University, Diss., 2004--Kassel.

Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie benötigt und daher mittels vielfältiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierfür stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche hauptsächlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5’-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv ermöglicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. Nährstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird. Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation ermöglicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erwägung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP – Sequenzen identifiziert werden, welche sich für Strukturanalysen eignen würden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde über verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert. Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. Während gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7–Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte für Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK – Interaktion ausüben, welcher in weiteren Studien berücksichtigt werden sollte. / In the nucleus of eucaryotic cells, genes are transcribed into mRNA which are heavily processed and exported into the cytoplasm. There they are translated into proteins, a process requiring large amounts of energy so this process is strongly regulated. One example is the class of TOP RNAs consisting mainly of transcripts encoding for proteins involved in translation. Some well-known examples include the proteins of the large and small ribosomal subunits. TOP RNAs share a common motif at the start of their 5’ UTR comprising a sequence entirely made of Pyrimidines immediately following the cap. This motif common to all TOP RNAs enables translational control of this class of RNAs in a timely coordinated manner. In this way, during conditions of stress like nutrient starvation, translation of TOP RNAs can be inhibited to save energy. The search for a regulator which binds to the TOP motif and enables coordinated regulation started long ago. In principle the regulator could activate or inhibit translation. Different proteins have been considered to be the regulator so far. In this thesis the protein TIAR was identified as TOP interacting factor using mass spectrometry. Its binding properties regarding the TOP motif have been evaluated using EMSA. RNA and proteins of different organisms were evaluated to identify minimal binding partner constructs for further structural analysis. Using different sequential purification approaches, the 14-3-3ε protein was also identified as TOP binding factor. Furthermore, the TOP binding proteins LARP1 and LARP7 and their target RNA sequences have been evaluated in regard to their binding properties. It could be shown that LARP1 has an inhibiting effect on translation of TOP RNAs. Using EMSA, minimal binding constructs of LARP7 and 7SK could be established which can be considered for further structural analysis. Also, it could be shown that certain substances like tRNA and Arginine influence the interaction of LARP7 and 7SK, an observation which should be considered in further experiments.

–1 programmed ribosomal frameshifting (–1PRF) is a fundamental recoding process that makes alternative reading frames accessible during translation. Especially RNA viruses rely on this mechanism to regulate gene expression for example while main- taining the correct stoichiometry of replicative enzymes and structural proteins. –1PRF is at the heart of viral replication and it has been shown that perturbations of –1PRF efficiency can have dramatic effects on viral fitness. In the present work, two viral –1PRF elements were studied: severe acute respi- ratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ORF1 a/b and human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) gag-pol. In a mutational study of the SARS-CoV-2 –1PRF element it was confirmed that it functions in its pseudoknot conformation. Additionally, through mutagenesis as well as targeting by antisense oligonucleotides, it was shown that the structure of the RNA directly correlates to –1PRF efficiency. Next, protein interactors of both –1PRF elements were captured revealing over 100 interactors for SARS-CoV-2 and almost 50 for HIV-1. Through this, a set of 18 core interactors of the unrelated –1PRF elements of SARS-CoV-2 and HIV-1 was identified. Among those, the two proteins HNRNPH1 and ZNF346 were shown to reduce –1PRF efficiency significantly for both sites. Among the interactors of SARS-CoV or HIV-1 alone, the strongest effect was mediated by ZAP-S for SARS-CoV-2 and SRBD1 for HIV-1. Finally, it was shown that overexpression of ZAP-S reduced the replication of SARS- CoV-2 by 95% in collaboration with the group of Prof. Dr. Čičin-Šain. In addition, using pseudotyped HIV-1 particles, overexpression of SRBD1 reduced RTase levels and by extension viral titers by 90%. / Das –1 programmierte ribosomale Frameshifting (–1PRF) ist ein grundlegender Umkodierungsprozess, der alternative Leseraster während der Translation zugänglich macht. Insbesondere RNA-Viren sind auf diesen Mechanismus angewiesen, um beispielsweise die Genexpression zu regulieren und gleichzeitig die korrekte Stöchiometrie der replizierenden Enzyme und Strukturproteine aufrechtzuerhalten. Das –1PRF ist das Herzstück der viralen Replikation, und es hat sich gezeigt, dass Störungen der –1PRF-Effizienz dramatische Auswirkungen auf die virale Fitness haben können. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei virale –1PRF-Elemente untersucht: das Coronavirus 2 des schweren akuten Respirationssyndroms (SARS-CoV-2) ORF1 a/b und das humane Immunschwächevirus 1 (HIV-1) gag-pol. In einer Mutationsstudie des SARS-CoV-2 –1PRF-Elements wurde bestätigt, dass es in seiner Pseudoknotenkonformation funktioniert. Darüber hinaus wurde durch Mutagenese sowie durch Targeting mit Antisense-Oligonukleotiden gezeigt, dass die Struktur der RNA direkt mit der –1PRF-Effizienz korreliert. Als Nächstes wurden die Protein-Interaktoren beider –1PRF-Elemente erfasst, wobei über 100 Interaktoren für SARS-CoV-2 und fast 50 für HIV-1 gefunden wurden. Auf diese Weise wurde eine Gruppe von 18 Kerninteraktoren der nicht miteinander verbundenen –1PRF-Elemente von SARS-CoV-2 und HIV-1 identifiziert. Unter diesen konnten die beiden Proteine HNRNPH1 und ZNF346 die –1PRF-Effizienz an beiden Stellen deutlich verringern. Unter den Interaktoren von SARS-CoV oder HIV-1 allein wurde die stärkste Wirkung durch ZAP-S für SARS-CoV-2 und SRBD1 für HIV-1vermittelt. Schließlich wurde in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Čičin-Šain gezeigt, dass die Überexpression von ZAP-S die Replikation von SARS-CoV-2 um 95% reduziert. Darüber hinaus reduzierte die Überexpression von SRBD1 unter Verwendung von pseudotypisierten HIV-1-Partikeln die RTase-Werte und damit auch die Virustiter um 90%.

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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.

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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Cbs1p und Cbs2p, zwei spezifische Translationsaktivatoren der COB-mRNA. Im Mittelpunkt standen sowohl die weitere molekularbiologische und biochemische Charakterisierung von Cbs1p als auch ein Screening von Interaktionskandidaten, die mit Cbs1p und/oder Cbs2p physikalisch wechselwirken könnten. Cbs1p liegt als peripheres Membranprotein fest mit der inneren Mitochondrienmembran matrixseitig assoziiert vor. Dabei spielen möglicherweise hydrophobe und/oder Protein-Protein-Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen eine essentielle Rolle bei der Membranverankerung von Cbs1p. Durch die Identifizierug von atmungsdefekten Cbs1p-Mutanten, deren Mutationen in Bereichen mit Homologie zu RNA-bindenden Proteinen liegt, verstärken sich die Hinweise zur Beteiligung von Cbs1p an der direkten physikalischen Wechselwirkung mit dem 5´-leader der COB-mRNA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,, dass die abspaltbare Präsequenz nicht notwendig für einen mitochondrialen Import ist. Die Ergebnisse präzisieren und erweitern das vorliegende Modell der Wirkungsweise der Translationsaktivatoren Cbs1p und Cbs2p (Michaelis, 1991). Aufgrund der Membranverankerung von Cbs1p wird auch die gebundene COB-mRNA in räumlicher Nähe zur Membran gebracht. Darüber hinaus definiert Cbs1p damit möglicherweise auch den Ort der Insertion des nascierenden Apocytochrom b in die Membran. Cbs2p vermittelt die Bindung zur kleinen Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen und könnte seinerseits ebenfalls in Interaktionen mit Untereinheiten des bc1-Komplexes involviert sein.