Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem genetic disease that is caused by a germ line mutation in the genes TSC1 and TSC2. Patients with the disease tend to suffer from benign tumors of the brain, heart, kidneys, skin, and other organs that contain giant cells. Although mTORC1 inhibitors (rapamycin and rapalogs) are often used to treat TSC because of their efficacy in promoting tumor shrinkage, clinical studies in the past have shown that when treatment is taken away, the tumor size returns to its original state. The objective of this study was to identify compounds that selectively inhibit proliferation of TSC2-deficient cells. A high-throughput screen of about 4000 compounds was performed using a lysosomal inhibitor (chloroquine [CQ], 5 μM) and a “repurposing” library of compounds. Through some yet to be determined mechanism, the combination of ritanserin (a selective serotonin reuptake inhibitor [SSRI]) and chloroquine was found to synergize to selectively inhibit the cell viability of DJK MEFs and TSC2-/-KO cells (TFFs) starting at 48 hours after treatment. The effects of this combination treatment were confirmed in a second cell line (TFFs) exhibiting similar reduction in proliferation. Interestingly, treatment with CQ (5 μM) and ritanserin (20 μM) showed synergistic action (combination index [CI] = 0.6) against TSC2-deficient cells. This combination treatment induced apoptosis (41%) in TSC2-deficient cells but not in TSC2-expressing cells. These results suggest a novel treatment approach in tuberous sclerosis complex and provide an incentive for further investigation of the mechanisms contributing to the vulnerability of TSC2-deficient cells. Moreover, the use of an already Food and Drug Administration (FDA)-approved compound can lead to a more rapid pharmacologic approach for TSC patients.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(農学) / 乙第13182号 / 論農博第2861号 / 新制||農||1061(附属図書館) / 学位論文||H30||N5104(農学部図書室) / (主査)教授 阪井 康能, 教授 植田 和光, 教授 小川 順 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

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Tuberous sclerosis complex (TSC) is an autosomal dominant disorder caused by pathogenic variants in either TSC1 or TSC2 tumor suppressor genes. It affects more often the brain, skin, kidneys, heart, lungs, and retina. The protein products of both genes, TSC1 (hamartin) and TSC2 (tuberin), interact, assembling a complex that inhibits mTORC1. Cells with bi-allelic inactivation of either TSC1 or TSC2 genes present hyperactivation of mTORC1, which phosphorylates downstream targets, up-regulating cell proliferation and growth. Moreover, a functional role as heat-shock protein (HSP) co-chaperone has been assigned to TSC1 protein. The first aim of the thesis was to analyze the nature, distribution and functional effects of TSC1 and TSC2 DNA variants from 100 patients with definite clinical diagnosis of TSC. We analyzed leukocyte DNA of 115 TSC patients from three Brazilian tertiary referral hospitals. Pathogenic DNA variants were detected in 99 (86,09%) unrelated individuals; 17 (17,17%) in TSC1 and 82 (82,82%) in TSC2. Clear loss-of-function mutations were detected in 87 patients, of which frameshift (29.29%) and nonsense (29.29%) variants were the most common types. In- frame deletions, missense and putative splicing DNA variants with uncertain clinical significance (VUS) have been functionally assessed. Five variants significantly increased phosphorylation of the reporter residue S6K Thr 389 . Forty-one novel pathogenic DNA variants and 19 novel single nucleotide variants have been detected. Among the 11 individuals with no mutation identified, seven presented rare putative missense, splicing or in- frame deletion DNA VUS. To understand the regulatory relationship of TSC1/2 gene expression, we aimed to evaluate TSC1 and TSC2 mRNA and protein levels in human cell lines with bi-allelic inactivation of each gene. We employed high throughput transcriptome analysis (RNA-Seq) and Western blotting of HEK293T and other six HEK293T-derived cell lines that had the genomic sequence of the TSC1 and or TSC2 genes edited by the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-CAS9 system. In lack of either TSC1 or TSC2 protein, a significant reduction of the respective mRNA was observed, inferring no positive transcriptional feedback. Serum-deprived cell lines without TSC1 decreased TSC2 mRNA levels. Under these conditions, TSC1 mRNA levels were not negatively affected by the lack of TSC2. In one cell line with loss of TSC1 (1C2) TSC1/2 mRNA and TSC2 protein levels were consistently decreased independently on serum. RNA-Seq gene ontology analyses comparing 1C2 to HEK293T reference cell line disclosed down-regulation of translational pathways independently on serum; and up-regulation of protein folding and stability pathways upon serum withdrawal. Our data are consistent with the role of TSC1 as HSP co-chaperone, and suggest that TSC1 mRNA may be regulated at both transcriptional and decay levels / O complexo de esclerose tuberosa (TSC) é um distúrbio autossômico dominante causado por variantes patogênicas em um de dois genes supressores de tumor TSC1 ou TSC2. Afeta mais frequentemente o cérebro, a pele, os rins, o coração, os pulmões e a retina. Os produtos proteicos de ambos os genes, TSC1 (hamartina) e TSC2 (tuberina), interagem formando um complexo que inibe o mTORC1. As células com inactivação bi- alélica dos genes TSC1 ou TSC2 apresentam hiperactivação de mTORC1, que fosforila alvos a jusante, regulando positivamente a proliferação e o crescimento celular. Além disso, o papel funcional da co-chaperona da proteína de choque térmico (HSP) foi atribuído à proteína TSC1. O primeiro objetivo dessa tese foi analisar a natureza, distribuição e os efeitos funcionais das variantes de DNA de TSC1 e TSC2 de 100 pacientes com diagnóstico clínico definitivo de TSC. Analisamos o DNA de leucócitos de 115 pacientes com TSC de três hospitais brasileiros de referência. Variantes de DNA patogênico foram detectadas em 99 (86,09%) indivíduos não relacionados; 17 (17,17%) em TSC1 e 82 (82,82%) em TSC2. Mutações de perda de função foram detectadas em 87 pacientes, dos quais as variantes frameshift (29,29%) e nonsense (29,29%) foram os tipos mais comuns. Deleções in-frame, variantes missense e variantes de splicing com significância clínica incerta (VUS) foram avaliadas funcionalmente. Cinco variantes aumentaram significativamente a fosforilação do resíduo repórter S6K Thr 389 . Quarenta e uma novas variantes de DNA patogênico e 19 novas variantes de nucleotídeo único foram detectadas. Entre os 11 indivíduos sem mutação identificada, sete apresentaram variantes raras missense, splicing ou deleções in-frame do tipo VUS. Para entender a relação regulatória da expressão do gene TSC1/2, tivemos com segundo objetivo avaliar os níveis de mRNA e proteína de TSC1 e TSC2 em linhagens de células humanas com inativação bi-alélica de cada gene. Empregamos uma análise de transcriptoma de alto rendimento (RNA-Seq) e Western blotting de HEK293T e outras seis linhagens celulares derivadas de HEK293T que possuíam a sequência genomica dos genes TSC1 e/ou TSC2 editados por CRISPR- CAS9. Na falta da proteína TSC1 ou TSC2, foi observada uma redução significativa do respectivo mRNA, inferindo ausência de feedback transcricional positivo. Linhagens celulares privadas de soro TSC1 -/- diminuíram os níveis de mRNA de TSC2. Sob estas condições, os níveis de mRNA de TSC1 não foram afetados negativamente pela falta de TSC2. Numa linhagem celular com a perda de TSC1 (1C2), os RNAm de TSC1/2 e os níveis de proteína de TSC2 foram consistentemente diminuídos independentemente no soro. Análise de RNA-Seq comparando a linhagens celular de 1C2 com a referência HEK293T revelou uma regulação negativa de vias de tradução independentemente no soro; e supra-regulação das vias de enrolamento e estabilidade das proteínas após a retirada do soro. Nossos dados são consistentes com o papel do TSC1 como co-chaperona de HSP, e sugerem que o mRNA de TSC1 pode ser regulador nos níveis de transcrição

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é uma doença genética que pode afetar órgãos específicos de qualquer sistema do organismo humano. Em geral, as lesões surgem pela inativação bialélica de um dos genes supressores tumorais Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) ou 2 (TSC2). Por outro lado, nas regiões corticais e subcorticais do cérebro, as lesões decorrentes de falhas de migração neuronal e sua arborização podem ser explicadas pela haploinsuficiência de TSC1 ou TSC2. As lesões do córtex cerebral apresentam-se comumente com epilepsia refratária, a qual, por sua vez, pode se associar a deficiência intelectual e transtornos do comportamento. Estes quadros clínicos podem estar presentes em pacientes com TSC sem lesão anatômica detectável à ressonância nuclear magnética do crânio. As proteínas hamartina ou tuberina, conhecidas também como TSC1 e TSC2, são codificadas respectivamente pelos genes TSC1 e TSC2. Elas agem juntas em um complexo molecular citosólico que inativa a pequena GTPase Rheb, a qual tem ação ativadora da cinase alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), regulando diversos processos celulares, como proliferação, diferenciação, crescimento, migração e metabolismo. Com a hipótese de que a quantidade de TSC1 ou TSC2 no neurônio pode alterar suas funções de forma dependente do estado metabólico, tivemos, neste trabalho, o objetivo geral de caracterizar os padrões de expressão e atividade de TSC1 e TSC2 em dois modelos de neurodegeneração induzida no camundongo adulto e verificar se a redução de quantidade de TSC1 tem efeito sobre a extensão da lesão de neurônios dopaminérgicos em modelo de hemiparkinsonismo. No primeiro modelo empregado, cinco estruturas encefálicas de camundongos submetidos a dieta hiperlipídica mostraram alteração da quantidade de RNAm de Tsc1 e/ou Tsc2 ou sinais de estresse oxidativo. A redução de transcritos de Tsc1 e Tsc2 no córtex cerebral foi dependente de jejum realizado imediatamente antes da eutanásia. No córtex cingulado, houve evidência de estresse oxidativo. O aumento específico de RNAm foi observado no hipocampo (Tsc1 e Tsc2) e no estriado e hipotálamo (Tsc1), embora de forma independente do jejum, sugerindo se tratar de alterações relacionadas à dieta hiperlipídica. No modelo de hemiparkinsonismo, camundongos adultos submetidos a injeção intracerebral de 6-hidroxidopamina apresentaram redução da quantidade total de proteína S6 no lado encefálico tratado quando comparado ao segmento contralateral (p =0,004, r=0,8795; teste de Pearson, IC: 95%), sem alteração de TSC1 ou TSC2. Em análises de imunoperoxidase do encéfalo, descrevemos, de forma independente da lesão, a expressão de TSC1 no estriado, núcleos entopeduncular e arqueado e de TSC2 no tálamo e hipotálamo. Com o objetivo de obter um modelo de camundongo sem expressão pós-natal de Tsc1 em várias regiões encefálicas, de forma independente do tipo celular, realizamos cruzamentos entre uma linhagem de camundongo transgênico em que o gene Tsc1 contém sequências lox nos íntrons 16 e 18 e outra linhagem com Tsc1 tipo-selvagem (WT) em homozigose e o transgene para expressão da recombinase Cre em fusão ao domínio de ligação ao ligante do receptor de estrógeno humano (ESR1) sob o controle de expressão do promotor de ubiquitina C (UBC). Em F1, obtivemos camundongos portadores do transgene UBC-CreESR1 e heterozigotos para Tsc1 (Tsc1WT/Flox). Em F2, entre os animais homozigotos Tsc1Flox/Flox (N = 153) gerados por retrocruzamento, nenhum era portador do transgene (Nesperado = 85; Nobservado = 0; X2 = 348,185; p < 0,0001) É possível que o segmento genômico em que houve inserção do vetor lentiviral que carrega o transgene UBC-CreESR1 esteja ligado ao loco de Tsc1 no cromossomo 2 do camundongo, segregando juntos. O tratamento com 4-hidroxitamoxifeno de animais heterozigotos e portadores do transgene aumentou a quantidade de TSC1 no estriado (p < 0,05) e o cerebelo não apresentou alteração. É possível que mecanismos transcricionais ou traducionais, funcionais no estriado, tenham favorecido o aumento de TSC1 de forma dependente de 4-hidroxitamoxifeno / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a genetic disorder that can affect any specific organs. In general, lesions are caused by biallelic inactivation of the tumor suppressor genes Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) or 2 (TSC2). On the other hand, in cortical and subcortical brain regions, lesions associated with neuronal migration and arborization failures can be explained by TSC1 or TSC2 haploinsufficiency. Brain cortical lesions commonly cause refractory epilepsy, which, in turn, may be associated with intellectual disabilities and behavioral disorders. These medical conditions may be present in TSC patients without detectable anatomic lesion on magnetic resonance images. TSC1 and TSC2 genes encode hamartin and tuberin, also known as TSC1 and TSC2, respectively. They act together in a cytosolic molecular complex that inactivates small GTPase Rheb, which is a mammalian target of rapamycin (mTOR) activator, regulating diverse cellular processes such as proliferation, differentiation, growth, migration and metabolism. With the hypothesis that the amount of TSC1 or TSC2 in the neuron can change its function depending on the metabolic state, the overall objective of this study was to characterize TSC1 and TSC2 expression patterns and activity in two mice models of induced neurodegeneration; and check whether TSC1 reduction changes dopaminergic neurons damage extent in a hemiparkinsonins model. For the first model, five brain structures from mice fed with high fat diet showed alterations in Tsc1 and/or Tsc2 mRNA, or oxidative stress signals. Reduction of Tsc1 and Tsc2 transcripts in the cerebral cortex was dependent on fasting performed immediately prior to euthanasiaThere was evidence of oxidative stress in the cingulate cortex. Increase in mRNA was observed in the hippocampus (Tsc1 and Tsc2) and striatum and hypothalamus (Tsc1), although independent of the fasting, suggesting that this effect is related to the high fat diet. In hemiparkinsonism model, adult mice subjected to intracerebral injection of 6-hydroxydopamine had decreased levels of S6 in the brain treated side compared to the contralateral segment (p = 0.004, r = 0.8795; Pearson test, CI: 95 %), without alterations in TSC1 nor TSC2. Using imunoperoxidase analysis, we described TSC1 expression in the striatum, entopeduncular and arcuate nuclei, and TSC2 in the thalamus and hypothalamus, independently from the 6-OHDA lesion. To obtain a mouse model without TSC1 postnatal expression in different brain regions, independently of the cell type, we performed crosses between transgenic mouse strain in which the Tsc1 gene contains lox sequences in introns 16 and 18 and strain with Tsc1 wild-type (WT) and the transgene for expression of Cre recombinase fused to the binding domain of the human estrogen receptor (ESR1) ligand, controlled by ubiquitin C (UBC) promoter expression. In F1, we obtained mice carrying the transgene UBC-CreESR1 and heterozygous for Tsc1 (Tsc1WT/flox). In F2, among animals homozygous Tsc1Flox/Flox (N=153) generated by backcrossing, none was carrying the transgene (Nexpected = 85; Nobserved = 0; X2= 348.185, p <0.0001) It is possible that the genomic segment containing the lentiviral vector insertion bearing UBC-CreESR1 transgene is linked to the TSC1 region on mouse chromosome 2, and they segregate together. Treatment with 4-hydroxytamoxifen in animals heterozygous and positive for the transgene showed increased TSC1 in the striatum (p <0.05), while there was no change in the cerebellum. It is possible that transcriptional or translational functional striatum mechanisms favored TSC1 increasing, in a 4-hydroxytamoxifen-dependent manner

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno clínico, com expressividade variável, caracterizado por hamartomas que podem ocorrer em diferentes órgãos. Tem herança autossômica dominante e é devido a mutações em um de dois genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2. Estes codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente, que se associam formando um complexo macromolecular que regula funções como proliferação, diferenciação, crescimento e migração celular. As lesões cerebrais podem ser muito graves em pacientes com TSC e caracterizam-se por nódulos subependimários (SEN), astrocitomas subependimários de células gigantes (SEGA), tuberosidades corticais e heterotopias neuronais, podendo relacionar-se clinicamente à epilepsia refratária à terapia medicamentosa, deficiência intelectual, desordens do comportamento e hidrocefalia. O potencial de crescimento de SEGA até os 21 anos de idade dos pacientes exige acompanhamento periódico por exame de imagem e condutas clínicas ou cirúrgicas, conforme indicação médica. As lesões subependimárias têm sido explicadas por déficits de controle da proliferação, crescimento e diferenciação de precursores neuro-gliais na zona subventricular telencefálica. Embora a capacidade da tuberina em inibir a proliferação celular pela repressão do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) esteja bem documentada, outros aspectos celulares do desenvolvimento de SEGA ainda não foram examinados. Assim, é importante estabelecer um sistema in vitro para o estudo de células da zona subventricular e testá-lo na análise das proteínas hamartina e tuberina. Neste sentido, o cultivo de neuroesferas em suspensão é muito apropriado. Neste estudo, buscamos relacionar a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina à capacidade proliferativa e de diferenciação das células de neuroesferas cultivadas in vitro a partir da dissociação da vesícula telencefálica de embriões de ratos normais. Analisamos a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina por imunofluorescência indireta em células entre a primeira e a quarta passagens das neuroesferas, sincronizadas nas fases G1 ou S do ciclo celular e após a reentrada no ciclo celular, através da incorporação de 5-bromo-2\'-desoxiuridina (BrdU) e imunofluorescência com anticorpo anti-BrdU. Em geral, células de neuroesferas apresentaram baixa colocalização entre hamartina e tuberina in vitro. A expressão da tuberina foi elevada em basicamente todas as células das esferas e fases do ciclo celular; ao contrário, a hamartina apresentou-se principalmente nas células da periferia das esferas. A colocalização entre hamartina e tuberina foi observada em células mais periféricas das esferas, sobretudo no citoplasma e, em G1, no núcleo celular. A proteína rheb, que conhecidamente interage diretamente com a tuberina, apresentou distribuição subcelular muito semelhante à desta. Ao carenciamento das células visando à parada do ciclo celular na transição G1/S, tuberina distribuiu-se ao núcleo celular em quase todas as células avaliadas e, de forma menos frequente, a hamartina também. À reentrada no ciclo celular pelo reacréscimo dos fatores de crescimento, avaliaram-se células com incorporação de BrdU ao seu núcleo celular, após 72 e 96 horas. Nestas, tuberina mostrou-se novamente no citoplasma de forma preponderante e hamartina manteve-se citoplasmática, em geral subjacente à membrana plasmática, em níveis mais baixos. Os grupos cujas células reciclaram por 72 ou 96 horas diferiram quanto ao aumento significativo da expressão da hamartina em células proliferativas no último. À diferenciação neuronal, aumentaram-se os níveis de expressão de hamartina observáveis à imunofluorescência indireta, tornando-se equivalentes àqueles da tuberina. Concluímos que as células de neuroesferas cultivadas em suspensão apresentam-se como um sistema apropriado ao estudo da distribuição das proteínas hamartina e tuberina e sua relação com o ciclo celular / The tuberous sclerosis complex (TSC) is a clinical disorder with variable expressivity, characterized by hamartomas that can occur in different organs. It has autosomal dominant inheritance and is due to mutations in one of two tumor suppressor genes, TSC1 or TSC2. These encode for the proteins hamartin and tuberin, respectively, which are associated in a macromolecular complex which functions as a regulator of cell proliferation, differentiation, growth and migration. TSC brain lesions may be severe and are characterized by subependymal nodules (SEN), subependymal giant cell astrocytomas (SEGA), neuronal heterotopias and cortical tubers, and may be clinically related to refractory epilepsy, intellectual disability, behavioral disorders and hydrocephaly. The growth potential of SEGA up to 21 years of age in TSC patients requires regular monitoring by imaging. Clinical and surgical interventions may be medically indicated. Subependymal lesions have been explained by deficient control of proliferation, growth and differentiation of neuro-glial progenitors from the telencephalic subventricular zone. While tuberin ability to inhibit cell proliferation by repressing the mammalian target of rapamycin (mTOR) has been well documented, other cell aspects of SEGA development have not been thoroughly examined. Therefore, it is important to establish conditions for an in vitro system to study the cells from the subventricular zone and to test its suitability for the study of the TSC proteins. In this regard, the neurosphere suspension culture is very appropriate. We evaluated the expression and subcellular distribution of hamartin and tuberin in relation to the proliferation and differentiation capability of neurosphere cells derived in vitro from the dissociation of the telencephalic vesicle of normal E14 rat embryos. These analyses were performed by indirect immunofluorescence in cells from first through fourth passages of neurospheres, synchronized in G1 or S phases of the cell cycle, and after reentry into the cell cycle by the addition of 5-brome-2\'-desoxyuridine (BrdU) and immunolabeling with anti-BrdU antibody. In general, neurosphere cells presented low colocalization between hamartin and tuberin in vitro. Tuberin expression was relatively high in basically all neurosphere cells and cell cycle phases, whereas hamartin distributed mainly to cells from the periphery of the spheres. In these cells, hamartin and tuberin colocalization was evident mostly in the cytoplasm and, in G1, also in the cell nucleus. Rheb, which is known to interact directly with tuberin, had subcellular distribution very similar to tuberin. Cell starvation indicating cell cycle arrest at G1/S redistributed tuberin to the cell nucleus in virtually all cells examined, what was accompanied by nuclear location of hamartin in a small subset of cells. When cells were allowed to reenter cell cycle by adding growth factors, we evaluated BrdU-labeled nuclei 72 and 96 hours later. In the two groups, tuberin was shown to move back to the cytoplasm as well as hamartin, which apparently maintained its lower expression levels distribution underneath the plasma membrane. Group of cells that recycled for 96 hours had significantly more expression of hamartin than those cells that cycled for only 72 hours. After neuronal differentiation, hamartin expression levels observed by immunofluorescence were similar to those of tuberin. We conclude that neurosphere cells cultured in suspension showed to be an appropriate cell system to study hamartin and tuberin distribution in respect to the cell cycle

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é uma doença genética que pode afetar órgãos específicos de qualquer sistema do organismo humano. Em geral, as lesões surgem pela inativação bialélica de um dos genes supressores tumorais Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) ou 2 (TSC2). Por outro lado, nas regiões corticais e subcorticais do cérebro, as lesões decorrentes de falhas de migração neuronal e sua arborização podem ser explicadas pela haploinsuficiência de TSC1 ou TSC2. As lesões do córtex cerebral apresentam-se comumente com epilepsia refratária, a qual, por sua vez, pode se associar a deficiência intelectual e transtornos do comportamento. Estes quadros clínicos podem estar presentes em pacientes com TSC sem lesão anatômica detectável à ressonância nuclear magnética do crânio. As proteínas hamartina ou tuberina, conhecidas também como TSC1 e TSC2, são codificadas respectivamente pelos genes TSC1 e TSC2. Elas agem juntas em um complexo molecular citosólico que inativa a pequena GTPase Rheb, a qual tem ação ativadora da cinase alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), regulando diversos processos celulares, como proliferação, diferenciação, crescimento, migração e metabolismo. Com a hipótese de que a quantidade de TSC1 ou TSC2 no neurônio pode alterar suas funções de forma dependente do estado metabólico, tivemos, neste trabalho, o objetivo geral de caracterizar os padrões de expressão e atividade de TSC1 e TSC2 em dois modelos de neurodegeneração induzida no camundongo adulto e verificar se a redução de quantidade de TSC1 tem efeito sobre a extensão da lesão de neurônios dopaminérgicos em modelo de hemiparkinsonismo. No primeiro modelo empregado, cinco estruturas encefálicas de camundongos submetidos a dieta hiperlipídica mostraram alteração da quantidade de RNAm de Tsc1 e/ou Tsc2 ou sinais de estresse oxidativo. A redução de transcritos de Tsc1 e Tsc2 no córtex cerebral foi dependente de jejum realizado imediatamente antes da eutanásia. No córtex cingulado, houve evidência de estresse oxidativo. O aumento específico de RNAm foi observado no hipocampo (Tsc1 e Tsc2) e no estriado e hipotálamo (Tsc1), embora de forma independente do jejum, sugerindo se tratar de alterações relacionadas à dieta hiperlipídica. No modelo de hemiparkinsonismo, camundongos adultos submetidos a injeção intracerebral de 6-hidroxidopamina apresentaram redução da quantidade total de proteína S6 no lado encefálico tratado quando comparado ao segmento contralateral (p =0,004, r=0,8795; teste de Pearson, IC: 95%), sem alteração de TSC1 ou TSC2. Em análises de imunoperoxidase do encéfalo, descrevemos, de forma independente da lesão, a expressão de TSC1 no estriado, núcleos entopeduncular e arqueado e de TSC2 no tálamo e hipotálamo. Com o objetivo de obter um modelo de camundongo sem expressão pós-natal de Tsc1 em várias regiões encefálicas, de forma independente do tipo celular, realizamos cruzamentos entre uma linhagem de camundongo transgênico em que o gene Tsc1 contém sequências lox nos íntrons 16 e 18 e outra linhagem com Tsc1 tipo-selvagem (WT) em homozigose e o transgene para expressão da recombinase Cre em fusão ao domínio de ligação ao ligante do receptor de estrógeno humano (ESR1) sob o controle de expressão do promotor de ubiquitina C (UBC). Em F1, obtivemos camundongos portadores do transgene UBC-CreESR1 e heterozigotos para Tsc1 (Tsc1WT/Flox). Em F2, entre os animais homozigotos Tsc1Flox/Flox (N = 153) gerados por retrocruzamento, nenhum era portador do transgene (Nesperado = 85; Nobservado = 0; X2 = 348,185; p < 0,0001) É possível que o segmento genômico em que houve inserção do vetor lentiviral que carrega o transgene UBC-CreESR1 esteja ligado ao loco de Tsc1 no cromossomo 2 do camundongo, segregando juntos. O tratamento com 4-hidroxitamoxifeno de animais heterozigotos e portadores do transgene aumentou a quantidade de TSC1 no estriado (p < 0,05) e o cerebelo não apresentou alteração. É possível que mecanismos transcricionais ou traducionais, funcionais no estriado, tenham favorecido o aumento de TSC1 de forma dependente de 4-hidroxitamoxifeno / Tuberous sclerosis complex (TSC) is a genetic disorder that can affect any specific organs. In general, lesions are caused by biallelic inactivation of the tumor suppressor genes Tuberous Sclerosis Complex 1 (TSC1) or 2 (TSC2). On the other hand, in cortical and subcortical brain regions, lesions associated with neuronal migration and arborization failures can be explained by TSC1 or TSC2 haploinsufficiency. Brain cortical lesions commonly cause refractory epilepsy, which, in turn, may be associated with intellectual disabilities and behavioral disorders. These medical conditions may be present in TSC patients without detectable anatomic lesion on magnetic resonance images. TSC1 and TSC2 genes encode hamartin and tuberin, also known as TSC1 and TSC2, respectively. They act together in a cytosolic molecular complex that inactivates small GTPase Rheb, which is a mammalian target of rapamycin (mTOR) activator, regulating diverse cellular processes such as proliferation, differentiation, growth, migration and metabolism. With the hypothesis that the amount of TSC1 or TSC2 in the neuron can change its function depending on the metabolic state, the overall objective of this study was to characterize TSC1 and TSC2 expression patterns and activity in two mice models of induced neurodegeneration; and check whether TSC1 reduction changes dopaminergic neurons damage extent in a hemiparkinsonins model. For the first model, five brain structures from mice fed with high fat diet showed alterations in Tsc1 and/or Tsc2 mRNA, or oxidative stress signals. Reduction of Tsc1 and Tsc2 transcripts in the cerebral cortex was dependent on fasting performed immediately prior to euthanasiaThere was evidence of oxidative stress in the cingulate cortex. Increase in mRNA was observed in the hippocampus (Tsc1 and Tsc2) and striatum and hypothalamus (Tsc1), although independent of the fasting, suggesting that this effect is related to the high fat diet. In hemiparkinsonism model, adult mice subjected to intracerebral injection of 6-hydroxydopamine had decreased levels of S6 in the brain treated side compared to the contralateral segment (p = 0.004, r = 0.8795; Pearson test, CI: 95 %), without alterations in TSC1 nor TSC2. Using imunoperoxidase analysis, we described TSC1 expression in the striatum, entopeduncular and arcuate nuclei, and TSC2 in the thalamus and hypothalamus, independently from the 6-OHDA lesion. To obtain a mouse model without TSC1 postnatal expression in different brain regions, independently of the cell type, we performed crosses between transgenic mouse strain in which the Tsc1 gene contains lox sequences in introns 16 and 18 and strain with Tsc1 wild-type (WT) and the transgene for expression of Cre recombinase fused to the binding domain of the human estrogen receptor (ESR1) ligand, controlled by ubiquitin C (UBC) promoter expression. In F1, we obtained mice carrying the transgene UBC-CreESR1 and heterozygous for Tsc1 (Tsc1WT/flox). In F2, among animals homozygous Tsc1Flox/Flox (N=153) generated by backcrossing, none was carrying the transgene (Nexpected = 85; Nobserved = 0; X2= 348.185, p <0.0001) It is possible that the genomic segment containing the lentiviral vector insertion bearing UBC-CreESR1 transgene is linked to the TSC1 region on mouse chromosome 2, and they segregate together. Treatment with 4-hydroxytamoxifen in animals heterozygous and positive for the transgene showed increased TSC1 in the striatum (p <0.05), while there was no change in the cerebellum. It is possible that transcriptional or translational functional striatum mechanisms favored TSC1 increasing, in a 4-hydroxytamoxifen-dependent manner

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno clínico, com expressividade variável, caracterizado por hamartomas que podem ocorrer em diferentes órgãos. Tem herança autossômica dominante e é devido a mutações em um de dois genes supressores de tumor, TSC1 ou TSC2. Estes codificam para as proteínas hamartina e tuberina, respectivamente, que se associam formando um complexo macromolecular que regula funções como proliferação, diferenciação, crescimento e migração celular. As lesões cerebrais podem ser muito graves em pacientes com TSC e caracterizam-se por nódulos subependimários (SEN), astrocitomas subependimários de células gigantes (SEGA), tuberosidades corticais e heterotopias neuronais, podendo relacionar-se clinicamente à epilepsia refratária à terapia medicamentosa, deficiência intelectual, desordens do comportamento e hidrocefalia. O potencial de crescimento de SEGA até os 21 anos de idade dos pacientes exige acompanhamento periódico por exame de imagem e condutas clínicas ou cirúrgicas, conforme indicação médica. As lesões subependimárias têm sido explicadas por déficits de controle da proliferação, crescimento e diferenciação de precursores neuro-gliais na zona subventricular telencefálica. Embora a capacidade da tuberina em inibir a proliferação celular pela repressão do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) esteja bem documentada, outros aspectos celulares do desenvolvimento de SEGA ainda não foram examinados. Assim, é importante estabelecer um sistema in vitro para o estudo de células da zona subventricular e testá-lo na análise das proteínas hamartina e tuberina. Neste sentido, o cultivo de neuroesferas em suspensão é muito apropriado. Neste estudo, buscamos relacionar a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina à capacidade proliferativa e de diferenciação das células de neuroesferas cultivadas in vitro a partir da dissociação da vesícula telencefálica de embriões de ratos normais. Analisamos a expressão e distribuição subcelular da hamartina e tuberina por imunofluorescência indireta em células entre a primeira e a quarta passagens das neuroesferas, sincronizadas nas fases G1 ou S do ciclo celular e após a reentrada no ciclo celular, através da incorporação de 5-bromo-2\'-desoxiuridina (BrdU) e imunofluorescência com anticorpo anti-BrdU. Em geral, células de neuroesferas apresentaram baixa colocalização entre hamartina e tuberina in vitro. A expressão da tuberina foi elevada em basicamente todas as células das esferas e fases do ciclo celular; ao contrário, a hamartina apresentou-se principalmente nas células da periferia das esferas. A colocalização entre hamartina e tuberina foi observada em células mais periféricas das esferas, sobretudo no citoplasma e, em G1, no núcleo celular. A proteína rheb, que conhecidamente interage diretamente com a tuberina, apresentou distribuição subcelular muito semelhante à desta. Ao carenciamento das células visando à parada do ciclo celular na transição G1/S, tuberina distribuiu-se ao núcleo celular em quase todas as células avaliadas e, de forma menos frequente, a hamartina também. À reentrada no ciclo celular pelo reacréscimo dos fatores de crescimento, avaliaram-se células com incorporação de BrdU ao seu núcleo celular, após 72 e 96 horas. Nestas, tuberina mostrou-se novamente no citoplasma de forma preponderante e hamartina manteve-se citoplasmática, em geral subjacente à membrana plasmática, em níveis mais baixos. Os grupos cujas células reciclaram por 72 ou 96 horas diferiram quanto ao aumento significativo da expressão da hamartina em células proliferativas no último. À diferenciação neuronal, aumentaram-se os níveis de expressão de hamartina observáveis à imunofluorescência indireta, tornando-se equivalentes àqueles da tuberina. Concluímos que as células de neuroesferas cultivadas em suspensão apresentam-se como um sistema apropriado ao estudo da distribuição das proteínas hamartina e tuberina e sua relação com o ciclo celular / The tuberous sclerosis complex (TSC) is a clinical disorder with variable expressivity, characterized by hamartomas that can occur in different organs. It has autosomal dominant inheritance and is due to mutations in one of two tumor suppressor genes, TSC1 or TSC2. These encode for the proteins hamartin and tuberin, respectively, which are associated in a macromolecular complex which functions as a regulator of cell proliferation, differentiation, growth and migration. TSC brain lesions may be severe and are characterized by subependymal nodules (SEN), subependymal giant cell astrocytomas (SEGA), neuronal heterotopias and cortical tubers, and may be clinically related to refractory epilepsy, intellectual disability, behavioral disorders and hydrocephaly. The growth potential of SEGA up to 21 years of age in TSC patients requires regular monitoring by imaging. Clinical and surgical interventions may be medically indicated. Subependymal lesions have been explained by deficient control of proliferation, growth and differentiation of neuro-glial progenitors from the telencephalic subventricular zone. While tuberin ability to inhibit cell proliferation by repressing the mammalian target of rapamycin (mTOR) has been well documented, other cell aspects of SEGA development have not been thoroughly examined. Therefore, it is important to establish conditions for an in vitro system to study the cells from the subventricular zone and to test its suitability for the study of the TSC proteins. In this regard, the neurosphere suspension culture is very appropriate. We evaluated the expression and subcellular distribution of hamartin and tuberin in relation to the proliferation and differentiation capability of neurosphere cells derived in vitro from the dissociation of the telencephalic vesicle of normal E14 rat embryos. These analyses were performed by indirect immunofluorescence in cells from first through fourth passages of neurospheres, synchronized in G1 or S phases of the cell cycle, and after reentry into the cell cycle by the addition of 5-brome-2\'-desoxyuridine (BrdU) and immunolabeling with anti-BrdU antibody. In general, neurosphere cells presented low colocalization between hamartin and tuberin in vitro. Tuberin expression was relatively high in basically all neurosphere cells and cell cycle phases, whereas hamartin distributed mainly to cells from the periphery of the spheres. In these cells, hamartin and tuberin colocalization was evident mostly in the cytoplasm and, in G1, also in the cell nucleus. Rheb, which is known to interact directly with tuberin, had subcellular distribution very similar to tuberin. Cell starvation indicating cell cycle arrest at G1/S redistributed tuberin to the cell nucleus in virtually all cells examined, what was accompanied by nuclear location of hamartin in a small subset of cells. When cells were allowed to reenter cell cycle by adding growth factors, we evaluated BrdU-labeled nuclei 72 and 96 hours later. In the two groups, tuberin was shown to move back to the cytoplasm as well as hamartin, which apparently maintained its lower expression levels distribution underneath the plasma membrane. Group of cells that recycled for 96 hours had significantly more expression of hamartin than those cells that cycled for only 72 hours. After neuronal differentiation, hamartin expression levels observed by immunofluorescence were similar to those of tuberin. We conclude that neurosphere cells cultured in suspension showed to be an appropriate cell system to study hamartin and tuberin distribution in respect to the cell cycle

The tumor suppressor TP53 is the most frequently altered gene in human cancers. The growth-promoting complex, mTORC1 plays a part of the oncogenic profile caused by dysfunctional p53. mTORC1 sits downstream of AMPK and other crucial tumor suppressors/oncogenes, PTEN, LKB1, and Akt. The antifolate pemetrexed was found by this laboratory to activate AMPK via the inhibition of the enzyme AICART in de novo purine synthesis. This work presents a mechanism of mTORC1 activation with p53 loss, as well as of mTORC1 inhibition by pemetrexed-induced AMPK. We have found that mTORC1 activity was substantially upregulated by the loss or mutation of p53. This activation involves the loss of TSC2 from lysosomal membranes, the site of mTORC1 activation by Rheb. We demonstrate that loss of lysosomal TSC2 increased the levels of lysosomal Rheb. Control of mTORC1 was restored by overexpression of TSC2, which correlated with decreased lysosomal Rheb. Surprisingly, pemetrexed-activated AMPK did not phosphorylate TSC2 because of an accumulation of nonfunctional p53, and a subsequent decrease in TSC2 mRNA. Accordingly, lysosomal TSC2 decreased, however, the levels of lysosomal Rheb decreased. Future studies will question whether the robust Raptor phosphorylation by pemetrexed is involved in this decrease in lysosomal Rheb. AMPK activation by pemetrexed also significantly increased the translocation of AMPK to the nucleus, and we will explore the function of this nuclear AMPK. Overall, these findings present a mechanism involved in the oncogenic signaling of mTORC1 with loss of p53 and offer insight into how pemetrexed reinstates control.

The multisystemic tumors characteristic of the monogenic neoplastic diseases, tuberous sclerosis complex (TSC) and lymphangioleiomyomatosis (LAM), share common signaling aberrations upon the loss of heterozygosity in either the TSC1 or TSC2 genes. However, their physical manifestations are vastly different and can generally be classified as being either neurological (TSC) or mesenchymal (TSC & LAM; referred to herein as LAM for simplicity) in origin. In this study, I present a comprehensive stem cell model of LAM utilizing multiple TSC2 knockout (TSC2-/-) pluripotent stem cell lines differentiated to the putative cell of origin for mesenchymal tumors, neural crest cells (NCCs). TSC2-/- NCCs faithfully recapitulate LAM phenotypes and temporal RNA-seq analysis of neural and neural crest differentiation was performed to model disease pathogenesis. Analysis revealed immediate activation of stress response signaling resulting in protein aggregation and lysosome and autophagosome accumulation upon neuralization in TSC2-/- cells. This resulted in acute and lasting effects specific to neural progenitor cells (NPCs), that are transient and ameliorated in NCCs. These lineage-specific effects resulted in selective sensitization of NPCs to cell death via proteasome inhibition, suggesting a potential therapeutic avenue for neurological TSC, but not LAM. Thus, a genome-wide CRISPR knockout screen was performed in TSC2-/- NCCs. Analysis of synthetic lethal genes reveals pathways previously targeted for LAM, but provides gene-level resolution to the vulnerable nodes within these pathways. Importantly, 18 novel gene targets were identified that display synthetic lethality to TSC2-/- cells with high specificity. 3 genes within this list were targetable using commercially available small molecule inhibitors, one of which, FGFR1, shows highly selective lethal targeting of TSC2-/- NCCs. Importantly, this model system, paired with the expansive resource of transcriptomic and synthetic lethal data, serves as a foundation for the development of next generation treatment strategies for LAM, and potentially the entire spectrum of TSC manifestations.