Aedes aegypti mosquitoes, vectors for many human diseases, begin life as larvae developing in water, potentially exposed to runoff with herbicides and pesticides. This study serves as a novel investigation into the transstadial effects of exposure to Roundup on A. aegypti life history, immunity, and stress response and aims to account for these effects in an R0 model for vectorborne disease transmission. Prior work has shown that Roundup negatively affects mosquito life history. I hypothesized that larval exposure to the maximum sublethal dose of Roundup (7189µg/L) would negatively impact A. aegypti life history, immunity (candidate gene approach), and stress response (heat shock protein expression and fluctuating asymmetry). No significant differences were found for survival from the larval to adult stages, body size, size or shape fluctuating asymmetry, or sex ratio. However, the Roundup treatment group developed significantly slower for both time to pupation and to adult eclosion (both p < 0.0001). Adult immune gene expression showed no difference between groups, but the larval immune genes Dome (JAK-STAT pathway) and Spatzle (TOLL pathway) were downregulated in the Roundup treatment (p=0.0383 and p=0.0035, respectively), suggesting the larvae have reduced immunity. This study suggests that Roundup may have off-target effects on A. aegypti mosquitoes that are unaccounted for by current models, and these effects may potentially alter disease transmission to human hosts.

Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.

Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.