Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist das Kerngen CBS2 aus Saccharomyces cerevisiae. Cbs2p wird gemeinsam mit Cbs1p spezifisch für die Translation der Cytochrom b (COB)-mRNA in den Mitochondrien benötigt. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Charakterisierung funktionell wichtiger Bereiche im N- und C-terminalen Bereich des Proteins, den Nachweis von Protein-Protein Wechelwirkungen, die Assoziation von Cbs2p mit mitochondrialen Ribosomen und die Bedeutung des N-terminalen Bereiches für den Import von Cbs2p in die Mitochondrien. Die aminoterminalen 35 Aminosäuren (As) von Cbs2p genügen, um das Reporterprotein Gfp vollständig in die Mitochondrien zu rekrutieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass der N-Terminus von Cbs2p den Import von Proteinen in die Mitochondrien vermitteln kann. Da ein N-terminal um 35 As verkürztes Cbs2-Protein ebenfalls noch in den Mitochondrien nachweisbar ist, besitzt Cbs2p wenigstens ein weiteres, vom N-Terminus unabhängiges, internes oder C-terminal lokalisiertes Importsignal für die Mitochondrien. Aufgrund genetischer Daten ist Abc1p ein potenzieller Interaktionspartner von Cbs2p. Es konnte gezeigt werden, dass eine physikalische Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen stattfindet. Mittels Blauer Nativ-Gelelektrophorese wurde Cbs2p in einem höher molekularen Proteinkomplex nachgewiesen. Da Cbs2p in der Lage ist, in vitro Homomere zu bilden, sprechen die Daten dafür, das Cbs2p als Multimer in diesem Komplex vorliegt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der N-Terminus von Cbs2p eine essentielle Rolle bei der Homomerisierung des Proteins spielt. Die vorliegenden Ergebnisse erweitern das von Michaelis et al. (1991) entwickelte Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p wie folgt: Cbs1p und Cbs2p sind mit der inneren Membran assoziiert. Beide Proteine könnten die COB-mRNA an die mitochondriale Innenmembran führen. Der Kontakt zwischen der COB-mRNA und der mitochondrialen Translationsmaschinerie könnte durch die Assoziation von Cbs2p mit mitochondrialen Ribosomen hergestellt werden. Nur an der Membran erlaubt die Prozessierungs- und Translationsmaschinerie die Reifung von COB-mRNA und die Synthese und Assemblierung von Cytochrom b. Das Vorliegen von Cbs2p in einem hoch molekularen Komplex und die physikalische Wechselwirkung mit Abc1p könnten ein Hinweis dafür sein, dass die Translation in räumlicher Nähe des Assemblierungsortes von Cytochrom b, dem bc1-Komplex, stattfindet.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist das Kerngen CBS2 aus Saccharomyces cerevisiae. Cbs2p wird gemeinsam mit Cbs1p spezifisch für die Translation der Cytochrom b (COB)-mRNA in den Mitochondrien benötigt. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Charakterisierung funktionell wichtiger Bereiche im N- und C-terminalen Bereich des Proteins, den Nachweis von Protein-Protein Wechelwirkungen, die Assoziation von Cbs2p mit mitochondrialen Ribosomen und die Bedeutung des N-terminalen Bereiches für den Import von Cbs2p in die Mitochondrien. Die aminoterminalen 35 Aminosäuren (As) von Cbs2p genügen, um das Reporterprotein Gfp vollständig in die Mitochondrien zu rekrutieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass der N-Terminus von Cbs2p den Import von Proteinen in die Mitochondrien vermitteln kann. Da ein N-terminal um 35 As verkürztes Cbs2-Protein ebenfalls noch in den Mitochondrien nachweisbar ist, besitzt Cbs2p wenigstens ein weiteres, vom N-Terminus unabhängiges, internes oder C-terminal lokalisiertes Importsignal für die Mitochondrien. Aufgrund genetischer Daten ist Abc1p ein potenzieller Interaktionspartner von Cbs2p. Es konnte gezeigt werden, dass eine physikalische Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen stattfindet. Mittels Blauer Nativ-Gelelektrophorese wurde Cbs2p in einem höher molekularen Proteinkomplex nachgewiesen. Da Cbs2p in der Lage ist, in vitro Homomere zu bilden, sprechen die Daten dafür, das Cbs2p als Multimer in diesem Komplex vorliegt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der N-Terminus von Cbs2p eine essentielle Rolle bei der Homomerisierung des Proteins spielt. Die vorliegenden Ergebnisse erweitern das von Michaelis et al. (1991) entwickelte Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p wie folgt: Cbs1p und Cbs2p sind mit der inneren Membran assoziiert. Beide Proteine könnten die COB-mRNA an die mitochondriale Innenmembran führen. Der Kontakt zwischen der COB-mRNA und der mitochondrialen Translationsmaschinerie könnte durch die Assoziation von Cbs2p mit mitochondrialen Ribosomen hergestellt werden. Nur an der Membran erlaubt die Prozessierungs- und Translationsmaschinerie die Reifung von COB-mRNA und die Synthese und Assemblierung von Cytochrom b. Das Vorliegen von Cbs2p in einem hoch molekularen Komplex und die physikalische Wechselwirkung mit Abc1p könnten ein Hinweis dafür sein, dass die Translation in räumlicher Nähe des Assemblierungsortes von Cytochrom b, dem bc1-Komplex, stattfindet.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.