Orientador: Arício Xavier Linhares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:41:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_CarolineSiqueira_M.pdf: 1657929 bytes, checksum: 0b27568a919b921d3ae68ae3161f87fd (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A febre maculosa brasileira (FMB) é uma doença infecciosa aguda transmitida através da picada de carrapatos infectados com Rickettsia rickettsii Brumpt 1922. O carrapato Amblyomma cajennense Fabricius 1787 (Acari: Ixodidae) é um dos principais vetores no Brasil. Contudo, outras espécies de carrapatos podem ser vetores da doença e parasitar humanos. Neste estudo, procurou-se avaliar a competência vetorial de Ornithodoros mimon Kohls 1969 (Acari: Argasidae) em laboratório após ser infectado experimentalmente com a cepa Taiaçu de Rickettsia rickettsii, utilizando coelhos domésticos como modelo animal. Primeiramente, os carrapatos foram separados em grupos de acordo com seu estágio de desenvolvimento (larva, ninfa 2 e adulto). Na segunda etapa, dois coelhos foram utilizados como grupo tratamento, e foram inoculados com a Rickettsia, e um coelho foi usado como controle. Os carrapatos utilizados foram separados em lotes, de acordo com o coelho e dia em que foram alimentados. Na terceira etapa, novos coelhos sadios foram infestados com os carrapatos usados na segunda etapa, para verificar se houve transmissão. Carrapatos que tiveram contato com a bactéria foram macerados e inoculados em duas cobaias, e uma terceira cobaia foi infestada com carrapatos que foram alimentados em coelho infectado. PCR com os primers gltA e ompA (R. rickettsii), ftsZ (Wolbachia sp.), 28S (eucarioto) foi realizado, para avaliar se os carrapatos se tornaram infectados. Sequenciamento de amostras foram amplificadas com os primers ompA e 28S. Além da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), que foi realizada com o soro dos coelhos para verificar a presença de infecção. Os dois coelhos que foram inoculados com Rickettsia rickettsii apresentaram picos de febre. Um dos coelhos apresentou resultado positivo na RIFI e o outro morreu no décimo sexto dia após a inoculação. Os coelhos que foram infestados com carrapatos que foram alimentados em coelho infectado não apresentaram febre e nenhum outro sintoma da doença. As cobaias que foram inoculadas com carrapatos e a cobaia que foi infestada com carrapatos não demonstraram nenhum sintoma da doença. Das amostras amplificadas com o primer gltA apenas uma amostra foi positiva. A PCR das amostras de carrapatos usando o primer ompA não apresentou o resultado esperado, provavelmente devido a presença do DNA da bactéria Wolbachia sp. A sequência gerada, com amostras que foram amplificadas com o primer 28S, foi o DNA do carrapato. A PCR com o primer ftsZ não amplificou nenhum DNA. Portanto, conclui-se que O. mimon não se tornou infectado com a Rickettsia rickettsii, e não representa risco para a saúde pública / Abstract: The Brazilian Spotted Fever (BSF) is an acute infectious disease transmitted by the bite of ticks infected with Rickettsia rickettsii Brumpt 1922. The tick Amblyomma cajennense Fabricius 1787 (Acari: Ixodidae) is one of the main vectors in Brazil. However, other species of ticks can be vectors of this disease and parasitize humans. This study aimed to evaluate the vector competence of Ornithodoros mimon Kohls 1969 (Acari: Argasidae) in the laboratory after being experimentally infected with the Taiaçu strain of Rickettsia rickettsii, using domestic rabbits as the animal models. Firstly, the ticks were separated into groups according to their developmental stage (larva, nymph 2 and adult). Secondly, two rabbits were used as treatment group, and were inoculated with the Rickettsia, and one rabbit was used as control. The ticks were separated into batches according to the rabbit and the day they were fed. New healthy rabbits were infested with the ticks used in the second experiment, to verify the occurrence of transmission. Ticks that had contact with the bacteria were macerated and inoculated into two guinea pigs, and a third guinea pig was infested with ticks that were fed on infected rabbits. PCR with gltA e ompA primers (R. rickettsii), ftsZ (Wolbachia sp.), 28S (eukaryotic) was performed, to assess if the ticks become infected. Sequencing of the samples was amplified with the primers ompA and 28S. In addition, the Immunofluorescence Assay (IFA) was performed with serum of rabbits to verify the presence of infection. The two rabbits that were inoculated with Rickettsia rickettsii presented peaks of fever. One rabbit presented a positive result in the IFA and the other died on the sixteenth day after inoculation. The rabbits that were infested with ticks that were fed on infected rabbits, showed no fever and no other symptoms of the disease. The guinea pigs that were inoculated with ticks and the guinea pig that was infested with ticks showed no symptoms of the disease. Of the samples only one of all samples amplified with the primer gltA was positive. The PCR samples of ticks using the primer ompA did not yield the expected result, probably due to the presence of the DNA of the bacteria Wolbachia sp. The sequence generated, with samples that were amplified with the primer 28S, it was the DNA of the tick. PCR performed with the primer ftsZ did not amplify any DNA. Therefore, we concluded that O. mimon did not become infected with R. rickettsii, and do not represent risk to public health / Mestrado / Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia / Mestra em Biologia Animal

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

Orientador: Cláudio Casanova / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T11:03:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CollaJacques_FernandaElisa_D.pdf: 17373999 bytes, checksum: 18adb4b65dc2639da145a80ed8b6f4e2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) são insetos de importância médico-veterinária pois participam do ciclo de doenças tais como leishmanioses, que acometem milhares de pessoas ao redor do mundo. O conhecimento sobre a ecologia e biologia desses dípteros é de fundamental importância para determinar a capacidade e competência vetorial de suas populações, e portanto, relevantes do ponto de vista da saúde pública. Este trabalho buscou esclarecer alguns pontos com informações deficientes sobre a biologia e ecologia das espécies vetoras de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e Leishmania (Viannia) braziliensis, respectivamente, Lutzomyia longipalpis e Nyssomyia neivai, no estado de São Paulo. Para a leishmaniose visceral americana (LVA), objetivou-se esclarecer questões a respeito de criadouros urbanos preferenciais de Lu. longipalpis e sobre sua expansão geográfica no estado de São Paulo. Em referências às lacunas no conhecimento da ecoepidemiologia da leishmaniose tegumentar americana, a competência vetorial de Nyssomyia neivai para L. (V.) braziliensis e o estudo da composição da comunidade flebotomínica em área endêmica no nordeste do estado, bem como sua variação mensal. Criadouros de Lu. longipalpis foram encontrados predominantemente em ambientes sombreados com grande quantidade de matéria orgânica, com maior concentração de larvas associadas a galinheiros. Quanto à sua dispersão, esta parece ter seguido uma rota a partir de Mato Grosso do Sul, seguindo em direção oeste-leste e também para norte e para sul a partir dessa linha central. A ocorrência de casos de LVA em humanos frequentemente é precedida pela detecção de Lu. longipalpis e casos caninos. Nyssomyia neivai, bastante frequente em áreas endêmicas para LTA no vale do Rio Mogi Guaçu, mostrou-se competente para adquirir, manter e transmitir o parasito em condições laboratoriais, cumprindo assim mais uma etapa necessária para a sua incriminação como espécie-vetora. Ainda no vale do rio Mogi Guaçu, a comunidade de flebotomíneos mostrou-se bastante diversa, com 17 espécies, das quais cinco são importantes para o ciclo da LTA. A fauna flebotomínica encontrada era composta majoritariamente por Nyssomyia whitmani, Migonemyia migonei e Expapillata firmatoi e, mais uma vez, abrigos para animais, tais como galinheiros, foi o local preferido para estes insetos, onde a sua maioria foi capturada. Desta forma, este trabalho apresenta dados relevantes para o conhecimento a respeito desses insetos vetores, que podem ser usados como base para futuros projetos ou no desenvolvimento de novas estratégias de controle dessas doenças / Abstract: Phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae) are insects of medical and veterinary importance because they take part in the cicle of diseases, such as leishmaniasis which affect thousands of people around the world. Learning about these dipteras¿s ecology and biology is fundamentaly important to define the vectorial capacity and competence of their populations, and therefore, relevant for the public health perspective. This study aimed at adressing some issues with deficiente information on the biology and ecology of vector species of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi and Leishmania (Viannia) braziliensis, respectively, Lutzomyia longipalpis and Nyssomyia neivai, in São Paulo State. For the American visceral leishmaniasis (AVL), this paper tried to answer questions on the preferencial breeding site of Lu. longipalpis and its geographical expantion in São Paulo State. In relation to the knowledge of the ecoepidemiology of American cutaneous leishmaniasis (ACL), the vectorial competence of Nyssomyia neivai to L. (V.) braziliensis and the analysis of the sandfly community in and endemic area in the Northeast of the state were studied. Lutzomyia longipalpis breeding sites were found predominantly in shaded environments with great amount of organic matter, and the greatest concentration of larvae associated to chicken sheds. Considering its dispersion, Lu. longipalpis seemed to follow a route from Mato Grosso do Sul to São Paulo city, in a west to east direction and from that central line, an expansion to the north and south. The occurance of human AVL is generally preceded by the detection of Lu. longipalpis and canine cases. Nyssomyia neivai, frequently found in endemic áreas for ACL in the Mogi Gauçu River Valley, was shown to be competente to aquire, host and transmit the parasite under laboratory conditions, thus fulfilling another requirement to be recognized as a vector species. Still in Mogi Guaçu River Valley, the sandfly community was greatly diverse, comprised of 17 species, of which five are considered important for the ACL cicle. The sandfly fauna was mainly comprised of Nyssomyia whitmani, Migonemyia migonei and Expapillata firmatoi and, once again, animal shelters, such as chicken sheds, were the preferred site for these insects, where the greatest amount was collected. Therefore, this work presents relevant data for the knowledge on these vector insects, which can be used as basis for future projects or in the development of new control strategies against these diseases / Doutorado / Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia / Doutora em Biologia Animal

Em algumas regiões, como nos municípios de Corumbá e Ladário, no Estado de Mato Grosso do Sul, existem evidências ecológicas e epidemiológicas de que Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) seja a principal responsável pela transmissão do protozoário Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908 (ou subespécie de L. (L.) infantum chagasi Cunha & Chagas, 1937 segundo alguns autores), agente etiológico da leishmaniose visceral (LV). A ausência de Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912), principal vetor do parasito, reforçam esta hipótese. Este estudo teve por objetivo avaliar os parâmetros e estimar a capacidade vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum e Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972. Para este último, apenas foram avaliados os parâmetros, sem a estimativa numérica da capacidade vetorial. A avaliação da capacidade vetorial foi realizada a partir de experimentos laboratoriais (infecção experimental) e de campo (atratividade aos flebotomíneos). Por intermédio da infecção experimental de Lu. cruzi pelo parasito, foi possível estimar a expectativa de sobrevida diária de fêmeas infectadas (estimativa vertical e laboratorial), avaliar o período de incubação extrínseco do parasita e obter duração do ciclo gonotrófico. Para a avaliação da competência vetorial do inseto, foram realizadas tentativas de transmissão experimental e natural de Leishmania, a partir de fêmeas provenientes de colônia cujos indivíduos foram alimentados durante o xenodiagnóstico e de fêmeas selvagens capturadas em campo, respectivamente. A distribuição sazonal de Lu. cruzi foi avaliada por meio da instalação semanal de armadilhas luminosas no peridomicílio de cinco residências na área urbana do Município de Corumbá. Variáveis meteorológicas obtidas junto ao Centro de Monitoramento do Tempo, do Clima e dos Recursos Hídricos de Mato Grosso do Sul, índices radiométricos calculado a partir de imagens de resolução espacial (GeoEye) e o percentual de cobertural vegetal foram utilizados neste estudo. Os resultados obtidos permitiram estimar a capacidade vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum, que foi de 0,24, ou seja, espera-se que a população de fêmeas da área produzam 0,24 novas infecções viii por dia de exposição de uma infecção. A competência vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum e L. (L.) amazonensis, via picada, foi demonstrada por meio de transmissão natural e experimental dos parasitos, respectivamente. Também foi identificada a infecção natural de Lu. cruzi por L. (L.) amazonensis. Com relação à distribuição mensal, embora não tenha sido observada a presença de associação entre essas espécies e as variáveis ambientais de vegetação e clima, foi possível observar picos elevados populacionais na estação chuvosa e picos menores na estação seca. O padrão da distribuição sazonal das espécies de flebotomíneos demonstrado neste estudo foi determinado basicamente pelos espécimes de Lu. cruzi capturados, uma vez que eles representam 93,94 por cento . A variação mensal demonstrou que a espécie Lu. cruzi tem grande plasticidade, tendo sido observada em todos os meses de coleta. / In some regions such as in the municipalities of Corumbá and Ladário in Mato Grosso do Sul state, there are ecological and epidemiological evidence that Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) is the vector of Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908 (or subspecies of L. (L.) infantum chagasi Cunha & Chagas, 1937 according to some authors), the etiologic agent of visceral leishmaniasis (VL). The absence of Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912), the main vector of the parasite, supports this hypothesis. This study aimed to evaluate the parameters and estimate the vectorial capacity of Lu. cruzi for L. (L.) infantum and Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972. For the latter, only parameters was evaluated without numerical estimation of the vectorial capacity. The evaluation of the vectorial capacity was carried out from laboratory experiments (experimental infection) and field (attractiveness to sandflies). Through experimental infection by the parasite, it was possible to estimate the expected daily survival of infected females (vertical and laboratory estimate), evaluate the extrinsic incubation period of the parasite and get the length of gonotrophic cycle. To evaluate the insect vector competence, attempts have been made of experimental and natural transmission of Leishmania from females from colony whose subjects were fed for xenodiagnosis and wild females captured in the field, respectively. Monthly and seasonal distribution of Lu. cruzi was evaluated by weekly installation of light traps in the peridomicile of five residences in the urban area of the Municipality of Corumbá. Meteorological variables obtained from the Weather Monitoring Center, Climate and Water of Mato Grosso do Sul Resources, radiometric indices calculated from spatial resolution images (GeoEye) and the percentage of plant cobertural were used in this study. Results allowed estimating the vectorial capacity of Lu. cruzi for L. (L.) infantum, which was 0.24, i.e., it is expected that the female population in the region produce 0.24 new infections per day of exposure to an infection. Vector competence of Lu. cruzi for L. (L.) infantum and L. (L.) amazonensis by biting, was demonstrated by natural and experimental transmission of both parasites, respectively. Natural infection of Lu. cruzi by L. (L.) amazonensis was identified. Regarding the monthly x distribution, there was no significant association between of sandflies and the environmental and climate variables. It was observed high peaks population in the rainy season and lower peaks in the dry season. The pattern of seasonal distribution of species of sand flies demonstrated in this study was determined primarily by Lu. cruzi specimens, since this species represent 93.94 per cent of the total captured. The monthly change showed that Lu. cruzi species has great plasticity and has been observed in all months of collection.

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.

Em algumas regiões, como nos municípios de Corumbá e Ladário, no Estado de Mato Grosso do Sul, existem evidências ecológicas e epidemiológicas de que Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) seja a principal responsável pela transmissão do protozoário Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908 (ou subespécie de L. (L.) infantum chagasi Cunha & Chagas, 1937 segundo alguns autores), agente etiológico da leishmaniose visceral (LV). A ausência de Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912), principal vetor do parasito, reforçam esta hipótese. Este estudo teve por objetivo avaliar os parâmetros e estimar a capacidade vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum e Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972. Para este último, apenas foram avaliados os parâmetros, sem a estimativa numérica da capacidade vetorial. A avaliação da capacidade vetorial foi realizada a partir de experimentos laboratoriais (infecção experimental) e de campo (atratividade aos flebotomíneos). Por intermédio da infecção experimental de Lu. cruzi pelo parasito, foi possível estimar a expectativa de sobrevida diária de fêmeas infectadas (estimativa vertical e laboratorial), avaliar o período de incubação extrínseco do parasita e obter duração do ciclo gonotrófico. Para a avaliação da competência vetorial do inseto, foram realizadas tentativas de transmissão experimental e natural de Leishmania, a partir de fêmeas provenientes de colônia cujos indivíduos foram alimentados durante o xenodiagnóstico e de fêmeas selvagens capturadas em campo, respectivamente. A distribuição sazonal de Lu. cruzi foi avaliada por meio da instalação semanal de armadilhas luminosas no peridomicílio de cinco residências na área urbana do Município de Corumbá. Variáveis meteorológicas obtidas junto ao Centro de Monitoramento do Tempo, do Clima e dos Recursos Hídricos de Mato Grosso do Sul, índices radiométricos calculado a partir de imagens de resolução espacial (GeoEye) e o percentual de cobertural vegetal foram utilizados neste estudo. Os resultados obtidos permitiram estimar a capacidade vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum, que foi de 0,24, ou seja, espera-se que a população de fêmeas da área produzam 0,24 novas infecções viii por dia de exposição de uma infecção. A competência vetorial de Lu. cruzi para L. (L.) infantum e L. (L.) amazonensis, via picada, foi demonstrada por meio de transmissão natural e experimental dos parasitos, respectivamente. Também foi identificada a infecção natural de Lu. cruzi por L. (L.) amazonensis. Com relação à distribuição mensal, embora não tenha sido observada a presença de associação entre essas espécies e as variáveis ambientais de vegetação e clima, foi possível observar picos elevados populacionais na estação chuvosa e picos menores na estação seca. O padrão da distribuição sazonal das espécies de flebotomíneos demonstrado neste estudo foi determinado basicamente pelos espécimes de Lu. cruzi capturados, uma vez que eles representam 93,94 por cento . A variação mensal demonstrou que a espécie Lu. cruzi tem grande plasticidade, tendo sido observada em todos os meses de coleta. / In some regions such as in the municipalities of Corumbá and Ladário in Mato Grosso do Sul state, there are ecological and epidemiological evidence that Lutzomyia (Lutzomyia) cruzi (Mangabeira, 1938) is the vector of Leishmania (Leishmania) infantum Nicolle, 1908 (or subspecies of L. (L.) infantum chagasi Cunha & Chagas, 1937 according to some authors), the etiologic agent of visceral leishmaniasis (VL). The absence of Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912), the main vector of the parasite, supports this hypothesis. This study aimed to evaluate the parameters and estimate the vectorial capacity of Lu. cruzi for L. (L.) infantum and Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw, 1972. For the latter, only parameters was evaluated without numerical estimation of the vectorial capacity. The evaluation of the vectorial capacity was carried out from laboratory experiments (experimental infection) and field (attractiveness to sandflies). Through experimental infection by the parasite, it was possible to estimate the expected daily survival of infected females (vertical and laboratory estimate), evaluate the extrinsic incubation period of the parasite and get the length of gonotrophic cycle. To evaluate the insect vector competence, attempts have been made of experimental and natural transmission of Leishmania from females from colony whose subjects were fed for xenodiagnosis and wild females captured in the field, respectively. Monthly and seasonal distribution of Lu. cruzi was evaluated by weekly installation of light traps in the peridomicile of five residences in the urban area of the Municipality of Corumbá. Meteorological variables obtained from the Weather Monitoring Center, Climate and Water of Mato Grosso do Sul Resources, radiometric indices calculated from spatial resolution images (GeoEye) and the percentage of plant cobertural were used in this study. Results allowed estimating the vectorial capacity of Lu. cruzi for L. (L.) infantum, which was 0.24, i.e., it is expected that the female population in the region produce 0.24 new infections per day of exposure to an infection. Vector competence of Lu. cruzi for L. (L.) infantum and L. (L.) amazonensis by biting, was demonstrated by natural and experimental transmission of both parasites, respectively. Natural infection of Lu. cruzi by L. (L.) amazonensis was identified. Regarding the monthly x distribution, there was no significant association between of sandflies and the environmental and climate variables. It was observed high peaks population in the rainy season and lower peaks in the dry season. The pattern of seasonal distribution of species of sand flies demonstrated in this study was determined primarily by Lu. cruzi specimens, since this species represent 93.94 per cent of the total captured. The monthly change showed that Lu. cruzi species has great plasticity and has been observed in all months of collection.

No início de 2010, uma nova riquetsiose foi descrita em um paciente humano, que foi infestado por carrapato em Barra do Una, no litoral sul do Estado de São Paulo. Técnicas moleculares indicaram que esta nova doença foi causada por uma nova cepa de riquétsia, que foi denominada de Rickettsia parkeri cepa Mata Atlântica. Estudos mais recentes demonstraram que 10 a 15% dos carrapatos Amblyomma ovale, coletados em áreas de Mata Atlântica nos estados de São Paulo (incluindo a área do caso índice da infecção humana em Barra do Una) e Santa Catarina estavam infectados com R. parkeri cepa Mata Atlântica. Desta forma, o presente estudo iniciou-se a partir de fêmeas ingurgitadas de A. ovale, coletadas de cães naturalmente infestados em Barra do Una. No laboratório, foi constatado por PCR que parte dessas fêmeas (6,25%) estavam naturalmente infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica; os ovos dessas fêmeas foram utilizados para formar uma colônia de A. ovale naturalmente infectada por R. parkeri. Ovos de fêmeas não infectadas, foram utilizados para formar uma colônia não infectada. As duas colônias foram estudadas de forma paralela no laboratório, visando analisar e quantificar a transmissão transestadial e transovariana de R. parkeri cepa Mata Atlântica e a competência vetorial do A. ovale. As infestações por larvas foram realizadas em roedores (Calomys callosus), enquanto ninfas e adultos foram alimentados em Oryctolagus cunicullus (coelho doméstico). Amostras de 10 indivíduos de cada uma das fases (larvas, ninfas e adultos F1, ovos, larvas e ninfas F2) foram testadas individualmente por um sistema de taqman real-time PCR, para presença de Rickettsia spp. Os soros sanguíneos de todos animais infestados foram testados por imunofluorescência indireta com antígeno de R. parkeri, no dia zero e 21 dias após a infestação por carrapatos, a fim de verificar soroconversão para antígenos de Rickettsia. Os resultados obtidos demonstraram 100% de transmissões transestadial (larva para ninfas e ninfas para adultos) e transovariana de R. parkeri em A. ovale, uma vez que todas as amostras de ovos, larvas, ninfas e adultos do grupo infectado foram positivas na PCR. Larvas e ninfas de A. ovale demonstraram alta competência vetorial, pois todos animais infestados por esses estágios infectados soroconverteram para R. parkeri. Por outro lado, adultos foram parcialmente competentes, pois apenas metade dos coelhos soroconverteu após ser infestada com carrapatos adultos infectados. Nenhum carrapato do grupo controle foi positivo na PCR, assim como nenhum animal deste grupo soroconverteu para R. parkeri. Fêmeas infectadas por R. parkeri cepa Mata Atlântica tiveram parâmetros reprodutivos inferiores aos das fêmeas não infectadas, indicando algum efeito deletério da infecção por este agente sobre os carrapatos. Os resultados sugerem a importância do carrapato A. ovale na epidemiologia desta nova riquetsiose brasileira, assim como sugerem uma capacidade vetorial de A. ovale para R. parkeri cepa Mata Atlântica, uma vez que este carrapato é frequentemente encontrado infestando humanos no bioma de Mata Atlântica. / In early 2010, a novel rickettsiosis was described in a human patient that had been infested by a tick in Barra do Una, southern coast of the state of São Paulo, Brazil. Molecular tests indicated that the disease was caused by a new rickettsial strain, named Rickettsia parkeri strain Atlantic rainforest. More recent studies demonstrated that 10 to 15% of Amblyomma ovale ticks, collected in Atlantic rainforest areas in the states of São Paulo (including the human index case area in Barra do Una) and Santa Catarina were infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest. Within this context, the present study started with A. ovale engorged females collected from naturally infested dogs in Barra do Una. In the laboratory, it was shown by PCR that part of these females (6.25%) were naturally infected with R. parkeri strain Atlantic rainforest; the eggs of these females were used to form a lab colony of A. ovale, naturally infected by R. parkeri. Eggs laid by uninfected females were used to form an uninfected tick colony. Both colonies were evaluated in parallel in the lab, aiming to verify and quantify the transstadial and transovarian transmissions of R. parkeri strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks, and the vector competence of the different parasitic stages of this tick. Larval infestations were done on rodents (Calomys callosus), while nymphal and adult infestations were done on rabbits (Oryctolagus cunicullus). Samples of 10 individuals of each tick stage (F1 larvae, nymphs and adults; F2, eggs, larvae, and nymphs) were tested individually by a taqman real-time PCR targeting the genus Rickettsia. Blood serum samples from all infested animals were tested through immunofluorescence assay employing R. parkeri antigens, on zero and 21 days post tick infestation, in order to verify seroconversion to rickettsial antigens. The results demonstrated 100% of transstadial (larvae to nynphs; nymphs to adults) and transovarian transmissions of R. parkeri in A. ovale ticks, since all egg, larval, nymphal, and adult samples from the infected colony were PCR-positive. A. ovale larvae and nymphs demonstrated high vector competence because all animals infested by these tick infected stages seroconverted to R. parkeri. On the other hand, adult ticks were partially competent since only half of the animals seroconverted after being infested by infected adult ticks. None tick of the uninfected control colony was PCR positive, as well as no animal from this group seroconverted to R. parkeri. Tick females infected by R. parkeri strain Atlantic rainforest had lower reproductive parameters than uninfected females, indicating some deleterious effect of the infection on these ticks. The results suggest an important role of A. ovale ticks in the epidemiology of this novel Brazilian rickettsiosis, and also suggest that A. ovale are capable to transmit R. parkeri strain Atlantic rainforest under natural conditions, since this tick is frequently found infesting humans on the Atlantic rainforest biome.

Introdução: A leishmaniose visceral (LV) é um importante problema de saúde pública no Brasil, com cerca 3000 mil casos notificados anualmente. Nos últimos anos, a LV tem ampliado sua distribuição em vários estados do país, associada principalmente aos processos socioambientais, antrópicos e migratórios. A LV é causada pela infecção com Leishmania infantum chagasi, transmitida, principalmente, por Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). Este flebotomíneo apresenta ampla distribuição nas Américas, todavia, evidências sugerem que se constitui em um complexo de espécies crípticas. A dinâmica de transmissão da LV é modulada por fatores ecológicos locais que influenciam a interação entre populações do patógeno, do vetor e dos hospedeiros vertebrados. Portanto, o estudo das variáveis associadas a esta interação pode contribuir para elucidar aspectos dos elos epidemiológicos e contribuir para a tomada de decisões em saúde pública. Objetivo: Avaliar parâmetros relacionados à capacidade vetorial da população de Lu. longipalpis presente em área urbana do município de Panorama, estado de São Paulo. Métodos: Foram realizadas capturas mensais durante 48 meses para avaliar a distribuição espaço-temporal de Lu. longipalpis e investigar a circulação de Le. i. chagasi. Também foram realizados os seguintes experimentos com o vetor: captura-marcação-soltura-recaptura para estimar a sobrevida da população e a duração do seu ciclo gonotrófico, a atratividade dos hospedeiros mais frequentes em áreas urbanas, a proporção de repasto em cão, infecção experimental e competência vetorial. Resultados: Observou-se que no município de Panorama, Lu. longipalpis apresentou as frequências mais elevadas na estação chuvosa (entre outubro e março), maior densidade em áreas com presença de vegetação e criação de animais domésticos, locais aonde também foi demonstrada a circulação natural de espécimes de Lu. longipalpis infectados com Le. i. chagasi. Além disto, foi corroborado que a população de Lu. longipalpis apresentou hábito hematofágico eclético, altas taxas de sobrevivência e que foi competente para transmitir o agente da LV. Nos experimentos de laboratório foi evidenciada a heterogeneidade na infecção de fêmeas de Lu. longipalpis desafiadas a se alimentarem em cães comprovadamente infectados por L. i. chagasi e o rápido desenvolvimento do parasita neste vetor natural. Conclusões. As observações do presente estudo corroboram a capacidade vetora de Lu. longipalpis para transmitir a Le. i. chagasi e ressaltam a importância da espécie na transmissão do agente etiológico da LV. Ações de manejo ambiental, educação e promoção à saúde são recomendadas às autoridades municipais para diminuir o risco potencial de infecção na população humana e canina, considerando-se o elevado potencial vetor de Lu. longipalpis e a presença de condições que favorecem a interação dos componentes da tríade epidemiológica da LV. / Introduction: Visceral leishmaniasis (VL) is an important public health problem in Brazil, where annually about 3000 cases are notified. In the later years VL has spread through some states, associated mainly to environmental, anthropic and migratory process. Visceral leishmaniasis is caused by the infection with Leishmania infantum chagasi transmitted by the sand fly species Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae). This species have a broad distribution in the Americas, however, there are evidences suggesting that it constitutes a cryptic species complex. The VL transmission dynamic is modulated by focal ecological factors that influence the pathogen-vector-host interactions. Thus, the analyses of variables associated to this interaction could contributes to elucidate the epidemiological links and to the public health decision-making. Objective: To evaluate parameters related to the vectorial capacity of Lutzomyia longipalpis in the Panorama municipality, São Paulo state, Brazil. Methods: Monthly captures of sand flies were undertaken during 48 months to evaluate the spatial and temporal distribution of Lu. longipalpis and its natural infection with Le. i. chagasi. Experiments of capture-mark-release-recapture to estimate the population survival, the gonotrophic cycle duration and the attractiveness of the most frequent host to Lu. longipalpis were also performed. Additionally experiments to evaluate the blood feeding rate of Lu. longipalpis on dog, experimental infection and the vectorial competence were undertaken. Results: In the Panorama municipality, Lu. longipalpis presents the highest frequencies during the rainy season (October - March) with high densities in areas with vegetation near to the domiciles and with the animal husbandry. In this areas was also demonstrated the circulation of sand flies naturally infected with Le. i. chagasi. Besides, it was corroborated that Lu. longipalpis presents eclectic haematophagic habit, high survival rates and it is competent to transmit Le. i. chagasi. It was also observed the heterogeneity of the female infection rates after them take the blood meal on infected dogs and a short time to complete the extrinsic incubation period. Conclusions: the observations of this study corroborate the vectorial capacity of Lu. longipalpis and reinforce the epidemiological importance of this species in the transmission of Le. i. chagasi. Considering the high vectorial efficiency of Lu. longipalpis and the presence of conditions favoring the interaction of the VL ecological components (competent vectors, infected hosts and susceptible humans), environmental management as well as educational and health promotion measures are recommended to the municipality authorities to reduce the potential risk of human infections.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 598225 bytes, checksum: b52ee586ca1555dc273c3952237b3272 (MD5) Previous issue date: 2005-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lutzomyia (Nyssomyia) whitmani s.l. (Antunes & Coutinho 1939) has a large distribution in Brazil, being registered in all geographic regions. In American continent this specie was found in French Guyana, Paraguay, Peru and Argentina. In Brazil it s incriminated as a vector of Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Viannia) shawi. Considering the large geographic distribution, the different aspects of biology and the possibility of Leishmania spp. transmission, the objective of the present study was to increase the knowledge about Lutzomyia (N.) whitmani s.l., an important vector of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) in Brazil, determining its geographic distribution in association with epidemiologic circuits of LTA, as well as to evaluate the vectorial competence, the genetic variability and the structure level of some L. (N.) whitmani s.l. Brazilian population. Two maps were created which enabled one to visualize the distribution of. L. (N.) whitmani s.l in the different Brazilian municipalities in association with the different types of vegetation and active transmission of ACL. L. (N.) whitmani s.l. was registered in 720 Brazilian municipalities, been verified in 26 federal units, hadn t been registered only, in state of Santa Catarina, inhabiting different kinds of vegetation and associated with different climates. The discussion about L. (N.) whitmani s.l. representing a species complex is based on aspects of its biology and vetorial competence, that reveal its capacity in transmit two distinct parasites and has different habits living in diversified habitats. The isoenzymatic analysis indicated that the L. (N.) whitmani s.l. populations of the study areas (Paragominas, Santarém, Londrina and Ilhéus) represent only one species with great chances of suffer subdivisions due to the course of evolution. We observed that the population of Paragominas municipality was detached from others by presenting the biggest genetic differentiation, which contributed for the formation of an isolated bunch in the grouping analysis. In an epidemiologic macro-territorial view, independent of being transmitting Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Viannia) shawi, L. (N.) whitmani s.l. can be suggested as the most important vector of American Cutaneous Leishmaniasis in Brazil. / Lutzomyia (Nyssomyia) whitmani s.l. (Antunes & Coutinho, 1939) possui uma ampla distribuição no território brasileiro, sendo registrada em todas as regiões geográficas e, no Continente Americano, a espécie foi assinalada na Guiana Francesa, no Paraguai, no Peru e na Argentina. No Brasil está incriminada como vetora de Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Viannia) shawi. Considerando a vasta distribuição geográfica, aspectos diferenciados da biologia e, a possível veiculação de duas leishmânias dermotrópicas, o objetivo do trabalho foi ampliar os conhecimentos sobre Lutzomyia (N.) whitmani s.l., importante transmissor de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Brasil, determinando a distribuição espacial deste flebotomíneo associada aos circuitos epidemiológicos de LTA, bem como avaliar a competência vetorial, a variabilidade e o grau de estruturação genética de algumas populações brasileiras. Foram elaborados dois mapas temáticos que, por sobreposição, permitiram visualizar o registro de L. (N.) whitmani s.l em municípios associados aos circuitos epidemiológicos da LTA e aos diferentes tipos de vegetação. L. (N.) whitmani s.l foi registrada em 720 municípios brasileiros, de vinte e seis unidades federadas, não tendo registro, apenas, em Santa Catarina, habitando diferentes tipos de vegetação e associados a variados climas. A discussão sobre L. (N.) whitmani s.l. representar um complexo de espécies está baseada em aspectos da sua biologia e da competência vetorial, que revelam sua capacidade em transmitir duas leishmânias distintas e ter hábitos diferenciados com a ocupação de diferentes ecótopos. Através da análise de isoenzimas, foi sugerido que as populações de L. (N.) whitmani s.l. das áreas estudadas (Paragominas, Santarém, Londrina e Ilhéus) representariam uma única espécie, com grandes chances de sofrer subdivisões em decorrência da evolução. Observou-se que a população do Município de Paragominas se destacou das demais por apresentar uma maior diferenciação genética, o que contribuiu para a formação de um ramo isolado na análise de agrupamentos. Numa visão epidemiológica macro-territorial, independente de estar transmitindo Leishmania (Viannia) braziliensis ou Leishmania (Viannia) shawi, sugere-se L. (N.) whitmani s.l. como o mais importante transmissor da Leishmnaiose Tegumentar Americana no Brasil.