Resumo não disponível.

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Orientador: Lucia Helena Brito Baptistella / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-13T13:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_AntonioJoseLorenoGiunti_M.pdf: 5019027 bytes, checksum: 793b74a23edeff208e44d910299edd57 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O a-(-)-bisabolol e um sesquiterpeno abundante na natureza e pouco utilizado, como material de partida para rotas sintéticas. Neste trabalho, alguns métodos para a obtenção de anéis tetraidrofuranos (THF) 2,2,5 trissubstituídos a partir do a-(-)-bisabolol foram estudados, como aqueles utilizando de reações syn-oxidativas com o uso de PCC, e principalmente com o uso de AmCPB, MMPP, Oxone® e t-BuOOH/Cp2TiCl2. Este último sistema de reagentes levou a melhores resultados, onde o óxido de bisabolol B foi obtido com 74% de rendimento, 1:30h de reação e proporção trans/cis de 3:1. Pequenas transformações de grupos funcionais permitiram a preparação de análogos de fragmentos portando anéis THF 2,2,5 trissubstituídos da (+)-tuberina, do venustatriol e do 23-acetato de tirsiferol, compostos de origem terpenica que apresentam atividade citoestática e/ou citotóxica in vitro comprovadas. Apesar de aparentemente simples, algumas dessas tranformações do anel THF se mostraram surpreendentes, como uma acetilação da hidroxila terciária do óxido de bisabolol, que só foi bem sucedida utilizando anidrido acético puro e irradiação por microondas, ou ainda uma ozonólise de olefina trissubstituída cuja redução por NaBH4 levou a produção de um ceto-álcool. De posse dos análogos terpenicos, estudos foram iniciados para a obtenção de um análogo da (+)-tuberina. Para tal, a porção fenol amina da tuberina foi sintetizada à partir de produtos obtidos comercialmente. Foram feitas reações de benzoilação e uma desbenzoilação seletiva e alguns experimentos para o acoplamento entre as porções fenol amina e a parte terpência. No entanto, estes testes de acoplamento não levaram a bons resultados e exigem melhor investigação. Adicionalmente bons resultados de alguns testes sobre atividade antineoplásica in-vitro de intermediários derivados do a-(-)-bisabolol foram bem interessantes, indicando um promissor campo de pesquisa, pois epóxidos derivados do óxido de bisabolol B apresentaram alta seletividade às células de tumores renais da linhagem 786-0 / Abstract: The a-(-)-bisabolol is a widespread natural sesquiterpene not usually used as starting material on synthetic routes. In this work, some methods for the preparation of 2,2,5 trisubstituted tetrahydrofurans (THF) from a-(-)-bisabolol were studied, as the use of PCC for the syn-oxidatives additions and the use of MCPA, MMPP, Oxone® and t-BuOOH/Cp2TiCl2 for cycloetherification reactions. Better results were obtained with the last reagent system, that produced the bisabolol oxide B in 74% yield, reaction time of 1:30h and trans/cis relation of 3:1. Functional group modifications of the 2,2,5-trisubstituted tetrahydrofuran system lead to some analogues of the fragments of some in-vitro cytostatic or cytotoxic terpenic compounds, like (+)-tuberine, venustatriol and thyrsiferol 23-acetate. Some of these THF transformations showed themselves surprising, as the acetylation of the tertiary hydroxyl of bisabolol oxide B, which best result was reached using pure acetic anhydride and microwave radiation, or an interesting trisubstituted olefin ozonolysis followed by NaBH4 reduction , that leads to a keto-alcohol derivative. With the terpenic compounds in hands, studies were performed to obtain a (+)-tuberine analogue. The phenol amine of tuberine fragment was prepared from commercial compounds. Reactions of benzoilation and selective debenzoilations were performed and then some coupling reactions between the terpenic and phenol structures were tried. A better investigation of these coupling reactions is still necessary. Addicionally, in-vitro tests for antineoplasic activity of some intermediates obtained from a-(-)-bisabolol were performed, and interesting results were observed, showing a promising research field; epoxides derivate from bisabolol oxide B showed good selectivity against 786-0 renal cells carcinoma / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno clínico, com expressividade variável, caracterizado por hamartomas que podem ocorrer em diferentes órgãos. Tem herança autossômica dominante e é devido a mutações em um de dois genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2. Estes codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente, que se associam formando um complexo macromolecular que regula funções como proliferação, diferenciação, crescimento e migração celular. As lesões cerebrais podem ser muito graves em pacientes com TSC e caracterizam-se por nódulos subependimários (SEN), astrocitomas subependimários de células gigantes (SEGA), tuberosidades corticais e heterotopias neuronais, podendo relacionar-se clinicamente à epilepsia refratária à terapia medicamentosa, deficiência intelectual, desordens do comportamento e hidrocefalia. O potencial de crescimento de SEGA até os 21 anos de idade dos pacientes exige acompanhamento periódico por exame de imagem e condutas clínicas ou cirúrgicas, conforme indicação médica. As lesões subependimárias têm sido explicadas por déficits de controle da proliferação, crescimento e diferenciação de precursores neuro-gliais na zona subventricular telencefálica. Embora a capacidade da tuberina em inibir a proliferação celular pela repressão do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) esteja bem documentada, outros aspectos celulares do desenvolvimento de SEGA ainda não foram examinados. Assim, é importante estabelecer um sistema in vitro para o estudo de células da zona subventricular e testá-lo na análise das proteínas hamartina e tuberina. Neste sentido, o cultivo de neuroesferas em suspensão é muito apropriado. Neste estudo, buscamos relacionar a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina à capacidade proliferativa e de diferenciação das células de neuroesferas cultivadas in vitro a partir da dissociação da vesícula telencefálica de embriões de ratos normais. Analisamos a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina por imunofluorescência indireta em células entre a primeira e a quarta passagens das neuroesferas, sincronizadas nas fases G1 ou S do ciclo celular e após a reentrada no ciclo celular, através da incorporação de 5-bromo-2\'-desoxiuridina (BrdU) e imunofluorescência com anticorpo anti-BrdU. Em geral, células de neuroesferas apresentaram baixa colocalização entre hamartina e tuberina in vitro. A expressão da tuberina foi elevada em basicamente todas as células das esferas e fases do ciclo celular; ao contrário, a hamartina apresentou-se principalmente nas células da periferia das esferas. A colocalização entre hamartina e tuberina foi observada em células mais periféricas das esferas, sobretudo no citoplasma e, em G1, no núcleo celular. A proteína rheb, que conhecidamente interage diretamente com a tuberina, apresentou distribuição subcelular muito semelhante à desta. Ao carenciamento das células visando à parada do ciclo celular na transição G1/S, tuberina distribuiu-se ao núcleo celular em quase todas as células avaliadas e, de forma menos frequente, a hamartina também. À reentrada no ciclo celular pelo reacréscimo dos fatores de crescimento, avaliaram-se células com incorporação de BrdU ao seu núcleo celular, após 72 e 96 horas. Nestas, tuberina mostrou-se novamente no citoplasma de forma preponderante e hamartina manteve-se citoplasmática, em geral subjacente à membrana plasmática, em níveis mais baixos. Os grupos cujas células reciclaram por 72 ou 96 horas diferiram quanto ao aumento significativo da expressão da hamartina em células proliferativas no último. À diferenciação neuronal, aumentaram-se os níveis de expressão de hamartina observáveis à imunofluorescência indireta, tornando-se equivalentes àqueles da tuberina. Concluímos que as células de neuroesferas cultivadas em suspensão apresentam-se como um sistema apropriado ao estudo da distribuição das proteínas hamartina e tuberina e sua relação com o ciclo celular / The tuberous sclerosis complex (TSC) is a clinical disorder with variable expressivity, characterized by hamartomas that can occur in different organs. It has autosomal dominant inheritance and is due to mutations in one of two tumor suppressor genes, TSC1 or TSC2. These encode for the proteins hamartin and tuberin, respectively, which are associated in a macromolecular complex which functions as a regulator of cell proliferation, differentiation, growth and migration. TSC brain lesions may be severe and are characterized by subependymal nodules (SEN), subependymal giant cell astrocytomas (SEGA), neuronal heterotopias and cortical tubers, and may be clinically related to refractory epilepsy, intellectual disability, behavioral disorders and hydrocephaly. The growth potential of SEGA up to 21 years of age in TSC patients requires regular monitoring by imaging. Clinical and surgical interventions may be medically indicated. Subependymal lesions have been explained by deficient control of proliferation, growth and differentiation of neuro-glial progenitors from the telencephalic subventricular zone. While tuberin ability to inhibit cell proliferation by repressing the mammalian target of rapamycin (mTOR) has been well documented, other cell aspects of SEGA development have not been thoroughly examined. Therefore, it is important to establish conditions for an in vitro system to study the cells from the subventricular zone and to test its suitability for the study of the TSC proteins. In this regard, the neurosphere suspension culture is very appropriate. We evaluated the expression and subcellular distribution of hamartin and tuberin in relation to the proliferation and differentiation capability of neurosphere cells derived in vitro from the dissociation of the telencephalic vesicle of normal E14 rat embryos. These analyses were performed by indirect immunofluorescence in cells from first through fourth passages of neurospheres, synchronized in G1 or S phases of the cell cycle, and after reentry into the cell cycle by the addition of 5-brome-2\'-desoxyuridine (BrdU) and immunolabeling with anti-BrdU antibody. In general, neurosphere cells presented low colocalization between hamartin and tuberin in vitro. Tuberin expression was relatively high in basically all neurosphere cells and cell cycle phases, whereas hamartin distributed mainly to cells from the periphery of the spheres. In these cells, hamartin and tuberin colocalization was evident mostly in the cytoplasm and, in G1, also in the cell nucleus. Rheb, which is known to interact directly with tuberin, had subcellular distribution very similar to tuberin. Cell starvation indicating cell cycle arrest at G1/S redistributed tuberin to the cell nucleus in virtually all cells examined, what was accompanied by nuclear location of hamartin in a small subset of cells. When cells were allowed to reenter cell cycle by adding growth factors, we evaluated BrdU-labeled nuclei 72 and 96 hours later. In the two groups, tuberin was shown to move back to the cytoplasm as well as hamartin, which apparently maintained its lower expression levels distribution underneath the plasma membrane. Group of cells that recycled for 96 hours had significantly more expression of hamartin than those cells that cycled for only 72 hours. After neuronal differentiation, hamartin expression levels observed by immunofluorescence were similar to those of tuberin. We conclude that neurosphere cells cultured in suspension showed to be an appropriate cell system to study hamartin and tuberin distribution in respect to the cell cycle

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno clínico, com expressividade variável, caracterizado por hamartomas que podem ocorrer em diferentes órgãos. Tem herança autossômica dominante e é devido a mutações em um de dois genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2. Estes codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente, que se associam formando um complexo macromolecular que regula funções como proliferação, diferenciação, crescimento e migração celular. As lesões cerebrais podem ser muito graves em pacientes com TSC e caracterizam-se por nódulos subependimários (SEN), astrocitomas subependimários de células gigantes (SEGA), tuberosidades corticais e heterotopias neuronais, podendo relacionar-se clinicamente à epilepsia refratária à terapia medicamentosa, deficiência intelectual, desordens do comportamento e hidrocefalia. O potencial de crescimento de SEGA até os 21 anos de idade dos pacientes exige acompanhamento periódico por exame de imagem e condutas clínicas ou cirúrgicas, conforme indicação médica. As lesões subependimárias têm sido explicadas por déficits de controle da proliferação, crescimento e diferenciação de precursores neuro-gliais na zona subventricular telencefálica. Embora a capacidade da tuberina em inibir a proliferação celular pela repressão do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) esteja bem documentada, outros aspectos celulares do desenvolvimento de SEGA ainda não foram examinados. Assim, é importante estabelecer um sistema in vitro para o estudo de células da zona subventricular e testá-lo na análise das proteínas hamartina e tuberina. Neste sentido, o cultivo de neuroesferas em suspensão é muito apropriado. Neste estudo, buscamos relacionar a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina à capacidade proliferativa e de diferenciação das células de neuroesferas cultivadas in vitro a partir da dissociação da vesícula telencefálica de embriões de ratos normais. Analisamos a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina por imunofluorescência indireta em células entre a primeira e a quarta passagens das neuroesferas, sincronizadas nas fases G1 ou S do ciclo celular e após a reentrada no ciclo celular, através da incorporação de 5-bromo-2\'-desoxiuridina (BrdU) e imunofluorescência com anticorpo anti-BrdU. Em geral, células de neuroesferas apresentaram baixa colocalização entre hamartina e tuberina in vitro. A expressão da tuberina foi elevada em basicamente todas as células das esferas e fases do ciclo celular; ao contrário, a hamartina apresentou-se principalmente nas células da periferia das esferas. A colocalização entre hamartina e tuberina foi observada em células mais periféricas das esferas, sobretudo no citoplasma e, em G1, no núcleo celular. A proteína rheb, que conhecidamente interage diretamente com a tuberina, apresentou distribuição subcelular muito semelhante à desta. Ao carenciamento das células visando à parada do ciclo celular na transição G1/S, tuberina distribuiu-se ao núcleo celular em quase todas as células avaliadas e, de forma menos frequente, a hamartina também. À reentrada no ciclo celular pelo reacréscimo dos fatores de crescimento, avaliaram-se células com incorporação de BrdU ao seu núcleo celular, após 72 e 96 horas. Nestas, tuberina mostrou-se novamente no citoplasma de forma preponderante e hamartina manteve-se citoplasmática, em geral subjacente à membrana plasmática, em níveis mais baixos. Os grupos cujas células reciclaram por 72 ou 96 horas diferiram quanto ao aumento significativo da expressão da hamartina em células proliferativas no último. À diferenciação neuronal, aumentaram-se os níveis de expressão de hamartina observáveis à imunofluorescência indireta, tornando-se equivalentes àqueles da tuberina. Concluímos que as células de neuroesferas cultivadas em suspensão apresentam-se como um sistema apropriado ao estudo da distribuição das proteínas hamartina e tuberina e sua relação com o ciclo celular / The tuberous sclerosis complex (TSC) is a clinical disorder with variable expressivity, characterized by hamartomas that can occur in different organs. It has autosomal dominant inheritance and is due to mutations in one of two tumor suppressor genes, TSC1 or TSC2. These encode for the proteins hamartin and tuberin, respectively, which are associated in a macromolecular complex which functions as a regulator of cell proliferation, differentiation, growth and migration. TSC brain lesions may be severe and are characterized by subependymal nodules (SEN), subependymal giant cell astrocytomas (SEGA), neuronal heterotopias and cortical tubers, and may be clinically related to refractory epilepsy, intellectual disability, behavioral disorders and hydrocephaly. The growth potential of SEGA up to 21 years of age in TSC patients requires regular monitoring by imaging. Clinical and surgical interventions may be medically indicated. Subependymal lesions have been explained by deficient control of proliferation, growth and differentiation of neuro-glial progenitors from the telencephalic subventricular zone. While tuberin ability to inhibit cell proliferation by repressing the mammalian target of rapamycin (mTOR) has been well documented, other cell aspects of SEGA development have not been thoroughly examined. Therefore, it is important to establish conditions for an in vitro system to study the cells from the subventricular zone and to test its suitability for the study of the TSC proteins. In this regard, the neurosphere suspension culture is very appropriate. We evaluated the expression and subcellular distribution of hamartin and tuberin in relation to the proliferation and differentiation capability of neurosphere cells derived in vitro from the dissociation of the telencephalic vesicle of normal E14 rat embryos. These analyses were performed by indirect immunofluorescence in cells from first through fourth passages of neurospheres, synchronized in G1 or S phases of the cell cycle, and after reentry into the cell cycle by the addition of 5-brome-2\'-desoxyuridine (BrdU) and immunolabeling with anti-BrdU antibody. In general, neurosphere cells presented low colocalization between hamartin and tuberin in vitro. Tuberin expression was relatively high in basically all neurosphere cells and cell cycle phases, whereas hamartin distributed mainly to cells from the periphery of the spheres. In these cells, hamartin and tuberin colocalization was evident mostly in the cytoplasm and, in G1, also in the cell nucleus. Rheb, which is known to interact directly with tuberin, had subcellular distribution very similar to tuberin. Cell starvation indicating cell cycle arrest at G1/S redistributed tuberin to the cell nucleus in virtually all cells examined, what was accompanied by nuclear location of hamartin in a small subset of cells. When cells were allowed to reenter cell cycle by adding growth factors, we evaluated BrdU-labeled nuclei 72 and 96 hours later. In the two groups, tuberin was shown to move back to the cytoplasm as well as hamartin, which apparently maintained its lower expression levels distribution underneath the plasma membrane. Group of cells that recycled for 96 hours had significantly more expression of hamartin than those cells that cycled for only 72 hours. After neuronal differentiation, hamartin expression levels observed by immunofluorescence were similar to those of tuberin. We conclude that neurosphere cells cultured in suspension showed to be an appropriate cell system to study hamartin and tuberin distribution in respect to the cell cycle