Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / La tuberculosis bovina, causada por la bacteria Mycobacterium bovis, es una de las enfermedades más importantes del ganado bovino en Chile y otros países, afectando la productividad y salud de estos animales. La vacuna contra la tuberculosis humana (BCG M. bovis) tiene ventajas para su uso en el ganado, para lo cual se debe evaluar su eficacia mediante una prueba diagnóstica capaz de discriminar animales infectados de aquellos que han sido vacunados (DIVA). En función de lo anterior, el Servicio Agrícola y Ganadero del Ministerio de Agricultura de Chile solicitó un estudio de evaluación de la aplicación de la vacuna BCG y el test DIVA para la prevención y diagnóstico de la infección por M. bovis en planteles bovinos de la zona central de Chile, del cual este estudio es parte. El propósito de este trabajo fue implementar y caracterizar un ensayo de ELISA-IFN-γ con antígenos ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c (DIVA) para el diagnóstico de la infección por M. bovis en Chile. Se determinó que los puntos de corte que permiten la mejor combinación de valores de especificidad (Es) y sensibilidad (Se), priorizando la Es, es de 0,06 DO para el pool de antígenos PC-EC (ESAT-6 y CFP-10) y, 0,02 DO en Rv3615c; obteniendo un rendimiento diagnóstico de 61% y 45% de Se y, 82% y 90% de Es, respectivamente. Mientras el rendimiento gl rendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento gl rendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento global de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio fue de 68% Se y un 79% Es. Adicionalmente, el área bajo la curva ROC de los antígenos fue de 0,735 ± 0,054 en PC-EC y un 0,731 ± 0,054 en Rv3615c. Al comparar la prueba DIVA con los ensayos Bovigam 2G, qPCR-Boviman, Stonebrink y Bactec MGIT 960, se evidenciaron diferencias significativas en todas las comparaciones, una concordancia baja en relación con Bovigam 2G e, insignificante con todas las demás pruebas. Sugiriendo que las pruebas comparadas se enfocan a distintos blancos de detección que predominan en distintas fases de la infección. Estos resultados muestran que la prueba DIVA desarrollada es eficaz pero no eficiente en el diagnóstico de la infección por M. bovis / Bovine tuberculosis, caused by the bacterium Mycobacterium bovis, is one of the most important diseases of cattle in Chile and other countries, affecting the productivity and health of these animals. The vaccine against human tuberculosis (BCG M. bovis) has advantages for use in livestock, for which its effectiveness must be evaluated by means of a diagnostic test able to discriminate infected animals from those that have been vaccinated (DIVA). Based on the above, the Agricultural and Livestock Service of the Ministry of Agriculture of Chile requested a study evaluating the application of the BCG vaccine and the DIVA test for the prevention and diagnosis of M. bovis infection in bovine farms in the central zone of Chile, of which this study is part. The purpose of this work was to implement and characterize an-ELISA-IFN-γ assay with antigens ESAT-6, CFP-10 and Rv3615c (DIVA) for the diagnosis of M. bovis infection in Chile. It was determined that the cut off that allow the best combination of specificity (Sp) and sensitivity (Se) values, prioritizing the Sp, is 0.06 OD for the PC-EC antigen pool and, 0.02 OD in Rv3615c; obtaining a diagnostic yield of 61% and 45% of Se and 82% and 90% of Sp, respectively. While the overall performance of the DIVA test in this study was 68% Se and 79% Sp. Additionally, the area under the ROC curve of the antigens was 0.735 ± 0.054 in PC-EC and 0.731 ± 0.054 in Rv3615c When comparing the DIVA test with the Bovigam 2G, qPCR-Boviman, Stonebrink and Bactec MGIT 960 assays, showed significant differences in all comparisons, a low agreement in relation to Bovigam 2G and, insignificant among all the others. Suggesting that the comparative tests focus on different detection targets that predominate in different phases of the infection These results show that the DIVA test developed is effective but not efficient in the diagnosis of M. bovis infection / Financiamiento: Servicio Agrícola Ganadero (SAG)

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La tuberculosis bovina (TBB) es una enfermedad crónica y zoonótica, producida por Mycobacterium bovis. El costo de la enfermedad se relaciona a la disminución en la productividad de los animales severamente infectados, al control de movimiento animal, pruebas de diagnóstico para la detección y eliminación de animales positivos para evitar la propagación del agente, los decomisos y el menor valor de la leche. Se considera como una enfermedad ocupacional, ya que las personas que tienen mayor riesgo de contagiarse con M. bovis son quienes pasan largos periodos en contacto cercano con el ganado. La TBB en Chile se encuentra presente, y para apoyar el plan para su control y erradicación, se está estudiando el uso de la vacuna con cepa BCG de M. bovis en el ganado bovino. Fue desarrollada por Calmette y Guérin, quienes informaron la inducción de protección en el ganado contra la exposición a la bacteria. Como esta vacuna corresponde a una cepa atenuada de M. bovis, el objetivo de este trabajo es evaluar la interferencia que tiene su aplicación, con el diagnóstico tradicional de la infección en planteles lecheros de la Región Metropolitana. Para ello, 56 vaquillas fueron vacunadas y 48 fueron inyectadas con NaCl 0,9% a modo de controles. A todas se les tomó muestra de sangre tres y seis meses después de la vacunación las que luego fueron estimuladas con distintos antígenos y se dejaron incubar. Una vez finalizado el tiempo de incubación, se cosecharon los plasmas y finalmente se procedió a realizar el ensayo diagnóstico, ELISA IFN-γ con antígenos DIVA añadidos. Los antígenos DIVA corresponden a antígenos que fueron eliminados de la cepa vacunal. Los resultados demostraron un aumento en la cantidad de individuos falsos positivos al diagnóstico tradicional de TBB en los primeros seis meses después de la vacunación. Esto quiere decir, que fueron positivos a la tuberculina bovina, pero negativos a la prueba DIVA (Detecting Infected among Vaccinated Animals), debido a la reacción con la vacuna. Se concluye que se hace necesario utilizar una prueba complementaria para el diagnóstico de la tuberculosis en el ganado, en este caso, la prueba DIVA, durante los primeros meses después de vacunar con la cepa M. bovis BCG / Bovine tuberculosis is a chronic and zoonotic disease, caused by Mycobacterium bovis. The cost of the disease is associated to the decrease in the productivity of severely infected animals, the restrictions for the animal movement, the diagnostic tests for the detection and elimination of positive animals to avoid the spread of the agent, confiscations and the lower price of milk. It is considered an occupational disease, since people who have the highest risk for M. bovis zoonotic infection are those who spend long time in close contact with livestock. Bovine tuberculosis in Chile is an endemic disease, and the plan for the control and eradication of the disease is being supported by the study of the vaccination with the M. bovis BCG strain in cattle. It was developed by Calmette and Guerin, who reported the induction of protection in cattle against exposure with M. bovis. As this vaccine corresponds to a strain of M. bovis, the objective of this work is to evaluate the interference that has its application, with the traditional diagnosis of infection in dairy farms from the Metropolitan Region. For this, 56 heifers were vaccinated and 48 were injected with NaCl 0,9%. Blood samples were taken at three and six months after the vaccination. Once at the lab, samples were stimulated with different antigens and, after an incubation period, plasmas were harvested and IFN-γ detected by carrying out an ELISA diagnostic assay.-- The results showed an increase in the number of false positive individuals to the traditional diagnosis of bovine tuberculosis in the first six months after vaccination. This means that they were positive to bovine tuberculin, but negative to the DIVA (Detecting Infected among Vaccinated Animals) test, due to the reaction with the vaccine. It is concluded that it is necessary to use a complementary test for the diagnosis of tuberculosis in cattle, in this case, the DIVA test, during the first months after vaccination with the M. bovis BCG strain / Convenio SAG-FAVET

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Mycobacterium bovis es el microorganismo zoonótico causante de la tuberculosis bovina, patología infectocontagiosa de distribución mundial responsable de graves problemas económicos y de salud en el sector ganadero. Debido a que varios estudios han establecido la utilidad de las secuencias de inserción IS6110 e IS1081 en la identificación y tipificación de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis, el objetivo de este estudio fue establecer protocolos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la amplificación de las secuencias IS6110 e IS1081 y determinar la existencia de diferencias en su capacidad de detectar Mycobacterium bovis en tejidos bovinos. El análisis estadístico de los resultados sugirió que no existen diferencias significativas entre los ensayos de PCR convencional basados en IS1081 e IS6110, lo que contrasta con lo señalado por otros autores, quienes postulan que IS1081 está presente en mayor número de copias en cepas de Mycobacterium bovis, y por tanto, su utilidad en el diagnóstico es mayor. Debido a que la concordancia de ambas pruebas fue baja, se requieren nuevos estudios destinados a determinar la aplicabilidad de ambas secuencias en conjunto, por ejemplo en una prueba de PCR múltiple, ya que este trabajo sugiere que son complementarias para el diagnóstico de tuberculosis bovina / Proyecto FIV 121014019102003

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Medicina Preventiva Animal. / Con el objetivo de implementar métodos que disminuyan los tiempos de respuesta diagnóstica y por ende proporcionen rapidez en la emisión del resultado de tuberculosis bovina, se evaluaron y compararon los resultados obtenidos por los métodos BACTEC MGIT 960, cultivo bacteriológico en medio Stonebrink (ST), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), e Histopatología. Todo el trabajo se realizó en el Laboratorio de Micobacterias del Subdepartamento Laboratorios y Estación Cuarentenaria Pecuaria del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG), siguiendo los protocolos establecidos por el laboratorio. Se utilizaron 100 muestras de tejido obtenidas de nódulos linfáticos y/u órganos con lesiones del tipo granulomatosas (LTG), provenientes de bovinos de plantas faenadoras o por inspección de seguimiento. Los resultados mostraron que el cultivo en el sistema BACTEC MGIT 960 puede disminuir el tiempo de detección de Mycobacterium bovis y favorecer la rapidez en la emisión del resultado en el diagnóstico de la Tuberculosis Bovina (TBB). En combinación las cuatro pruebas detectaron 89 muestras positivas y todas tuvieron concordancia positiva entre sí, que varió entre débil a moderada, según los índices de Kappa, con significancia estadística (p < 0,05). En cuanto a la eficiencia, cada método sobresalió por un parámetro diferente, siendo RT-PCR menos compleja y más rápida, los cultivos los más económicos comercialmente y de mayor certidumbre, aunque la Histopatología resultó con el mejor nivel de eficiencia combinado. Se propone implementar un esquema que incluya los cuatro métodos (histopatológico, molecular, un cultivo en medio sólido y un cultivo en medio líquido), que permita detectar el número máximo de resultados positivos, en el menor tiempo posible y con alta certidumbre. / In order to implement methods to shorten the time of growth and thus provide speed in issuing the results in the diagnosis of bovine tuberculosis were evaluated and compared the results obtained by the methods BACTEC MGIT 960, bacteriological culture amid Stonebrink (ST ), polymerase chain reaction in real time (RT-PCR), and histopathology. All work was performed in the Laboratory of mycobacteria at Subdepartment of Laboratories and Quarantine Station of the Agricultural and Livestock Service (SAG), following the protocols established by the Laboratory. 100 tissue samples obtained from bovine lymph nodes and / or organs with granulomatous lesions (LTG) were used. The results showed that cultivation in the MGIT 960 system can shorten the growth of Mycobacterium bovis and the time required for diagnosis of bovine tuberculosis. In combination, the four tests detected 89 positive samples and all had positive agreement among themselves, with significant (p<0,05) Kappa indexes which ranged from weak to middle values. Regarding efficiency, each method excelled some parameter, with RT-PCR being less complex and faster, bacteriological culture were the cheapest, although histopathology had the highest combined efficiency. These results support a diagnostic scheme that includes the four methods (histopathological, molecular, solid medium and a liquid medium) for achievement the maximum number of isolates, in the shortest time and with highest certainty.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La presente investigación tuvo como objetivo la estimación de las pérdidas económicas por tuberculosis bovina en predios lecheros infectados, para cuantificar y delimitar el impacto económico de esta enfermedad. En primera instancia, se formularon modelos de masas con variables técnicas y productivas propias de la Zona de Control y de la Zona de Erradicación con datos obtenidos de fuentes oficiales tales como el SAG, Tattersall, Consorcio Lechero, entre otras, los que se tabularon mediante el programa Microsoft Excel©. Luego con estos antecedentes se crearon los modelos económicos para estimar márgenes prediales, los que finalmente fueron sensibilizados. Los resultados en la Zona de Control mostraron una sostenida e importante disminución en los índices prediales (margen predial, margen por vaca rebaño, margen por vaca lactante y margen por litro de leche) al llevar a cabo el programa sanitario, por lo que económicamente no resulta sustentable para los productores realizar este manejo. En la Zona de Erradicación la situación se repite con la diferencia que los márgenes se ven recuperados desde el cuarto año, este dato evidencia porque los productores rehúsan llevar a cabo los planes de eliminación del programa de control y erradicación de Tuberculosis Bovina, liderado por el SAG. Las sensibilizaciones para ambas zonas, arrojaron que las variables +5% tasa de preñez acumulada, +5% producción láctea y +5% precio de leche fueron las más sensibles, es decir, son los parámetros que más afectados se ven a fluctuaciones. / The objective of this research is the estimation of economic losses in dairy farms caused by bovine tuberculosis, in order to quantify and define the economic impact of this disease. First, models of productive and economic parameters had to be made with specific date from the control and eradication zones, this statistics were organized in charts on Microsoft Excel. After this, economic models were created of each dairy farm to estimate an inner predial range, which where sensitized afterwards. The results obtained in the control zone showed an important decrease in the predial parameters after the sanitary plan was executed; therefore it is not economically sustainable for dairy farmers to perform this operation. Whilst, in the Eradication Zone the situation is the same, the difference resides in the recorver of the margins in the fourth year. Face to this fact, the reason why dairy producers decline to carry out the elimination of the bovine tuberculosis control and eradication program, can be determined. The estimated sensitization for both zones throw +5% cumulative pregnancy rate, +5% milk production and +5% milk price, which were the more susceptible variables, hence, those are the parameters most affected by fluctuations.

La tuberculosis bovina es una enfermedad causada por el agente Mycobacterium bovis, que es parte del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Bacterias del MTC infectan una gran variedad de mamíferos, incluyendo al hombre. Mejorar el diagnostico de esta enfermedad permite identificar brotes y formular acciones de control. El objetivo de este trabajo fue evaluar la sensibilidad y especificidad de dos métodos de extracción en diferentes tipos de preservación, analizando cuatro tipos de muestras de la misma lesión tuberculosa: impresiones de la lesión en FTA elute card Whatman ®, ii. Lesiones congeladas y iii. Lesiones almacenadas en borato de sodio durante 30 y 60 días. Para las muestras congeladas, impresiones en tarjetas FTA y preservadas en borato, fue realizada la extracción usando el protocolo descrito por BOOM et al., 1990. Además, para cada tipo de muestra se realizaron aislamientos en los medios de cultivo Stonebrink y Lowenstein-Jensen. Fue realizada la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los primers INS1-INS2 para identificar DNA de bacterias pertenecientes al MTC. Se encontró que las muestras congeladas tienen mejor sensibilidad, Fueron obtenidas colonias de Mycobacterium bovis de las tarjetas FTA. Estos resultados ayudan a mejorar el proceso de colecta y transporte de muestras del sistema de vigilancia en tuberculosis bovina / A tuberculose bovina é uma doença causada pelo agente Mycobacterium bovis, que é parte do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Bactérias do MTC infectam uma grande variedade de mamíferos, incluindo o homem. Melhorar o diagnóstico desta doença permite identificar surtos e formular ações de controle. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade e especificidade de dois métodos de extração em diferentes tipos de preservação, analisando quatro tipos de amostras da mesma lesão tuberculosa: impressões da lesão em FTA elute card Whatman ®, ii. lesões congeladas e iii. lesões armazenadas em borato de sódio durante 30 e 60 dias. Para as amostras congeladas, impressiones no papel FTA e preservadas em borato, foi realizada a extração usando o protocolo descrito por BOOM et al., 1990. Além disso, para cada tipo de amostra se realizaram isolamentos nos meios de cultura Stonebrink e Lowenstein-Jensen. Foi realizada a reação em cadeia da polimerasa (PCR) utilizando os primers INS1-INS2 para identificar DNA de bacterias pertencentes ao MTC. Encontrou-se que as amostras congeladas tem melhor sensibilidade, Foram obtidas colônias de Mycobacterium bovis dos papeis FTA. Estes resultados ajudam a melhorar o processo de colheita e transporte de amostras do sistema de vigilância em tuberculosis bovina.

La tuberculosis bovina es una enfermedad causada por el agente Mycobacterium bovis, que es parte del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Bacterias del MTC infectan una gran variedad de mamíferos, incluyendo al hombre. Mejorar el diagnostico de esta enfermedad permite identificar brotes y formular acciones de control. El objetivo de este trabajo fue evaluar la sensibilidad y especificidad de dos métodos de extracción en diferentes tipos de preservación, analizando cuatro tipos de muestras de la misma lesión tuberculosa: impresiones de la lesión en FTA elute card Whatman ®, ii. Lesiones congeladas y iii. Lesiones almacenadas en borato de sodio durante 30 y 60 días. Para las muestras congeladas, impresiones en tarjetas FTA y preservadas en borato, fue realizada la extracción usando el protocolo descrito por BOOM et al., 1990. Además, para cada tipo de muestra se realizaron aislamientos en los medios de cultivo Stonebrink y Lowenstein-Jensen. Fue realizada la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los primers INS1-INS2 para identificar DNA de bacterias pertenecientes al MTC. Se encontró que las muestras congeladas tienen mejor sensibilidad, Fueron obtenidas colonias de Mycobacterium bovis de las tarjetas FTA. Estos resultados ayudan a mejorar el proceso de colecta y transporte de muestras del sistema de vigilancia en tuberculosis bovina / A tuberculose bovina é uma doença causada pelo agente Mycobacterium bovis, que é parte do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Bactérias do MTC infectam uma grande variedade de mamíferos, incluindo o homem. Melhorar o diagnóstico desta doença permite identificar surtos e formular ações de controle. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade e especificidade de dois métodos de extração em diferentes tipos de preservação, analisando quatro tipos de amostras da mesma lesão tuberculosa: impressões da lesão em FTA elute card Whatman ®, ii. lesões congeladas e iii. lesões armazenadas em borato de sódio durante 30 e 60 dias. Para as amostras congeladas, impressiones no papel FTA e preservadas em borato, foi realizada a extração usando o protocolo descrito por BOOM et al., 1990. Além disso, para cada tipo de amostra se realizaram isolamentos nos meios de cultura Stonebrink e Lowenstein-Jensen. Foi realizada a reação em cadeia da polimerasa (PCR) utilizando os primers INS1-INS2 para identificar DNA de bacterias pertencentes ao MTC. Encontrou-se que as amostras congeladas tem melhor sensibilidade, Foram obtidas colônias de Mycobacterium bovis dos papeis FTA. Estes resultados ajudam a melhorar o processo de colheita e transporte de amostras do sistema de vigilância em tuberculosis bovina.