Patienten mit traumtischer BWS- oder LWS-Fraktur. Diese wurden ebenfalls ventral mit Cage und autologer Spongiosa sowie zusätzlichen Implantaten stabilisiert, jedoch ohne den Einsatz von PRP. Im Rahmen der Nachbehandlung wurden nach durchschnittlich 8,33 Monaten (PRP-Gruppe) und 12,5 Monaten (Kontrolle) Computertomographien der instrumentierten Wirbelsäulenregion im Knochenfenster angefertigt. Anhand dieser wurde der Fusionsfortschritt exemplarisch für den linkslateralen Auftragungsbereich von Spongiosa bzw. Spongiosa/PRP um den Cage qualtitativ und quantifizierend mittles Volumetrie und Densitometrie (HU) erfasst. Es zeigte sich qualtitaiv bei 20% der PRP-Gruppe sowie 30% der Kontrollgruppe keine oder nur minimale linkslaterale Verknöcherung. Jeweils 40% wurden als durchgehend fusioniert klassifiziert. Quantifizierend ergab sich für beide Gruppen ein nahezu identischer mittlerer Volumenanteil > +100 HU (56,5 bzw. 56,6%) am linkslateralen Gesamtvolumen. Der Volumenanteil > +500 HU beträgt in der Kontrollgruppe 23,57% in der PRP-Gruppe hingegen 29,33%. Die absolute Dichte der Teilvolumina zeigt einen signifikant höheren Durchschnitsswert in der PRP-Gruppe (639,7 HU zu 514,2 HU) sowie nicht signifikant höhere Werte im Teilvolumen > +500 HU (930,7 HU zu 846 HU). Aus den VAS-Scores konnte für den gewählten Nachuntersuchungzeitraum kein signifikanter Unterschied im subjektiven, patientenbezogenen Outcome festgestellt werden. Insgesamt zeigt sich ein Trend, demnach der Einsatz von PRP eine Verbesserung der autologen Spongiosaplastik und damit der Verknöcherung um den Cage ermöglicht. Der bei Etablierung des Konzepts thrombozytärer Wachtsumsfaktoren-konzentrate zur Verbesserung der Knochenheilung erhoffte deutliche, klinische Effekt bleibt jedoch aus. / The effects of PRP were monitored by performing a controlled cohort study of patients undergoing an anterior spinal fusion. One group was treated with the addition of PRP. The growth factors contained within the blood platelets are known to play an important role in the new formation of bone following fractures or the implantation of bone grafts. But the results following the use of platelet-rich plasma in spinal fusion are not yet published. The study involved a group of 15 patients, who had suffered an injury of the thoracic or lumbar spine and had undergone an anterior fusion using cages. They had received an additional posterior stabilisation and/or anterior implants as well as bone graft combined with PRP. A control group made up of 20 patients received a similar treatment, but without the addition of PRP. A CT-Scan was performed of all patients during follow-up examinations. The area on the left side of the cage, where the bone graft with or without PRP had been applied, was analysed and the patients were divided into three classes, depending upon the rate of fusion: Complete fusion, incomplete fusion and no/minimal ossification. In cases, which were classified as complete or incomplete ossification, an additional CT volumetry and densitometry was performed. The patient-referred outcome was documented using the VAS spinal score. In both groups 40% of the patients had reached a complete fusion in the CT-Scans. No or minimal fusion was documented in 20% of the PRP group and 30% of the control group. When measuring the density within the newly formed bone mass, both groups showed nearly identical percentages with a density of over 100 Hounsfield units (HU). The share of bone with a density of over+500 HU was 29.33% in the PRP group) and 23.57% in the control group. Within the partition of over +100 HU the absolute density was significantly higher in the PRP group (639.7 vs. 514.2 HU). Similar results could be shown within the partition of over +500 HU (930.7 vs. 846 HU). The VAS-Scores showed no significant differences between the two groups. The additional application of autologous PRP involves very little risk for the patients. The study implies, that the use of PRP provides a faster fusion and higher density values within the fusion mass. A clear advancement in spinal fusion in terms of a clinical benefit remains questionable.

Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. / Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient.

Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist. / Apoptosis and senescence are two distinct mechanisms that are induced by oncogenes to limit their oncogenic potential during tumorigenesis. Their appearance seems to be dependent on the specific oncogene. For a long time it is known that the oncogene Myc is a strong inducer of apoptosis. Latest results revealed, that Myc is also able to induce senescence, to prevent transformed cells from proliferating. Within the framework of my PhD I concentrated on both tumor suppressive mechanisms in two independent particular projects. Increased expression and activity of Myc enhances cell proliferation and thereby induces DNA double strand breaks. This damage activates a DNA damage response which leads to Atm/Atr mediated phosphorylation of H2A.X. A further target of the kinases Atm and Atr is HectH9 which ubiquitinates the mitochondrial protein Mcl1 in a DNA damage dependent manner. The ubiquitination of Mcl1 labels this protein for proteasomal degradation. In unstressed cells Mcl1 is located in the mitochondrial membrane where it interacts with proapoptotic members of the Bcl2 family inhibiting their activity. The reduction of Mcl1 protein is essential for the activation of proapoptotic proteins at the mitochondrium allowing release of cytochrome c as initial step in apoptosis. Myc mediated tumorigenesis is limited by using a mutant form of Myc as driving oncogene. This mutation inhibits interaction of Myc to its binding partner Miz1. The interaction of Myc and Miz1 is required to repress target genes like p21Cip1 and p15Ink4b. In vivo experiments demonstrate that Myc and Miz1 need to bind to each other to bypass TGFbeta-dependent senescence. This process is dependent on elevated levels of Myc consequently reduction to physiological levels of the protein induces apoptosis and senescence in a TGFbetadependent mannerIn addition, there is evidence that Myc is directly involved in the repression of Tgfbeta. In contrast to established models of repression by the Myc/Miz1 complex, it was shown, that Myc is recruited to and binds target DNA independently of Miz1. Therefore, I suggest that interaction of both proteins is essential only at the step of transcriptional initiation.

Hintergrund dieser Arbeit ist eine Charakterisierung der zellulären Signalkaskaden innerhalb von Tenonfibroblasten, die an einer überschießenden Wundheilung mit Vernarbung nach filtrierender Glaukomchirurgie beteiligt sind. Ein besseres Verständnis der zellinternen Abläufe soll neue Ansatzpunkte zur Vernarbungshemmung nach Trabekulektomie eröffnen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine zentrale Rolle des p38-Signalweges für die Übermittlung der TGF-β-induzierten Transdifferenzierung humaner Tenonfibroblasten hin. Die Transdifferenzierung der HTF ist durch die nach 48 Stunden einsetzende Expression von Markerproteinen wie αSMA, der vermehrten Synthese von Matrixproteinen wie Collagen Iα1 und Fibronectin sowie Veränderungen der Zellmorphologie charakterisiert. Im Rahmen der Arbeit wurde die Aktivierung der p38 MAPK im Zeitverlauf betrachtet und verschiedene Aktivierungsformen von p38 herausgearbeitet: Die schnell einsetzende Aktivierung einer „hohen“ schweren p38-Isoform war meist nicht durch TGF-β an sich, sondern vielmehr durch eine mechanische Stimulation der Zellen bei Mediumwechsel zur Zugabe des Wachstumsfaktors bedingt. Demgegenüber war eine späte nach etwa 12 Stunden zu beobachtende Aktivierung einer „tiefen“ leichten p38-Isoform streng von der TGF-β-Stimulation sowie einem funktionsfähigen TGF-β-Rezeptor Typ I abhängig. Diese p38-Spätaktivierung ist zeitlich mit der TGF-β-induzierten αSMA-Expression assoziiert. Da die TGF-β-induzierte αSMA-Transkription durch Blockade der Proteinbiosynthese verhindert wird und eine zeitliche Lücke bis zur relevanten p38-Spätaktivierung besteht, ist offenbar die Synthese eines Zwischenboten notwendig. Als möglicher Kandidat für einen solchen Intermediator kam nach Literaturlage GADD45β in Frage: GADD45β konnte schließlich sowohl qualitativ als auch quantitativ nach TGF-β-Exposition in HTF nachgewiesen werden: Es wird mit einem deutlichen Maximum innerhalb der ersten Stunde für einige Stunden synthetisiert. Die beobachtete rasche SMAD2-Aktivierung in HTF, die in keinem direkten zeitlichen Zusammenhang zur αSMA-Expression steht, könnte verantwortlich für die Induktion von GADD45β sein und damit über Aktivierung von p38 zur Transdifferenzierung der Tenonfibroblasten zu Myofibroblasten beitragen. Für den weitergehenden Nachweis der Bedeutung von GADD45β ist dessen spezifische Blockade durch antisense-Überexpression mittels viralen Vektoren oder RNA-Interferenz anzustreben. Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass GADD45β neben der p38 MAPK ein potentielles Ziel zur therapeutischen Modulation der TGF-β-vermittelten Transdifferenzierung von humanen Tenonfibroblasten darstellen kann. / Main problem after trabeculectomy in therapy of glaucoma is scarring. In search of new targets in modification of wound healing, a better understanding of cellular signal cascades of human tenonfibroblasts in transdifferentiation to myofibroblasts is aspired. TGF-β induces transdifferentiation of tenonfibroblasts, characterised by increased expression of marker proteins like αSMA and synthesis of matrix proteins like Collagen Iα1 and Fibronectin. Intracellular signal transducing of TGF-β by p38 seems to be essential. The time course of activation of the p38 MAPK was observed and a relevant late activation after 12 hours was found. Furthermore a mediatior in the meantime of the first hours was identified: GADD45β is induced in a chronological correlation. P38 and GADD45β could both be potential targets in modification of scarring after trabeculectomy.

Das primäre Offenwinkelglaukom (POWG) ist eine mit typischen Gesichtfeld- und Papillenschäden einhergehende Erkrankung des Auges, die in den westlichen Industrienationen zu den häufigsten Erblindungsursachen zählt. An Glaukom erkrankte Patienten weisen häufig erhöhte Augeninnendruckwerte und gesteigerte TGF-beta 2-Spiegel im Kammerwasser auf. Der Augeninnendruck wird im Wesentlichen durch den Abflusswiderstand des Trabekelmaschenwerks bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Wachstumsfaktors TGF-beta 2 auf das Zytoskelett von menschlichen Trabekelmaschenwerkszellen (HTM) untersucht. Hierbei konnten die bereits bekannten TGF-beta-Effekte, nämlich verstärkte Stressfaserbildung und Zunahme der alpha-SMA- sowie Aktin-Expression bestätigt werden. Bisher unbekannt war die Zunahme der Expression von N-Cadherin und beta-Catenin unter TGF-beta, die Veränderungen der Zell-Zell-Adhäsionen nach sich zieht und damit auch Einfluss auf die biomechanischen Eigenschaften des Trabekelmaschenwerks haben könnte. beta-Catenin ist hierbei auch unter dem Einfluss von TGF-beta nur zu einem geringen Anteil im Zellkern lokalisiert, was mit einer vermehrten Lokalisation von beta-Catenin in Zell-Zell-Verbindungen vereinbar ist. Da vermutlich unter TGF-beta-Stimulation sogar eher weniger beta-Catenin als Mediator für den Wnt-Signalpfad zur Verfügung steht, könnte ein TGF-beta-vermittelter Wnt-Antagonismus eine Rolle in der Entstehung des POWG spielen. Es ist bekannt dass eine Hemmung des Wnt-Signalwegs den Augeninnendruck erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass an der TGF-beta 2-Signalgebung in humanen Trabekelmaschenwerkszellen außer dem klassischen Smad-Weg auch MEK/ERK und PI3K/AKT an der Signalübertragung beteiligt sind. Hierbei sind die TGF-beta-induzierten Änderungen der Zell-Zell-Verbindungen von der Smad- und AKT-Signalgebung abhängig, während die Effekte von TGF-beta auf alpha-SMA über den MEK/ERK-Signalweg vermittelt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen einige neu beobachtete TGF-beta-Effekte im Trabekelmaschenwerk, von denen insbesondere die Veränderungen des Zellskeletts und der Zell-Zell-Verbindungen sowie die möglicherweise stattfindende Depletion des Wnt-Signalweges Bedeutung für die Entstehung des Offenwinkelglaukoms haben könnten. / Primary open angle glaucoma (POAG) is a chronic optic neuropathy with elevated intraocular pressure and ageing as major risk factors. The incidence of POAG is expected to rise in the aging industrial societies. Structural changes in the trabecular meshwork (TM) and elevated TGF-beta 2 levels in the aequous humor have been described in POAG-patients. It has been shown that TGF-beta modulates the amount and the composition of the extracellular matrix and intracellular proteins in the TM. Here we show that TGF-beta 2 modulates the cytosceletal rearrangements and the expression of cadherins in human TM cells. These changes require the canonical Smad-pathway as well as non-canonical signaling by the Pi3K/AKT- and MEK/ERK-pathways. Changes in the cytoskeleton and cell-cell adhesions might influence the mechanotransduction characteristics of TM tissue and thus have effects on the regulation of intraocular pressure with implications in primary open angle glaucoma.

Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose. / Background: Interstitial fibrosis is of major importance for the deterioration of renal function, leading to uremia. Interaction of filtered proteins with proximal tubular cells is crucial for the onset and development of tubulointerstitial damage. In the present study we investigated the effects of albuminuria on collagen homeostasis and signaling pathways of the proximal tubular cells. Methods: Therefore we exposed cultured cells derived from the proximal tubule (OK-, LLC-PK1-cells) with high endocytic activity by expressing the endocytic machinery typical for the proximal tubule (megalin, cubilin, NHE3) to albumin concentrations in a range expected during enhanced protein filtration. For comparative studies we used renal epithelial cells (MDCK-, IHKE1-, NHE3-deficient-OK-cells) with low endocytic activity. Collagen homeostasis was assessed by collagenase-sensitive proline incorporation assay, collagen ELISA and collagen Western blot; matrix metalloproteinase activity was assessed by zymography and gelatinase assay. Signaling pathways were monitored by SEAP reporter gene asssay. Results: Albumin exposure led to an increase of secreted collagen type I, III and IV in cells with high endocytic activity. In cells with low endocytic activity albumin exposure inhibited collagen secretion. Collagen Western blot analysis showed an albumin-induced increase of cellular collagen. MMP activity was significantly decreased by albumin exposure shown by zymography and gelatinase assay. Furthermore, albumin exposure led to activation of the NF-kappaB-, AP1- and CRE-pathways detected by SEAP reporter gene assay. Inhibition of NF-kappaB, PKC and PKA partially reversed the effects of albumin-induced collagen secretion. Inhibition of receptor-mediated albumin endocytosis by NHE3-inhibitor EIPA reduced collagen secretion and activation of the above investigated pathways. Discussion: The data show that protein exposure, in a concentration range expected during enhanced protein filtration, disturbs collagen homeostasis of proximal tubular cells due to increased collagen synthesis and decreased collagen degradation. Especially collagen type I and III may contribute to tubulointerstitial fibrosis. The signaling pathways activated by albumin exposure include PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 and CRE; stimulation of PKC, PKA and NF-kappaB directly contribute to collagen secretion. There has to be efficient receptor-mediated protein endocytosis in order to stimulate collagen secretion and signaling pathways; the mere presence of protein in the proximale tubule is not sufficient. The disturbed matrix homeostasis probably supports the progression of interstitial fibrosis, which is of importance for the development of renal insufficiency. Therefore albuminuria is not only a marker, but also a motor or renal fibrosis.

O objetivo deste trabalho foi avaliar, in vitro, os efeitos de diferentes concentrações do fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) em células-tronco derivadas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos (SHED), com relação à viabilidade, proliferação, migração e diferenciação celular. As SHED foram mantidas em meio de cultura MEMα + soro fetal bovino (FBS) 10% + penicilina e estreptomicina 1% e tratadas com TGF-β1 na concentração de 1,0; 5,0 e 10,0 ng/mL. Após 1, 3, 5 e 7 dias, foram avaliadas a viabilidade celular pelo método MTT e a proliferação pelo método SRB. Após 24 h de tratamento com TGF-β1, foi realizado um ensaio de migração celular por meio de insertos com poros de 8 μm. Para a avaliação da diferenciação celular de SHED em odontoblastos foram analisados por meio da RT-PCR os marcadores DSPP e DMP-1, após tratamento com TGF-β1 nas diferentes concentrações por 14 dias. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de Tukey. Em relação à viabilidade celular, as diferentes concentrações de TGF-β1 não tiveram efeito citotóxico sobre SHED. As células tratadas com diferentes concentrações de TGF-β1 apresentaram maiores taxas de proliferação que as do controle negativo (MEMα + 10% de FBS) a partir do 3o dia (p=0,000). Observou-se maiores taxas de migração em direção aos meios contendo TGF-β1, mas sem diferença estatisticamente significativa entre as diferentes concentrações utilizadas, entretanto, houve diferença estatisticamente significativa entre as diferentes concentrações de TGF-β1 com o controle positivo (p=0,000), controle negativo (p=0,000) e entre o controle positivo e negativo (p=0,002). A expressão de DMP-1 foi observada de forma crescente nas doses de 1,0 e 5,0 ng/mL de TGF-β1 ao longo do período (1, 7 e 14 dias) e na dose de 10,0 ng/mL a marcação foi mais intensa desde o primeiro dia do estímulo. Em relação à expressão de DSPP, o grupo tratado com 10,0 ng/mL apresentou marcação após 14 dias de tratamento. Sendo assim, este estudo permite concluir que as diferentes concentrações de TGF-β1 estimularam a proliferação e migração celular, sem efeito citotóxico sobre as células ao longo do período do estudo. Em relação à diferenciação celular a concentração 10,0 ng/mL de TGF-β1 estimulou à expressão de DMP-1 e DSPP. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the effect of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) in stem cells derived from the pulp of human exfoliated deciduous teeth (SHED) regarding to cell viability, proliferation, migration and differentiation. SHED were maintained in MEMα culture medium + 10% fetal bovine serum (FBS) + 1% penicillin and streptomycin, and treated with TGF-β1 at the following concentrations of 1.0; 5.0 and 10.0 ng/mL. After 1, 3, 5 and 7 days, cell viability was assessed by MTT assay and proliferation by the SRB method. After 24h of TGF-β1 treatment, cell migration assay was carried out using inserts of 8 μm pore size. To evaluate SHED differentiation into odontoblasts, DMP-1 and DSPP markers were analyzed by RT-PCR, after treatment at different concentrations of TGF-β1 for 14 days. The results were submitted by ANOVA and Tukey test. With respect to cell viability, the different TGF-β1 concentrations did not have cytotoxic effect on SHED. The cells treated by different TGF-β1 concentrations showed higher proliferation rates than those of the negative control (MEMα + 10% FBS) after the third day (p = 0.000). Higher rates of migration towards the media containing TGF-β1 were observed, but there were no statistically significant differences among the concentrations. All different TGF-β1 concentrations showed statistically significant differences with the positive control (p=0.000) and negative control (p=0.000). Statistically significant differences were observed between positive and negative control (p=0.002). DMP-1 expression was observed incrementally at TGF-β1 concentrations of 1.0 and 5.0 ng/mL at 1, 7, and 14 days and the concentration of 10.0 ng/mL was more intense from day one of the stimulus. DSPP expression was more intense after 14 days of treatment with the concentration of 10.0 ng/mL. Thus, this study concluded that different TGF-β1 concentrations stimulated cell proliferation and migration, without cytotoxic effect on the cells throughout the study period. From the perspective of cell differentiation, TGF-β1 concentration of 10.0 ng/mL was capable of stimulating DMP-1 and DSPP expression.

O objetivo deste trabalho foi avaliar, in vitro, os efeitos de diferentes concentrações do fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) em células-tronco derivadas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos (SHED), com relação à viabilidade, proliferação, migração e diferenciação celular. As SHED foram mantidas em meio de cultura MEMα + soro fetal bovino (FBS) 10% + penicilina e estreptomicina 1% e tratadas com TGF-β1 na concentração de 1,0; 5,0 e 10,0 ng/mL. Após 1, 3, 5 e 7 dias, foram avaliadas a viabilidade celular pelo método MTT e a proliferação pelo método SRB. Após 24 h de tratamento com TGF-β1, foi realizado um ensaio de migração celular por meio de insertos com poros de 8 μm. Para a avaliação da diferenciação celular de SHED em odontoblastos foram analisados por meio da RT-PCR os marcadores DSPP e DMP-1, após tratamento com TGF-β1 nas diferentes concentrações por 14 dias. Os resultados foram submetidos à ANOVA seguido do teste de Tukey. Em relação à viabilidade celular, as diferentes concentrações de TGF-β1 não tiveram efeito citotóxico sobre SHED. As células tratadas com diferentes concentrações de TGF-β1 apresentaram maiores taxas de proliferação que as do controle negativo (MEMα + 10% de FBS) a partir do 3o dia (p=0,000). Observou-se maiores taxas de migração em direção aos meios contendo TGF-β1, mas sem diferença estatisticamente significativa entre as diferentes concentrações utilizadas, entretanto, houve diferença estatisticamente significativa entre as diferentes concentrações de TGF-β1 com o controle positivo (p=0,000), controle negativo (p=0,000) e entre o controle positivo e negativo (p=0,002). A expressão de DMP-1 foi observada de forma crescente nas doses de 1,0 e 5,0 ng/mL de TGF-β1 ao longo do período (1, 7 e 14 dias) e na dose de 10,0 ng/mL a marcação foi mais intensa desde o primeiro dia do estímulo. Em relação à expressão de DSPP, o grupo tratado com 10,0 ng/mL apresentou marcação após 14 dias de tratamento. Sendo assim, este estudo permite concluir que as diferentes concentrações de TGF-β1 estimularam a proliferação e migração celular, sem efeito citotóxico sobre as células ao longo do período do estudo. Em relação à diferenciação celular a concentração 10,0 ng/mL de TGF-β1 estimulou à expressão de DMP-1 e DSPP. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the effect of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) in stem cells derived from the pulp of human exfoliated deciduous teeth (SHED) regarding to cell viability, proliferation, migration and differentiation. SHED were maintained in MEMα culture medium + 10% fetal bovine serum (FBS) + 1% penicillin and streptomycin, and treated with TGF-β1 at the following concentrations of 1.0; 5.0 and 10.0 ng/mL. After 1, 3, 5 and 7 days, cell viability was assessed by MTT assay and proliferation by the SRB method. After 24h of TGF-β1 treatment, cell migration assay was carried out using inserts of 8 μm pore size. To evaluate SHED differentiation into odontoblasts, DMP-1 and DSPP markers were analyzed by RT-PCR, after treatment at different concentrations of TGF-β1 for 14 days. The results were submitted by ANOVA and Tukey test. With respect to cell viability, the different TGF-β1 concentrations did not have cytotoxic effect on SHED. The cells treated by different TGF-β1 concentrations showed higher proliferation rates than those of the negative control (MEMα + 10% FBS) after the third day (p = 0.000). Higher rates of migration towards the media containing TGF-β1 were observed, but there were no statistically significant differences among the concentrations. All different TGF-β1 concentrations showed statistically significant differences with the positive control (p=0.000) and negative control (p=0.000). Statistically significant differences were observed between positive and negative control (p=0.002). DMP-1 expression was observed incrementally at TGF-β1 concentrations of 1.0 and 5.0 ng/mL at 1, 7, and 14 days and the concentration of 10.0 ng/mL was more intense from day one of the stimulus. DSPP expression was more intense after 14 days of treatment with the concentration of 10.0 ng/mL. Thus, this study concluded that different TGF-β1 concentrations stimulated cell proliferation and migration, without cytotoxic effect on the cells throughout the study period. From the perspective of cell differentiation, TGF-β1 concentration of 10.0 ng/mL was capable of stimulating DMP-1 and DSPP expression.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A organização de fibras de colágeno no leito de uma ferida é componente importante da cicatrização e contração da ferida, determinando em última instância a qualidade final da cicatriz. Neste estudo realizamos a implantação de modelo de biotecnologia constituído de géis de colágeno povoados por fibroblastos humanos, que foi utilizado como instrumento para a melhor compreensão dos fenômenos ainda pouco elucidados, envolvidos na contração de feridas. Utilizando fibroblastos procedentes de pele normal ou quelóides, observou-se maior contração dos géis povoados por fibroblastos oriundos de quelóide. O modelo implementado foi considerado eficiente para a avaliação da presença de moduladores da fase de remodelação da cicatriz, tais como o Fator de Crescimento Transformador Beta (TGF beta). A comparação entre a curva de contração gerada por fibroblastos oriudos de pele normal sob o efeito do TGF beta e a contração gerada por fibroblastos de quelóides, demonstra que as mesmas apresentam comportamento igual do ponto de vista estatístico. O modelo proposto demonstrou ser adequado para a melhor compreensão dos mecanismos responsáveis pela contração de feridas, bem como possui potencial na avaliação de novas drogas capazes de modular este fenômeno / An important component of tissue healing and wound contraction is the re-arrangement of ground collagen fibers, which can ultimately influence the final quality of scars. In this study we used a biotechnology experimental model with contracting collagen gels seeded with human fibroblasts in order to better understand the phenomena involved in wound contraction. We compared the contraction of the collagen gels using fibroblasts from normal skin and from keloids, and we observed that the collagen gels seeded with keloid fibroblasts suffered a bigger contraction. The model was considered efficient to test growth factors with the potential to modulate the remodeling phase of the scar, for example, the Transforming Growth Factor Beta (TGF beta). The analysis of the changing macroscopic gel area comparing the contraction generated by the normal fibroblasts after the treatment with TGF beta with the contraction in the gels with keloid\'s fibroblasts showed that they have the same behavior. The experimental model proved to be an useful tool to better understand the wound contraction and to test new drugs to modulate this phenomenon.