SIRT1 histone deacetylase acts towards many epigenetic and non-epigenetic targets. The involvement of SIRT1 in oocyte maturation is assumed and the importance of ooplasmic SIRT1 pool for further destiny of matured oocyte is strongly suggested. We hypothesized that SIRT1 play role of the signal molecule in mature oocyte through selected epigenetic and non- epigenetic regulation. We observed SIRT1 re-localization in mature oocyte and the association with spindle microtubules. In matured oocyte, SIRT1 shows a spindle-like pattern and spindle- specific SIRT1 action is supported decreasing α-tubulin acetylation. Based on the observation of histone code in immature and matured oocytes, we suggest that SIRT1 is mostly predestined for epigenetic mode of action in germinal vesicle (GV) of immature oocyte. Accordingly, SIRT1- driven trimethylation of histone H3 on lysine K9 in matured oocyte is considered to be an inheritance of GV epigenetic transformation. Taken together, our observations point out the dual spatiotemporal SIRT1 action in oocyte capable to be switched from epigenetic to the non- epigenetic mode of action readily depending on meiosis progress. Keywords: oocyte, SIRT1, histone, developmental competence, tubuline, epigenetics

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Dans les cellules, les microtubules interviennent dans de nombreux événements comme le maintien de l'architecture, la division du matériel génétique, la migration cellulaire ou encore le transport de vésicules et d'organites. Les modifications post-traductionnelles du le C-terminus de la tubuline, bloc de base des microtubules, apparaissent comme très impliquées dans la régulation de ces fonctions car elles régulent le recrutement de leurs nombreux partenaires protéiques. Durant ma thèse, je me suis particulièrement intéressée à une de ces modifications post traductionnelles : le cycle de détyrosination/tyrosination du C-terminus de l'α-tubuline. Ce cycle implique deux enzymes la Tubuline CarboxyPeptidase (TCP), qui clive la tyrosine à l'extrémité de l'α-tubuline, et la Tubuline Tyrosine Ligase (TTL) qui ré-additionne une tyrosine à la tubuline détyrosinée. Des études menées sur ce cycle et notamment la découverte de la TTL ont permis de montrer que la présence d'une tyrosine à l'extrémité C-terminale de l'α-tubuline est indispensable au développement neuronal et que son absence favorise la progression tumorale. La TCP quant à elle est encore inconnue et sa découverte apparaît essentielle afin de pouvoir appréhender le cycle de détyrosination/tyrosination dans sa globalité. Avec pour fil rouge l'identification de la TCP, mon travail s'est déroulé en trois temps. Je me suis tout d'abord intéressée à la protéine EB1. Cette protéine se lie à l'extrémité positive des microtubules où elle recrute de nombreux partenaires microtubulaires. EB1, présente le même C-terminus que l'α-tubuline et notamment une tyrosine terminale indispensable à la liaison des protéines à CAP-Gly. Dans des cellules et des tissus sains j'ai montré qu'EB1 n'existe pas sous forme détyrosinée ce qui souligne la spécificité de la TCP pour l'α-tubuline. Dans un second temps, j'ai participé à l'étude d'une famille de carboxypeptidases cytosoliques impliquées dans la neurodégénérescence, les CCPs, parmi lesquelles nous pensions trouver la TCP. Nous avons montré que quatre de ces enzymes (CCP1, 4, 5, et 6) retirent les glutamates présents de manière latérale au C-terminus de la tubuline. Les CCP1, 4 et 6 peuvent également cliver le dernier glutamate de la tubuline détyrosiné générant de l'α-tubuline où les deux derniers acides aminés ont été clivés (tubuline-Δ2). Aucune de ces carboxypeptidases ne se révélant être la TCP, j'ai mis en place une méthode biochimique dans le but de purifier cette enzyme. Après plusieurs étapes de purification à partir de cerveaux de souris, des préparations enrichies en activité carboxypeptidase ont été obtenues. Les analyses spectrométriques et bioinformatiques de ces préparations ont permis d'isoler des candidats TCP actuellement testés pour leur potentielle activité de détyrosination du C-terminus de l'α-tubuline. Si la TCP n'est pas présente parmi eux, les outils développés lors de cette étude devraient permettre une très prochaine identification de cette enzyme essentielle. / Microtubules control many aspects of cellular function. Those polymers of tubulin are involved in numerous events ranging from the maintenance of cell architecture to cell division and migration through the transport of vesicles and organelles. The post-translational modifications of the C-terminus of tubulin appear to be involved in the regulation of microtubule functions by recruiting different effectors at the growing end of microtubules. During my PhD, I focused on one of these post-translational modifications: the detyrosination/tyrosination cycle of the C-terminal α-tubulin. This cycle involves the enzymatic removal of the C-terminal tyrosine of α-tubulin by an uncharacterized tubulin carboxypeptidase (TCP) and the re-addition of a tyrosine residue by the Tubulin-Tyrosine-Ligase (TTL) isolated in 1975. On one hand, tubulin tyrosination is important in neuronal organization whereas TTL suppression in human cancers is associated with tumor aggressiveness. Those defects are in part due to the failure of microtubule partners to bind detyrosinated microtubules. My project was divided into three main parts. I have first studied EB1, a microtubule plus end tracking protein which recruits many proteins at the microtubule plus end. This protein ends with the same amino acids as does α-tubulin. As in tubulin, the tyrosine terminal is important for the binding of EB1 partners. I showed that EB1 does not exist under detyrosinated form underlying the TCP specificity. Then, I collaborated to identify the function of a carboxypeptidase family within which we thought we could find the TCP. Four members of this family are deglutamylating enzymes (CCP1, CCP4, CCP5 and CCP5). Three of them (CCP1, CCP4 and CCP6) can cleave the last glutamate of detyrosinated tubulin to generate tubulin without the last two C-terminus amino acids (Δ2-tubulin). However, none of them was identified as the TCP. I consequently developed a biochemical approach to find this enzyme. Extracts enriched in carboxypeptidase activity after purification steps from mice brain were analyzed by mass spec and bioinformatics. Some candidates are currently tested for their potential C-terminus α-tubulin detyrosinating activity. The tools developed here should allow for pending identification of the TCP.

abstract: Amongst the most studied of the social insects, the honey bee has a prominent place due to its economic importance and influence on human societies. Honey bee colonies can have over 50,000 individuals, whose activities are coordinated by chemical signals called pheromones. Because these pheromones are secreted from various exocrine glands, the proper development and function of these glands are vital to colony dynamics. In this thesis, I present a study of the developmental ontogeny of the exocrine glands found in the head of the honey bee. In Chapter 2, I elucidate how the larval salivary gland transitions to an adult salivary gland through apoptosis and cell growth, differentiation and migration. I also explain the development of the hypopharyngeal and the mandibular gland using apoptotic markers and cytoskeletal markers like tubulin and actin. I explain the fundamental developmental plan for the formation of the glands and show that apoptosis plays an important role in the transformation toward an adult gland. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Biology 2018

The Microtubule (MT) network is a central component of the eukaryotic cell cytoskeleton. In the fission yeast S. pombe, a complex of three proteins specifically tracks MT +ends and stabilizes MTs in the cell. It is composed of the proteins Mal3, Tip1 and Tea2. Mal3, the S. pombe homologue of EB1, is a highly conserved ubiquitous protein found to be at the centre of many MT related processes. Tip1 is a CLIP170 homologue and Tea2 a kinesin-like motor protein. The mechanism by which they target the growing end of MTs and stabilize them is still unknown. A combination of biochemistry, electron microscopy and crystallography were used in an attempt to get a more precise understanding of the MT stabilization by this +Tip complex. Protein-A pull-down of the endogenous complex and analysis of its constituents by mass spectrometry revealed that Tea2 and Tip1 form a tight stoichiometric complex, making a much more labile interaction with Mal3. Biochemical experiments, light scattering and DIC microscopy demonstrate that Mal3 stabilizes the MT structure in a stoichiometric fashion by suppressing catastrophe events. 3D helical reconstruction of electron micrographs of Mal3 bound to the MT show that it most probably stabilizes the MT structure by bridging protofilaments together. Deletion mutant analysis suggests that contact with one of the protofilaments is via an interaction between the charged tails of tubulin and Mal3. Mal3 MT binding domain structure was solved by X-ray crystallography so that eventually it may be docked into a higher resolution electron microscopy map to provide a more precise structural insight on how Mal3 stabilizes the MT lattice. The EM analysis also shows that Mal3 regulates MT structure in vitro by restraining their protofilament number to 13, which is the number always found in vivo, and by driving the assembly of MTs with a high proportion of A-lattice. It is the first time that a protein is found to promote formation of A-lattice MTs. The fact that EB1 is such a ubiquitous protein reopens the question of MT structure in cells and has important implications for in vivo MT dynamics.

La tubuline est une protéine essentielle de la cellule. En polymérisant sous forme de microtubules, elle crée notamment le fuseau mitotique le long duquel migrent les chromosomes pendant la mitose. Les médicaments qui inhibent la polymérisation et/ou la dépolymérisation de la tubuline sont des composés majeurs de la thérapie anticancéreuse. Les vinca-alcaloïdes en sont des représentants importants. Ils induisent la mort des cellules par apoptose, en inhibant la dynamique des microtubules. D’autres molécules d’origine naturelle, comme la phomopsine A, se fixent sur la tubuline à proximité ou dans le même site de fixation que celui des vinca-alcaloïdes. C’est la raison pour laquelle nous avons envisagé d’élaborer des composés antimitotiques hybrides entre la vinblastine et la phomopsine A. Dans ce contexte, deux séries de composés ont été conçues. La première série d’hybrides correspondant à des dérivés de l’anhydrovinblastine fonctionnalisés en position 7’. Cependant, aucune des trois stratégies étudiées n’a permis d’accéder à ces composés. La deuxième série d’hybrides, dérivés de la 7’-homo-anhydrovinblastine a pu être synthétisée grâce à une réaction originale d’insertion d’acétylènes activés au niveau du pont gramine de la vinorelbine, suivie d’une réduction avec un contrôle totale de la régio- et stéréoselectivité. Dans un premier temps, les réactions d’insertion et de réduction ont été mise au point. Ensuite, deux familles d’hybrides portant la chaîne latérale de l’octahydrophomopsine en position 8’ ou 7’ ont été synthétisés. La plupart des composés ainsi obtenus possédent une excellente activité sur la tubuline et sont très cytotoxique. / Tubulin plays a key role in many cellular functions, like cell division. Microtubules, resulting from its polymerisation, form the mitotic spindle along which chromosomes migrate during mitosis. Tubulin-binding molecules are one of the most important classes of anti-cancer agents with major drugs already on the market and many promising compounds in clinical trials. Vinca-alkaloids are one of these antimitotic drugs inhibiting microtubules dynamics. It was shown that the vinca binding site partially overlaps with that of others natural products, like phomopsin A. In order to explore the vinca domain and to elaborate new acute derivatives, we have elaborated antimitotic vinblastine-phomopsin hybrids. We were interested in the synthesis of two series of hybrids. The first, corresponding to 7’-anhydrovinblastine derivatives could not be obtained. None of the three studied strategies lead to desired compounds. The second series of hybrids, corresponding to functionnalized 7’-homo-anhydrovinblastine derivatives, could be synthetised by an original and regioselective insertion reaction, followed by a stereoselective reduction. Firstly, the isertion reaction was studied using different activated acetylenes. Then, two different families of hybrids were obtained, thanks to the selective insertion of the octahydrophomopsin lateral chain in position 8’ or 7’. Almost all the compounds were highly active on tubulin and very cytotoxic.

La Combrétastatine A-4 (CA-4), molécule naturelle isolée d’un saule d’Afrique du sud est le chef de file des agents antivasculaire qui détruit sélectivement le réseau vasculaire tumoral et qui conduit à une nécrose ischémique d’une tumeur solide. Sa prodrogue, la fosbrétabuline (CA-4P, First-in-class) a reçu en 2016 le statut de médicament orphelin aux USA et en Europe pour le traitement de tumeurs neuro-endocrines et des glioblastomes multiformes. Malgré un intérêt thérapeutique certain, la fosbrétabuline a montré une instabilité chimique (isomérisation de la double liaison Z conduisant à l’isomère inactif E) et à des effets indésirables de type cardiotoxique. Notre groupe a conçu l’isoCA-4, une forme plus stable et non isomérisable de la CA-4 qui a montré des activités biologiques similaires à la CA-4. Il a été supposé que la cardiotoxicité de la CA-4 et de ses analogues soit probablement due à la présence du groupement 3,4,5-triméthoxyphényle considéré comme crucial pour l’activité cytotoxique et antitubuline. Afin de surmonter ce problème et contrairement au dogme précédent, nos efforts se sont été concentrés sur le remplacement de ce cycle par divers hétérocycles. Nous avons identifié trois nouvelles classes d’agents antivasculaires hétérocycliques voire bis-hétérocycliques. Nous avons montré que ces molecules “drug-like” sont douées d’une excellente activité antiproliférative à des concentrations nanomolaires, d’une activité antivasculaire supérieure à celle de la CA-4 et possèdent un index de sécurité cardiaque très élevé. Ces résultats démontrent pour la première fois que le remplacement du cycle 3,4,5-triméthoxyphényle de l’isoCA-4 par un hétérocycle approprié est une approche prometteuse pour identifier de nouveaux agents antivasculaires ayant une faible cardiotoxicité. / Combretastatin A-4 (CA-4), is a natural antivascular agent isolated from a South African Sallow tree that selectively destroys tumor vasculature leading to ischemic necrosis. In 2016, the prodrug fosbretabulin (CA-4P) obtained designation as orphan drug in USA and Europe for the treatment of neuroendocrine tumors and glioblastoma. Despite its importance as a therapeutic agent, fosbretabulin has shown chemical instability. In fact, the double bond form Z isomerizes to an inactive E form of the drug. Moreover, fosbretabulin is associated to several side-effects including cardiotoxicity. Our group succeeded in the design of a more stable and non-isomerizable form of CA-4 as isoCA-4 which exhibited similar biological activities as CA-4. It was thought that cardiotoxicity of CA-4 and analogs is probably due to the presence of the 3,4,5-trimethoxyphenyl A-ring however the latter seems to have an essential role for the cytotoxic and antitubulin activities of the drug. Despite the role of the trimethoxyphenyl ring, we have focused our challenges on the remplacement of this moiety by various heterocycles to reduce the cardiotoxicity and to put an end to this dogma. We have identified three new classes of heterocyclic and bis-heterocyclic antivascular agents. We have demonstrated that these "drug-like" molecules have excellent antiproliferative activities at nanomolar ranges, an antivascular activity superior to that of CA-4 and possesses a very high cardiac safety index. Regarding these results, we have been able to show for the first time that the replacement of the 3,4,5-trimethoxyphenyl ring of isoCA-4 by various heterocyclic systems is a promising approach to synthesize new antivascular agents having a low level of cardiotoxicity.

Tubulin is the basic building block of microtubules which ensure intracellular transport, morphological changes, the connection of proteins of metabolic pathways, the segregation of chromosomes during mitosis and many other essential processes in plant cells. The localization of tubulin regarding nucleus is strictly controlled and during the interphase, tubulin is usually not present in the nucleus. As we previously showed, one of the exceptions of the presence of tubulin in the nucleus is the cold stress condition. Also, we discovered several plant-specific nuclear export sequences (NES) in tubulin molecules: one in α-tubulin and two in β-tubulin. In this work I found that double mutation of both functional β-tubulin NESes cause slight accumulation of the protein in the nuclei. However, the phenotype of the transgenic plants expressing β-tubulin with mutations is probably not affected by the presence of the mutated protein. The effect of the expression of the mutated β-tubulins was observed in Nicotiana tabacum BY-2 cells as well. The expression of β-tubulin carrying a single NES3 mutation or double mutation of both NESes bring changes of the division activity of the cells, while the NES2 mutation does not have any effect. Furthermore, it was discovered that the 0řC cold tr eatment does not cause...

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Author: Katharina Zenkerová Supervisors: Assoc. Prof. PharmD. Jan Zitko, Ph.D.; Prof. Romano Silvestri Title of diploma thesis: Design and synthesis of novel 3-aroyl-1-arylpyrrole derivatives as potential tubulin polymerization inhibitors Key word: anticancer agents; pyrrole; tubulin polymerization inhibitors Cancer is a major burden of disease worldwide and it remains one of the most difficult illnesses to treat. Since the percentage of people suffering from cancer is increasing, an enormous effort to design and develop better medicaments is needed. Microtubules are a key component of the cytoskeleton in most eukaryotic cells and they represent an attractive target for antitumor agents, due to the significant mitosis rate of tumor cells. Since cancer cells usually display higher proliferation rates than normal cells, drugs that interfere with microtubules dynamic equilibrium, also known as antimitotic agents, have become a fruitful approach to develop anticancer agents in clinical use. In fact, agents interfering with microtubules may either inhibit the tubulin polymerization or block microtubules to disassembly, both causing the arrest of cell division and the consequent...

Les pathosystèmes, plante-bactérie, aboutissent souvent au niveau de la plante à de profondes reprogrammations tant au niveau de la morphogenèse que du métabolome. Dans le cas de l’interaction plante-Rhodococcus fascians, une bactérie phytopathogène, il se développe au niveau du site d’infection, une structure morphologique particulière nommée « galle feuillée ». <p>Au sein de cette hyperplasie, les altérations métaboliques induites concernent non seulement les produits du métabolisme primaire mais également le métabolisme secondaire et plus particulièrement des composés qui interviennent dans les mécanismes de défense ou qui affectent la prolifération cellulaire végétale. <p>Dans le cadre de notre travail de thèse, nous nous sommes fixé deux objectifs principaux qui sont de caractériser les altérations métaboliques au niveau des tissus hyperplasiques de tabac mais aussi de rechercher des applications potentielles du point de vue thérapeutique de cette interaction.<p>L’approche métabolomique globale basée sur une analyse comparative des spectres 1H-RMN d’extraits bruts de tissus infectés et de tissus non-infectés couplée à des analyses statistiques de données multivariées (ACP, OPLS-DA) a été utilisé pour l’étude de la reprogrammation métabolique. Le résultat indique une accumulation de composés phénoliques et des métabolites de la famille des diterpènes dans les tissus de la galle feuillée. <p>Les activités biologiques des extraits de la galle feuillée ont ensuite été évaluées, notamment des activités antioxydantes (DPPH, FRAP), anti-inflammatoire (15-LOX) et antiproliférative (MTT). Il ressort de cette analyse une augmentation du potentiel réducteur et anti-radicalaire des extraits de la galle feuillée, une activité inhibitrice de la lipoxygénase ainsi qu'une activité antiproliférative sur lignées tumorales humaines, comparée à la plante non infectée. <p>L’étude des composés affectant la prolifération des cellules cancéreuses humaines a aboutit à la mise en évidence d’un mélange de molécules (F3.1.1) appartenant au groupe des incensoles (cembrènoïdes). Ces composés ralentissent la durée de la division cellulaire, affectent la taille des cellules et induisent des anomalies de la karyokinèse et de la cytokinèse des cellules de glioblastome U373. La dynamique tubuline/microtubule est identifiée comme étant la cible des cembrènoïdes (F3.1.1). L’effet des ces composés est original comparé aux anti-tubulines usuels tel que la colchicine et le paclitaxel. Le mécanisme d’action des incensoles est unique et donc prometteur du fait que la dynamique des microtubules reste une cible de choix dans le traitement des cellules cancéreuses.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished