Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora esteja bem estabelecido, há mais de quinze anos, que linfócitos T CD8+ restritos por moléculas de MHC-Ia são importantes no controle da parasitemia e sobrevivência de camundongos infectados com Trypanosoma cruzi, pouco se sabia da especificidade desses linfócitos. A ausência de epítopos bem definidos impedia o estudo detalhado da cinética da resposta imune e dos mecanismos de controle da imunodominância. Assim, o objetivo inicial desta tese foi a identificação de epítopos reconhecidos pelos linfócitos T CD8+ ativados durante a infecção pelo T. cruzi. Uma vez definidos esses epítopos, estudamos a cinética de ativação dessas células e alguns dos parâmetros que a controlavam. Por fim, estudamos os possíveis mecanismos de imunodominância durante a resposta imune. Durante a infecção experimental com a cepa Y de T. cruzi, nós observamos que os epítopos VNHRFTLV, IYNVGQVSI ou TEWETGQI foram reconhecidos por camundongos infectados C57BL/6, BALB/c ou B10.A, respectivamente. Esses epítopos, expressos por membros da família das trans-sialidases, geraram forte resposta imune medida pela citotoxicidade in vivo ou pela produção de IFN-γ ex vivo (Elispot). A cinética da ativação desses linfócitos T CD8+ se iniciou no pico da parasitemia e dependeu da carga parasitária. Ou seja, quanto mais tempo a parasitemia demorou para atingir o pico, mais lenta foi a aparição das células específicas. Uma vez que a resposta chegou ao máximo, essa se manteve alta por meses e só então começou a declinar lentamente. O fenótipo dos linfócitos T CD8+ específicos de memória é CD62Llow, característico de células de memória efetoras. Tanto a cinética, quanto o fenótipo dessas células diferiram dos achados observados para vírus, bactérias e outros protozoários intracelulares. Em animais previamente vacinados com DNA plasmidial ou proteínas recombinantes, uma significativa aceleração da resposta imune específica foi observada, a qual correlacionou com a imunidade protetora. A fim de estudarmos os fatores que contribuíram para ativação dessas células, nós utilizamos camundongos geneticamente deficientes. Observamos que a deficiência para a produção de IL-12 e Interferon tipo I não causou nenhuma redução na geração das células citotóxicas específicas. O mesmo foi observado em animais deficientes para os receptores do tipo Toll 2, 4 ou 9. Por outro lado, animais geneticamente deficientes que não expressavam as moléculas de MHC-II ou CD4 apresentaram significativa redução na resposta específica de linfócitos T citotóxicos. O estudo dos mecanismos que controlam a imundominância da resposta imune mediada por linfócitos T CD8+ específicos foi feito, inicialmente, pela comparação da resposta imune em camundongos C57BL/6. Observamos que a resposta imune para o epítopo VNHRFTLV foi imunodominante sobre os demais epítopos restritos pelo MHC-Ia H-2Kb . A fim de determinar se essa imunodominância poderia ser exercida sobre epítopos restritos por MHC-Ia H-2Kk (TEWETGQI) ou H- 2Kd (IYNVGQVSI), comparamos as respostas imunes em camundongos infectados homozigotos e heterozigotos. No caso do epítopo VNHRFTLV, nós observamos que a resposta imune se manteve alta em ambas as linhagens de camundongo. Já no caso dos dois outros epítopos restritos por MHC-Ia, H-2Kk ou H-2Kd , observamos uma significativa redução na resposta imune dos animais heterozigotos em relação aos homozigotos. Essa competição não foi dependente do tempo ou da dose de parasitas inoculados. Também não foi observada quando os animais foram imunizados com adenovírus recombinantes contendo esses mesmos epítopos. O mais importante foi observar que a imunodominância pode ser evitada quando duas cepas de parasitas, contendo epítopos imundominantes distintos, foram utilizadas simultaneamente para infecção, sugerindo que há uma competição pelas células apresentadoras de antígenos durante o “priming”. Esse mecanismo de imundominância reduz a magnitude e o repertório da resposta imune e pode ser um mecanismo sofisticado de escape do parasita para evitar a eliminação completa pelos mecanismos efetores do hospedeiro. / Although it is well established for more than 15 years that CD8+ lymphocytes restricted by MHC-Ia molecules are important for the control of the parasitemia and survival during rodent infection with Trypanosoma cruzi, little was known about the specificity of these lymphocytes. The lack of well defined epitopes hindered the detailed study of the kinetic of the immune response and the mechanisms of control of the immunodominance. Therefore, the initial objective of this thesis, was to identify epitopes recognized by CD8+ T lymphocytes activated during the T. cruzi infection. Once we defined these epitopes, we studied the kinetics of activation of these cells and some of the parameters that controlled it. Finally, it was possible to study the mechanisms of immunodominance during the immune response. During the experimental infection with Y strain of T. cruzi, we observed that the epitopes VNHRFTLV, IYNVGQVSI or TEWETGQI were recognized by C57BL/6, BALB/c or B10.A infected mice, respectively. These epitopes, expressed by members of the trans-sialidase family of surface proteins, generated strong immune response as measured by the in vivo cytotoxicity or by the production of interferon-γ (Elispot). The kinetics of the activation of these CD8+ T cells initiated on the peak of parasitemia and depended on the parasite load. The longer delayed the parasitemia to reach its peak, slower was the appearance of these specific T cells. When the immune response reached the maximum, it was kept high for months and then, it declined slowly. The phenotype of memory CD8+ T lymphocytes was CD62LLow characteristic of effector memory cells. The kinetic one and phenotype of these cells had differed from the findings observed for other intracellular viruses, bacteria and protozoan parasites. In animals previously vaccinated with plasmidial DNA or recombinant proteins, a significant acceleration of the specific immune response was observed that correlated with the protective immunity. To study the factors that contributed for the activation of these cells, we used genetically deficient mice. We observed that deficiency for production of IL-12 and Interferon type I did not cause any reduction in the specific cytotoxic response. The same was observed in animals deficient for the Toll-like receptors 2, 4 or 9. On the other hand, genetically deficient animals that did not express MHC-II or CD4 molecules had significant reduction in the cytotoxic response mediated by CD8+ T cells. Finally, we described that following infection of mice with T. cruzi, an immunodominant CD8+ T cell immune response was developed directed to the epitope VNHRFTLV. To determine whether this immunodominance was exerted over other non H-2Kb -restricted epitopes, we measured during infection of heterozygote mice, immune responses to three distinct epitopes, all expressed by members of the trans-sialidase family, recognized by H-2Kb , H-2Kk (TEWETGQI), or H-2Kd (IYNVGQVSI)- restricted CD8+ T cells. Infected heterozygote or homozygote mice displayed comparably strong immune responses to the H-2Kb -restricted immunodominant epitope. In contrast, H-2Kk or H-2Kd -restricted immune responses were significantly impaired in heterozygote infected mice when compared to homozygote ones. This interference was not dependent on the dose of parasite or the timing of infection. Also, it was not seen in heterozygote mice immunized with recombinant adenoviruses expressing T. cruzi antigens. Finally, we observed that the immunodominance was circumvented by concomitant infection with two T. cruzi strains containing distinct immunodominant epitopes, suggesting that the operating mechanism most likely involves competition of T cells for limiting APCs. This type of interference never described during infection with a human parasite may represent a sophisticated strategy to restrict priming of CD8+ T cells of distinct specificities, avoiding complete pathogen elimination by host effector cells, and thus favoring host parasitism. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As histonas de Trypanosoma cruzi sao bastante divergentes quando comparadas aos demais eucariotos, principalmente na porcao N-terminal, onde ocorrem modificacoes pos traducionais, que sao reconhecidamente essenciais para o controle da expressao genica e da arquitetura da cromatina. Entre estas modificacoes estao as acetilacoes das lisinas 4, 10 e 14 da histona H4 (H4K4ac, H4K10ac e H4K14ac). Nesta tese mostramos que a H4K4ac, que e a modificacao mais abundante, esta enriquecida em areas de cromatina densamente compactada, enquanto H4K10ac e H4K14ac localizam-se em regioes de cromatina menos densa, preferencialmente na interface entre a eucromatina e a heterocromatina. H4K4ac diminui nas formas nao replicativas e H4K14ac H4K14ac aumenta durante G2 e mitose do ciclo de divisao celular das formas replicativas. H4K10ac e H4K14ac aumentam e H4K4ac diminui no reparo de quebras de dupla fita do DNA. Ao mesmo tempo a superexpressao da proteina TcRad51, essencial para o processo de reparo de DNA por recombinacao homologa causa aumento de H4K10ac e H4K14ac. Quando as lisinas 4, 10 e 14 sao substituidas separadamente por argininas (H4K4R, H4K10R e H4K14R) para evitar a acetilacao sao expressas, elas sao incorporadas na cromatina e diminuem os niveis de cada modificacao. A expressao de H4K4R tem uma distribuicao diferente das histonas endogenas e H4K14R causa diminuicao de crescimento, com celulas acumulando na fase de mitose. Os mutantes de H4K10 e H4K14 ainda apresentam maior mortalidade quando submetidos a radiacao ƒ× que causa quebra de dupla fita de DNA. Tambem mostramos que a proteina TcBDF2, uma proteina que contem bromodomineo, reconhece preferencialmente H4K10ac. A funcao da TcBD2 e desconhecida, mas verificamos que ela aumenta apos exposicao dos parasitas a luz UV, sugerindo que esteja participando no reparo de DNA. Esses dados juntos fornecem evidencias de que cada uma das acetilacoes da histona H4 tem um papel distinto no T. cruzi. A acetilacao em K4 estaria envolvida na montagem da xiii cromatina na fase de replicacao. Ja as modificacoes em K10 e K14 estariam envolvidas com processos especificos de remodelagem da cromatina durante os eventos de reparo e eventualmente transcricao do DNA. / The Trypanosoma cruzi histones are very distinct from other eukaryotes, mainly in the N-terminus, where post translational modifications occur, which are essential for gene expression regulation and chromatin architecture. Among these modifications we found that lysines 4, 10 and 14 of H4 histone are acetylated (H4K4ac, and H4K10ac H4K14ac). In this thesis we show that the H4K4ac, which is the most abundant modification, is enriched in densely packed chromatin, while H4K10ac and H4K14ac are located in less dense chromatin, preferentially at the interface between euchromatin and heterochromatin. H4K4ac decreases in trypomastigote, which is the infective and non-dividing form of the parasite whileH4K14ac increases during G2 and mitosis of the cell cycle in replicative forms. H4K10ac and H4K14ac increases during DNA repair of double stranded breaks while H4K4ac decreases after DNA damage. TcRad51, an essential protein in the homologous recombination pathway, when overexpressed, increases the H4K10ac and H4K14ac levels. When the lysines 4, 10 and 14 are individually replaced by arginine (H4K4R, H4K10R and H4K14R) to prevent the acetylation, they are still incorporated into chromatin and decrease the specific modification level. The H4K4R location is different from the endogenous H4K4ac and the H4K14R expression causes growth reduction, with cells accumulating in mitosis. Mutants H4K10R and H4K14R also have high mortality rates after ƒ× irradiation that causes DNA double-stranded breaks. We also showed that TcBDF2 protein contains a bromodomain that recognizes preferentially H4K10ac. Although the TcBD2 function is unknown, it is increased after UV light exposure, suggesting its involvement in DNA repair. These data together provide evidence that each H4 acetylation has a distinct role in T. cruzi. Probably K4 is involved in chromatin assembly during replication while K10 and K14 acetylation appears to be involved in chromatin remodelling during DNA repair and maybe DNA transcription. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) / World Health Organization (WHO) / Howard Hughes Medical Institute / Proteinas de adesao celular sao essenciais para a invasao celular do hospedeiro mamifero pelo parasita Trypanosoma cruzi. Neste trabalho, nos mostramos que membros de gDispersed Gene Family-1 h, originalmente descrita como uma familia de sequencias nucleares repetitivas presente em varios cromossomos e compondo a terceira maior familia genica especifica deste parasita, contem caracteristicas de adesinas, incluindo quatro segmentos com similaridade significante a sequencia da subunidade ƒÀ7 de integrina humana. Ensaios de biotinilacao da superficie de parasitas e citometria de fluxo com anticorpos anti-DGF-1 indicaram que os membros dessa familia genica sao expressos na superficie das formas tripomastigotas. A genealogia de DGF-1, inferida por algoritmos de rede a partir de dados do Projeto Genoma da linhagem CL Brener de T. cruzi, sugere que essa familia genica pode ser dividida em pelo menos tres grupos com diferentes padroes de distribuicao de seus dominios funcionais. Analisando o perfil de uso dos codons, observou-se que as copias expressas apresentavam um uso preferencial de codons, favorecendo as bases GC, ao passo que copias nao-expressas, incluindo alguns pseudogenes, apresentavam uma distribuicao homogenea no uso de codons. A entropia informacional de Shannon foi utilizada como uma medida da variabilidade de sequencia e revelou que quatro segmentos de alta entropia coincidem com modulos funcionais putativos das proteinas preditas. Contradizendo a ideia de que alta variabilidade esta associada a selecao positiva, os resultados de dois testes distintos de selecao mostraram que posicoes altamente variaveis nao estao necessariamente sob selecao positiva. Nossa hipotese e de que membros de DGF-1 estao associados com a habilidade do T. cruzi se ligar a proteinas da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, e especulamos sobre os mecanismos que gerariam diversidade nessas moleculas na ausencia de selecao. / Surface adhesion proteins are essential for Trypanosoma cruzi invasion of mammalian cells. Here we show that Dispersed Gene Family-1 (DGF-1) members, previously identified as nuclear repeated sequences present in several chromosomes and comprising the third largest T. cruzi-specific gene family, have conserved adhesin motifs including four segments with significant similarity to human beta 7 integrin. Flow cytometry and biotinylation assays with anti-DGF-1 antibodies indicated that, as expected, DGF-1 members are expressed on the trypomastigote surface. The DGF-1 genealogy, inferred using T. cruzi Genome Project data and network phylogeny algorithms, suggests that this gene family is separated in at least three groups with differential distribution of functional domains. To identify which members of this gene family are expressed we used a combined approach of RT-PCR and codon usage profiles, showing that expressed members have a very biased codon usage favoring GC whereas non-expressed members have a homogeneous distribution. Shannon information entropy was used to measure sequence variability and revealed four major high entropy segments in the extracellular domain of DGF-1 overlapping with important putative functional modules of the predicted proteins. Testing for natural selection, however, indicated that these high entropy segments were not under positive selection, which contradicts the notion that positive selection is the cause of high variability in specific domains of a protein relative to other less variable regions in the same molecule. We hypothesize that members of the DGF-1 family are associated with the ability of T. cruzi to bind extracellular matrix proteins, such as fibronectin and laminin, and speculate on mechanisms that would be generating the localized diversity in these molecules in the absence of selection. / FAPESP: 03/05317-0 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328690.pdf: 5322895 bytes, checksum: c75d85937a50f1f8681ed05a0e4a837d (MD5) Previous issue date: 2014 / O Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado amplamente distribuído nas Américas onde ocorre em simpatria com o Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Apesar da ampla distribuição geográfica e da diversidade de hospedeiros invertebrados e mamíferos, incluindo seres humanos, as informações a respeito do ciclo biológico do T. rangeli nestes hospedeiros são ainda controversas. Ainda que o genoma do T. rangeli esteja em fase de publicação, são raras as abordagens proteômicas no estudo dos sistemas biológicos, permitindo o estudo de proteínas isoladas a partir da análise do proteoma total. Desta forma, a demanda por estudos de proteômica objetivando abordar o complexo e desconhecido ciclo de vida deste parasita nos levou a avaliar neste estudo o perfil de proteínas de T. rangeli durante o processo de diferenciação celular in vitro e selecionar algumas proteínas de interesse para uma análise molecular inicial. Extratos de proteínas solúveis foram obtidos durante o processo de diferenciação celular in vitro de formas epimastigotas a tripomastigotas. Três estratégias proteômicas foram utilizadas e um total de 1.455 proteínas não redundantes de T. rangeli foram identificadas, das quais quatro foram exclusivamente identificadas por eletroforese 2DE, 724 por eletroforese 1DE e 41 através uma abordagem sem o uso de gel. Entre essas proteínas, foram selecionadas 13 para dar continuidade ao estudo e, destas, quatro apresentaram regulação na expressão durante o período de diferenciação celular e podem se tornar marcadores importantes que irão auxiliar a entender a biologia de T. rangeli e os mecanismos moleculares durante o processo de diferenciação.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli is a hemoflagelate parasite occurring in sympatry with Trypanosoma cruzi, agent of Chagas disease, in a wide area in Central and South America. Despite this sympatric distribution and the diversity of invertebrate and mammalian hosts, including humans, information about the biological cycle of T. rangeli on these hosts is still scarce and controversial. The T. rangeli genome has been sequenced and is about to be published by our group but little proteomic data is so far available to address the complex and unknown life cycle this parasite. Thus, the aim of this study was to evaluate the protein profile of T. rangeli during the in vitro cellular differentiation and select some proteins of interest for an initial molecular analysis. Soluble protein extracts were obtained from parasites during the in vitro differentiation process of epimastigotes forms to trypomastigotes. Three proteomic approaches were used and a total of 1,455 non-redundant T. rangeli proteins were identified. Among these, four were identified exclusively by 2DE electrophoresis, 724 by 1DE gel based and 41 proteins via a gelfree approach. Several proteins revealing variation on their expression profiles were selected to continue this study, among which, four showed regulation of expression during cell differentiation and may become important stage-specific proteins that could help to understand T. rangeli biology and the molecular mechanisms during the differentiation process.

Made available in DSpace on 2014-07-22T17:04:57Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) fabiana_rocha_ioc_dout_2013.pdf: 5534664 bytes, checksum: fda4206174290f26b0c5f00482b1cee6 (MD5) fabiana_rocha_ioc_dout_2013.pdf.txt: 449204 bytes, checksum: e58375ea961a5ec377bb951472e5d404 (MD5) fabiana_rocha_ioc_dout_2013.pdf.jpg: 1782 bytes, checksum: 43f6857dc7ca4a92ae2c05acfe603257 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Diversos surtos epidêmicos causados por agentes patogênicos provocaram severo declínio em populações de carnívoros selvagens nas últimas décadas. Além desse impacto às populações silvestres, há a preocupação de transmissão de alguns desses agentes à população humana e animais domésticos. De fato, as alterações ambientais têm provocado mudanças na relação patógeno-hospedeiro. Desta forma, o monitoramento da saúde de animais silvestres é importante componente no estabelecimento de programas de controle e erradicação de doenças e na elaboração de políticas de saúde pública e animal e de manejo e conservação de espécies selvagens. Considerando o papel dos mamíferos da ordem Carnívora na cadeia trófica, estes podem ser usados como sentilas sendo alvos estratégicos em programas de vigilância para detecção de patógenos Neste artigo serão revisados estudos de caso dos principais patógenos que acometem mamíferos selvagens, com ênfase nas espécies da fauna brasileira. Os métodos laboratoriais utilizados nos estudos de exposição dos carnívoros brasileiros a patógenos serão discutidos e considerações sobre estratégias para minimizar seus impactos sobre a fauna silvestre, bem como os possíveis métodos para controle de patógenos causadores de zoonoses em carnívoros / Little is known on the Trypanosoma cruzi transmission in the different trophic levels of the food web and on the role played by Neotropical wild carnivores, the mammalian group target of this study, in the transmission cycles of this parasite. T. cruzi , the etiologic agent of Chagas disease, is a multihost parasite immersed in complex transmission networks that include hundreds of mammalian species and dozens of triatomines species, the insect vectors. The new epidemiological scenario, expressed by the growing number of human cases due to T. cruzi oral infection, demonstrate that numerous aspects of Chagas disease epidemiology still remain unclear. The primarly enzootic nature of this parasitosis emphasize the importance of looking at the sylvatic cycle to examine the role of the different mammalian species in the maintenance of the parasite in order to understand this new scenario. Therefore, we examined six mammalian orders, domestic dogs and feral pigs for T. cruzi infection and its distinct genotypes, through serologic, parasitological and molecular tests, during a seven-year follow-up in the Pantanal, Mato Grosso do Sul State, Brazil. We demonstrated that the reservoir system in the Pantanal includes host species that occupy all habitat types and forest strata, constituting a transmission network involving generalist and specialist mammalian species that are linked through a robust food-web connection. In this system, the coati ( Nasua nasua ) was considered the main T. cruzi reservoir, and demonstrated potential to act as a bioacumulator and disperser of all the T. cruzi genotypes detected in the region, TcI, TcII and TcIII/IV. The extension of our studies to the Serra da Canastra National Park (SCNP) - Minas Gerais State, and to the Araguari/Cumari regions (Minas Gerais/Goias States) provided evidence that the participation of wild carnivores in the T. cruzi transmission cycles was not a punctual finding, given that the seven carnivore species examined in the three study sites were infected by T. cruzi. Infectivity potential (expressed by positive hemoculture) was demonstrated in a felid from the SCNP, the ocelot ( Leopardus pardalis ), and in two procyonid species from the Pantanal, the coati and the raccoon ( Procyon cancrivorus ). In the SCNP, domestic dogs demonstrated to be good sentinels for T. cruzi transmission areas and the distinct genotypes circulating in the region, TcI and TcII. Additionally, we provided a comprehensive analysis of infection patterns among distinct carnivore species, by assembling our data with T. cruzi infection on South America carnivores’ literature records. Twelve out of twenty-one Neotropical carnivores evaluated species were described to be infected by T. cruzi, besides other three species found infected in the present study: the ocelot, the puma ( Puma concolor ) and the maned wolf ( Chrysocyon brachyurus ). Each species demonstrated a different potential to maintain and disperse T. cruzi , according their ecological characteristics and peculiarities of the different study areas. Species diet was associated with T. cruzi infection rates: the higher the proportion of invertebrates in species diet, the greater T. cruzi infection rate. Musteloidea species consistently exhibit high parasitemias in different studies, which indicate their high infectivity potential. Mesocarnivores that feed on both invertebrates and mammals, including the coati, a host that can be bioaccumulator of T. cruzi genotypes, seem to take place at the top of T. cruzi transmission chain; therefore, they may have a huge impact on the transmission cycles of this parasite.

Endocytosis is a biological event well described in where macromolecules are cytofarynx complex and organelles found at the posterior region of the and contain lysosomal enzymes, such as cruzipain. produce polyclonal or monoclonal antibodies (mAbs) against proteins identified in proteomic analyzes of reservosomes (cruzipain and Tc to label organelles of the endocytic pathway and amastigotes. Recombinant proteins were expressed in into Balb/c mice. Reactivity of the anti extracts of T. cruzi and recombinant protein antibodies anti-TcHIP showed this protein in the Golgi apparatus confirmed by co-localization with GFP recombinant cruzipain recognized the epimastigotes. For production of mAbs, splenocytes with recombinant cruzipain were fused with the P3X63Ag8.653 myeloma cell line (ATCC CRL-1580). Hybridomas were immunofluorescence. The most stable hybridoma was selected for limiting dilution and one clone against recombinant cruzipain (mAb CZP reservosomes. This antibody co-localization of uptaken transferrin with cruzipain. It was also possible to demonstrate for the first time by flow cytometry of Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi ingested via the flagellar pocket and/or then targeted to reservosomes. Reservosomes are cell body that store ingested molec Aim of this dissertation TcHIP), and use the to study endocytosis in E. coli, purified and inoculated eactivity anti-sera was confirmed by western blot proteins. Immuno-localization using polyclonal of T. cruzi GFP-TcRab7. Polyclonal antibodies against protein in the Golgi and reservosomes of obtained from a mouse immunized then screened by ELISA, western blot and CZP-315.D9) was obtained, specific was then used as a tool to investigate in amastigotes the the endocytic activity in T. cruzi amastigotes. / Approved for entry into archive by Renata Fontoura (comunicaicc@fiocruz.br) on 2014-12-04T12:19:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Cassiano Martin Batista (1).pdf: 5056433 bytes, checksum: 4df99de041c7ead17fee43aacb621dc6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-04T12:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Cassiano Martin Batista (1).pdf: 5056433 bytes, checksum: 4df99de041c7ead17fee43aacb621dc6 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo cruz, Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / A endocitose é um evento biológico já bem descrito em formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi, onde macromoléculas são internalizadas através da bolsa flagelar e/ou do complexo citóstoma/citofaringe e direcionadas aos reservossomos. Reservossomos são grandes organel estocam moléculas ingeridas e cruzipaína. O objetivo desta dissertação foi produzir anticorpos policlonais ou monoclonais (mAbs) contra proteínas identificada (cruzipaína e TcHIP), e utilizá estudos de endocitose em formas amastigotas de foram expressas em E. coli reatividade dos anti-soros foi confirmada por cruzi e contra proteína recombinante. Imunolocalização utilizando anticorpos policlonais anti-TcHIP mostrou que esta proteína está presente no complexo de Golgi em T. cruzi, o que foi confirmado por co anticorpos policlonais obtidos contra cruzipaína recombinante demonstraram esta proteína no Golgi e em reserv mAbs, esplenócitos de um camundongo imunizado com cruzipaína recombinante foram fusionados com células de mieloma da linhagem P3X63Ag8.653 (ATCC CRL Os hibridomas foram triados p hibridoma mais estável foi cruzipaína recombinante (mAb CZP Este anticorpo foi utilizado como ferramenta pa transferrina ingerida com a cruzipaína em formas amastigotas. Foi também possível demonstrar pela primeira vez por citometria de fluxo a atividade endocítica em formas amastigotas de T. cruzi. Trypanosoma cruzi, organelas localizadas na região posterior do parasito que contém enzimas lisossomais, como por exemplo a identificadas na proteômica de reservossomos utilizá-las como marcadores de organelas da via endocítica e em T. cruzi. Proteínas recombinantes coli, purificadas e inoculadas em camundongos Balb/c. A western blot contra extrato total de, co-localização com TcRab7-GFP. Por outro lado, reservossomos de epimastigotas de T. cruzi. / Endocytosis is a biological event well described in where macromolecules are cytofarynx complex and organelles found at the posterior region of the and contain lysosomal enzymes, such as cruzipain. produce polyclonal or monoclonal antibodies (mAbs) against proteins identified in proteomic analyzes of reservosomes (cruzipain and Tc to label organelles of the endocytic pathway and amastigotes. Recombinant proteins were expressed in into Balb/c mice. Reactivity of the anti extracts of T. cruzi and recombinant protein antibodies anti-TcHIP showed this protein in the Golgi apparatus confirmed by co-localization with GFP recombinant cruzipain recognized the epimastigotes. For production of mAbs, splenocytes with recombinant cruzipain were fused with the P3X63Ag8.653 myeloma cell line (ATCC CRL-1580). Hybridomas were immunofluorescence. The most stable hybridoma was selected for limiting dilution and one clone against recombinant cruzipain (mAb CZP reservosomes. This antibody co-localization of uptaken transferrin with cruzipain. It was also possible to demonstrate for the first time by flow cytometry of Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi ingested via the flagellar pocket and/or then targeted to reservosomes. Reservosomes are cell body that store ingested molec Aim of this dissertation TcHIP), and use the to study endocytosis in E. coli, purified and inoculated eactivity anti-sera was confirmed by western blot proteins. Immuno-localization using polyclonal of T. cruzi GFP-TcRab7. Polyclonal antibodies against protein in the Golgi and reservosomes of obtained from a mouse immunized then screened by ELISA, western blot and CZP-315.D9) was obtained, specific was then used as a tool to investigate in amastigotes the the endocytic activity in T. cruzi amastigotes.

Made available in DSpace on 2016-02-16T12:33:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andreia_alves_ipec_mest_2012.pdf: 385542 bytes, checksum: ce8d36278d30a403b5de05ef719424ae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os testes sorológicos constituem um importante instrumento para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV), sendo os inquéritos sorológicos caninos uma das medidas recomendadas pelo Ministério da Saúde brasileiro, para o controle da doença humana. Trypanosoma caninum é um parasita recentemente descrito em cães domésticos em diferentes áreas de LV. Considerando a importância do cão no ciclo de transmissão de L. chagasi e a possibilidade desse novo parasita confundir o diagnóstico para leishmaniose, este estudo objetivou investigar o status sorológico de animais infectados por T. caninum e avaliar a reatividade cruzada com os testes sorológicos empregados na rotina de controle da LV no Brasil. Foram analisadas 117 amostras de soro de cães classificadas em 3 grupos: grupo Tc (animais infectados por T. caninum), grupo Lc (infectados por L. chagasi) e grupo Co (controles saudáveis) - com os kits disponibilizados para a rede pública - imunofluorescência indireta (IFI-LVC), ELISA (EIE-LVC) e teste imunocromatográfico (DPP) - e com testes in house empregando antígenos de T. caninum (IFI-Tc e ELISA-Tc) e de L. chagasi (IFILc e ELISA-Lc) Os cães infectados por T. caninum reagiram ao IFI-Tc e ELISA-Tc com sensibilidade de 64.1% e 94.9% e especificidade de 23.1% e 35.9%, respectivamente. Para os testes comerciais IFI-LVC, EIE-LVC e DPP, a sensibilidade foi de 100% e especificidade de 70.5%, 68% e 97.5% respectivamente. A especificidade destes testes tornou-se mais elevada quando o grupo Tc foi excluído das análises, com diferença significativa para IFI-LVC (x2=4.36, p=0.036) e não significativa para os demais testes (EIE-LVC - x2=2,87, p=0,089; DPP - x2=0,05, p=0,818). Concluímos que ferramentas sorológicas possam ter um valor limitado para o diagnóstico da infecção por T. caninum e que a presença de animais infectados por esse parasito em áreas endêmicas de LV possa ser um fator de confusão para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina / Serologic tests constitute an important tool for the diagnosis of visceral leishmaniasis (VL), being canine serol ogic inquiries one of the measures recommended by the Brazilian Health Minist ry, to control the human disease. Trypanosoma caninum is a parasite recently de scribed in domestic dogs in different endemic areas of LV. Consider ing the importance of the dog to the cycle of transmission of L. chagasi and the possibility of this new parasite to confuse the diagnosis for leishmaniasis, this study aimed to investigate the serological status of animals infected by T. caninum and to evaluate the cross- reactivity in serologic tests employed to t he routine control of the LV in Brazil. A set of 117 serum samples of dogs divi ded into 3 groups had been analyzed - Tc group (animals infected by T. caninum ), Lc group (animals infected by L. chagasi ) and Co group (healthy controls) - wit h kits available for the health public services - indirect imunofluoresc ence test (IFI-LVC), ELISA (EIE-LVC) and immunocromatographic test (DPP) - and with in house tests using T. caninum (IIF-Tc and ELISA-Tc) and L. chagasi (IIF-Lc and ELISA-Lc) antigens. Dogs infected by T. caninum had reacted to IIF-Tc and EL ISA-Tc with sensitivity of 64.1% and 94.9%, and s pecificity of 23.1% and 35.9%, respectively. For commercial tests IFI-LVC, EIE-LVC and DPP, sensitivity were of 100% and specificity of 70.5%, 68% and 97,5% respectively. The specificity of these tests had become higher when the Tc group was excluded from the analysis, with significant difference for IFI-LVC (x 2 =4.36, p=0.036) and not significant for the others tests (EIE-LVC - x 2 =2,87, p=0,089; DPP - x 2 =0,05, p=0,818). We conclude that serologic tools can have a limited value for the diagnosis of the infection for T. caninum and that the presence of animals infected by this parasite in endemic areas of LV visceral canine can be a factor of confusion for the diagnosis of leishmaniasis.

Made available in DSpace on 2016-03-10T13:16:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jose_correa_ioc_dout_2007.pdf: 7604915 bytes, checksum: 254c899732de570995b8f8b6f7061ca5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Endocitose em células eucarióticas é o processo de internalização de macromoléculas por diferentes vias, com diversas proteínas associadas, através do brotamento de vesículas na membrana plasmática e endereçamento destas vesículas a compartimentos endosomais no citoplasma. Os tripanosomatídeos são protozoários flagelados patogênicos de grande importância médica e veterinária que apresentam diferentes formas adaptativas ao longo de seu ciclo de vida. Estes parasitas estão estruturalmente organizados dentro de um arcabouço de microtúbulos subpeliculares, o que dificulta invaginações de membrana na maior parte do corpo celular. Entretanto, este arcabouço é descontinuado na região da bolsa flagelar, de onde o flagelo emerge do corpo. Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi apresentam além da bolsa flagelar uma segunda invaginação de membrana, o citóstoma/citofaringe, uma estrutura sustentada por microtúbulos especializados que participa ativamente no processo de endocitose. Esta tese teve por objetivo investigar as vias endocíticas presentes nos dois sítios competentes para a captação de nutrientes (bolsa flagelar e citóstoma) de epimastigotas de T. cruzi. Após incubação dos parasitas a 4oC ou 28oC com albumina, transferrina e LDL conjugadas a ouro coloidal e posterior processamento para microscopia eletrônica de transmissão (MET), foram observadas vesículas endocíticas revestidas brotando da bolsa flagelar. Análise do conteúdo protéico dos protozoários detectou a expressão de clatrina, confirmada por citometria de fluxo e análise in silico da base de dados genômicos do T. cruzi. Por microscopia confocal localizou-se a expressão de clatrina na bolsa flagelar dos parasitas... (...) Como transferrina foi visualizada em vesículas sem revestimento localizadas majoritariamente no citóstoma, frações de membrana detergente-resistentes foram purificadas por fracionamento celular e o conteúdo lipídico foi analizado por cromatografia, sendo também obtidas as concentrações de proteína e colesterol destas frações de membrana. \201CDot blots\201D das frações foram positivos para marcadores universais de jangadas de lipídios (flotilina-1 e toxina B do cólera). Por imunofluorescência co-localizou-se marcação de transferrina e de anticorpos anti-flotilina no citóstoma. Assim, propomos que a endocitose de transferrina ocorre principalmente pelo citóstoma através de um domínio de membrana detergente-resistente. Epimastigotas foram também pré-tratadas para impedir especificamente endocitose mediada por clatrina e a endocitose por cavéolas, usando-se drogas que interferem com o citoesqueleto celular, seguindo-se incubação com transferrina. Dados de MET e citometria de fluxo mostraram que a endocitose de transferrina ocorreu normalmente nas amostras onde o brotamento de vesículas revestidas com clatrina foi impedido, não sendo porém observada nas amostras onde a endocitose por cavéolas foi inibida. Análise da curva de crescimento de parasitas tratados demonstrou uma relação positiva entre interferência nos domínios de membrana detergente-resistentes e sobrevivência das células. Este conjunto de dados permitiu elaborar um modelo dos mecanismos de endocitose em epimastigotas de T. cruzi. / Endocytosis in eukaryotic cells is the in corporation process o f macromolecules, t hrough different pathways with different associated proteins, through vesicles budding at the plasma membrane and addressing of these vesicles to cytoplasmic endosomal compartments. Trypanosomatids are pathogenic flagellate protozoa of great medical and ve terinary importance that present different evolutive forms along their life cycle. These parasites are structurally organized inside a cage of subpelicular microtubules, what makes it difficult to form membrane invagination along most part of the cell body . However, this cage is missing at the flagellar pocket region, where the flagellum emerges from the cell. Epimastigote forms of Trypanosoma cruzi present besides the flagellar pocket a second membrane invagination, the cytostome/cytopharynx . This structur e is sustained by specialized microtubules that actively participate in the endocytic process. This thesis has investigated the endocytic pathways at the two competent sites for nutrient uptake (flagellar pocket and cytostome) of T. cruzi epimastigotes. Af ter parasites incubation at 28 o C with gold - conjugated albumin e , transferrin or LDL, followed by processing for transmission electron microscopy (TEM), it was possible to observe coated endocytic vesicles loaded with albumin, budding off from the flagellar pocket. Analysis of the proteic content of epimastigote forms detected the expression of clathrin, confirmed by flow cytometry and in silico analysis of the T. cruzi genomic database. Confocal microscopy allowed the visualization of the clathrin expression at the flagellar pocket. As transferrin was seen in uncoated vesicles located mainly in the cytostome, detergent - resistant membrane fractions were purified by cell fractioning and the lipidic contents was analyzed by chromatography, as well as the protein and cholesterol contents in the fractions. Dot blots of such membrane fractions were positive for lipid raft universal labels (flotillin - 1 and cholera B toxin). By immunofluorescence microscopy , transferrin and flotillin were co - localized at the cytostome . Thus we propose that endocytosis of transferrin occurs mainly through the cytostome via detergent - resistant membrane domains. Epimastigote forms were pre - treated to specifically hinder clathrin - mediated and caveolae - mediated endocytosis, by using drugs t hat impair these pathways and interfere with the cell cytoskeleton, followed by incubation with transferrin. Data from TEM and flow cytometry showed that the endocytosis of transferrin occurred normally in samples where budding of clathrin - coated vesicles was hindered, but it was not observed in samples where caveolae - mediated endocytosis was inhibited. Analysis of growth curves of treated parasites showed a relation between interference with detergent - resistant membrane domains and cell surviving. Our data allowed to elaborate a model depicting the endocytic mechanisms in Trypanosoma cruzi epimastigotes

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:20:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 valdirene_lima_ioc_dout_2014.pdf: 15571540 bytes, checksum: e4633794a1c6f64eec517dd443edba9d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Tripanossomíase por Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) é uma antiga zoonose amplamente distribuída do Sul dos Estados Unidos ao Sul da Argentina. O Brasil dispõe de seis biomas ecologicamente distintos: Amazônia, Cerrado, Caatinga, Pantanal, Mata Atlântica e Pampa. A transmissão silvestre do T. cruzi ocorre ao longo desses biomas, envolvendo uma ampla variabilidade de hospedeiros e vetores. T. cruzi é subdividido em sete unidades discretas de tipagem (Discrete Typing Unit - DTU), TcI a TcVI e uma recentemente reconhecida, TcBat. O conhecimento sobre o padrão de distribuição geográfica dessas DTUs ainda é incompleto. TcI é o mais disperso ao longo de toda área de distribuição do parasita inclusive os biomas brasileiros. Analisamos a diversidade de TcI, originado de cinco biomas, exceto do Pampa, com a abordagem MLMT (Multilocus Microsatellite Typing). Foram caracterizados 107 isolados de TcI originados de 29 espécies de mamíferos silvestres e vetores usando vinte e sete loci nucleares de microssatélites e dez loci mitocondriais. Nós comparamos esses dados com isolados TcI de toda a América. A diversidade genética foi alta entre os isolados desse estudo além de se evidenciar um novo clado que se destacou de toda diversidade genética conhecida de TcI nas Américas Detectamos introgressão mitocondrial ocorrendo através do intercâmbio genético entre a Amazônia e a Caatinga. Observamos similaridades genéticas entre isolados da Mata Atlântica com isolados de todos os outros biomas analisados. A fragmentação da diversidade genética das populações TcI da Mata Atlântica pode estar refletindo o padrão de fragmentação desse bioma. Sugerimos que a diversidade do T. cruzi I possa servir como uma sentinela da conservação de ecossistemas. A segunda DTU mais isolada no meio silvestre no Brasil é TcII. O padrão de distribuição de TcII e DTUs híbridas TcV e TcVI na natureza e sua diversidade genética são umas das numerosas lacunas no conhecimento do T. cruzi, incluindo a suposta ausência dessas DTUs na Amazônia. Neste estudo analisamos a diversidade genética de 60 isolados TcII pela análise de 19 loci microssatélites nucleares. Alto grau de diversidade foi verificado nesse painel de isolados TcII em pequenas áreas da Mata atlântica e Caatinga e entre hospedeiros geneticamente homogêneos como os Leontopithecus spp. Diferentes graus de estruturação populacional foram observados nestes locais. A complexidade de estruturação e diversidade sugere que esse genótipo é mais disperso do que indica sua prevalência nos isolamentos em meio de cultura em uma variedade maior de hospedeiros A pesquisa da enzootia por T. cruzi no estado do Pará levou ao encontro dos genótipos TcII e híbrido (V ou VI) circulando entre triatomíneos e cães, respectivamente. Este achado mostrou que o TcII é presente na Amazônia e portanto nos cinco principais biomas brasileiros ao contrário da clássica distribuição dessa DTU descrita na litertura. A presença de Tc híbrido na Amazônia, é mais intrigante devido a enorme extensão geográfica em que essas DTUs não são descritas no Brasil, e pode sugerir a existência de diferentes estratégias de infecção que estejam prevenindo seu isolamento e subestimando sua real prevalência na natureza / The Trypanosomiasis by Trypanosoma cruzi ( Kinetoplastida , Trypanosomatidae ) is an ancient zoonosis widely distributed in the southern United States to southern Argentina. Brazil has six ecologically distinct biomes: Amazon, Cerrado, Caatinga, Pantanal, Atlantic Forest and Pampa. The sylvatic transmission of T. cruzi occurs along these biomes, involving a wide variability of hosts and vectors. T. cruzi is divided into seven discrete typing units (DTU), TcI the TcVI and a recently recognized, TcBat. The knowledge about the geographic distribution pattern of these DTUs is still not complete. TcI is more dispersed throughout the distribution area of parasite including Brazilian biomes. We analyze the diversity of TcI, originated five biomes except the Pampa, with MLMT approach (Multilocus Microsatellite Typing ). 107 isolates were characterized TcI originated from 29 species of wild mammals and vectors using twenty-seven nuclear microsatellite loci and ten mitochondrial loci. We compare these data with TcI isolates across Americas. Genetic diversity was high among the isolates in this study in addition to evidence of a new clade that stood out from all known TcI genetic diversity in the Americas. We detected mitochondrial introgression occurring through genetic exchange between the Amazon and the Caatinga. Observed genetic similarities among isolates of the Atlantic Forest with isolates of all other biomes analyzed. The fragmentation of genetic diversity of TcI the Atlantic populations may reflect the fragmentation pattern of this biome. We suggest that the diversity of T. cruzi I can serve as a sentinel ecosystem conservation. The second most isolated DTU in the wild environment in Brazil is TCII. The distribution pattern of TCII and hybrid DTUs TCV and TcVI in nature and their genetic diversity are some of the many gaps in the knowledge of T. cruzi, including the supposed absence of these DTUs on Amazon. This study analyzed the genetic diversity of 60 isolates TCII by analysis of 19 nuclear microsatellite loci. High degree of diversity was found in this panel TCII isolates in small areas of the Atlantic Forest and Caatinga and among genetically homogeneous hosts as Leontopithecus spp. Different degrees of population structure were observed at these sites. The complexity and diversity of structure suggests that this genotype is more dispersed than indicating its prevalence in isolates in culture medium in a greater variety of research hospedeiros.A enzootic T. cruzi in the state of Pará led to the meeting of TCII genotypes and hybrid (V or VI ) circulating among triatomine bugs and dogs , respectively. This finding showed that TCII is present in the Amazon and therefore the five major Brazilian unlike the classical distribution described in this DTU litertura biome. The presence of Tc hybrid in the Amazon , is more intriguing because of the enormous geographic extent to which these DTUs are not described in Brazil , and may suggest the existence of different infection strategies that are preventing their isolation and underestimating their actual prevalence in nature. Alternative ways to investigate genotypes in biological samples can clear up on its distribution.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_gomes_ioc_mest_2014.pdf: 3321973 bytes, checksum: 59b3c4b51a637c1e44229ae143291433 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreas endêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e sua distribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestações clínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é uma enzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, que hidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado esta enzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papel importante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos os níveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados do parasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) e infectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Real foram realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequência de 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de 268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDH foram utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 e LL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que o clone CL-14, avirulento Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2\F0B11,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5\F0B15,6 e 16,3\F0B13,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°C a expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas / Chagas disease is a negl ected illness caused by the parasite protozoan Trypanosoma cruzi , which affects 6 - 8 million people in endemic areas of Latin America . The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regional distribution, have been suggested to cause di fferent clinical manifestations and therapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto - NTPDase is an apyrase located on the outer surface of T. cruzi plasma membrane - that hydrolyzes tri - and/or di - phosphate nucleotides . Previous studies related this enzyme to the infectivity and virulence of the parasite , and suggest an important role in the uptake of purines . In this study, we evaluate the mRNA levels for the e cto - NTPDase I by RT - PCR in distinct isolated parasites (Dm28c - T. cruzi I; Y - T. cruzi II; 3663 - T. cruzi III; 4167 - T. cruzi IV; LL014 - T.cruzi V ; CL - 14 - T. cruzi VI - avirulent ) , in non - infective forms (epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes) . The Real Time PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111b p seq uence in the TcNTPDase - 1 gene and, as endogenous controls, a 268bp sequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the Tc GAPDH gene were used. We observed that the epimastigotes of strain s Y, 3663, 4167 e LL014 expressed the same levels of the g ene of TcNTPDase - 1 that the CL - 14 clone, avirulent. On the other hand, the Dm28c clone expressed 7 . 2  1 . 5 times higher the gene of this enzyme that the C L - 14 clone. Surprisingly, w e observed that the trypomastigote and amastigote presented expression levels , respectively, 22 . 5  5 . 6 and 16 . 3  3 . 8 time s higher than the epimastigote form. Moreover, following the epimastigotes growth curve at 28°C e 37°C , we also observed that the expression of TcNTPDase - 1 increases with the days of growth, and this increase is mo re pronounced at 37°C , suggesting that heat shock and long - term cultivation could increase TcNTPDase - 1 gene expression . In conjunction, our results suggest the role of TcNTPDase - 1 on T. cruzi infectivity and adjustment to stress conditions s uch as nutrients starvation and heat shock. Due to its importance for T. cruzi , TcNTPD ase - 1 has the potential to be e valuated as a possible target for chemotherapy of Chagas Disease .