CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / COX-2 e Caderina-E participam de forma fundamental na manutenÃÃo do estado fisiolÃgico da mucosa gÃstrica e tÃm papel essencial na reaÃÃo inflamatÃria e reparo, e no cÃncer. O objetivo deste trabalho à avaliar a expressÃo das duas proteÃnas no carcinoma gÃstrico e metÃstases linfonodais e suas possÃveis participaÃÃes na progressÃo tumoral. Foram utilizados 97 casos de gastrectomias por carcinoma gÃstrico, 36 dos quais com linfonodos disponÃveis, dos arquivos do Hospital do CÃncer do CearÃ. Os casos foram classificados nos tipos intestinal (40 casos), difuso (34), mistos (16) e nÃo-classificados (7 casos) de acordo com a classificaÃÃo de Lauren (1965). Utilizou-se tÃcnica de tissue microarray associada à imunohistoquÃmica com anticorpo monoclonal anti-COX-2 e anti-Caderina-E e sistema de detecÃÃo universal estreptavidina-biotina-peroxidase. A expressÃo de COX-2 foi avaliada de acordo com os seguintes escores: Intensidade (I): 0=negativa; 1=discreta; 2= moderada; 3= acentuada; ExtensÃo (E) de cÃlulas coradas: 1= 0 a 25%; 2= >25 a 50%; 3= >50 a 75%; 4= >75 a 100%. Escore final: I x E, sendo considerados escores < 6 como COX-2 de baixa expressÃo e escores &#8805;6 de alta expressÃo. Classificou-se a expressÃo de Caderina-E nos escores: 0=negativo; 1=citoplasmÃtica; 2=citoplasmÃtica + membranar; 3= membranar-normal (Jawhari et al., 1997a). Foram comparadas expressÃo normal e anormal e membranar e nÃo membranar em cada histotipo de carcinoma, na sede primÃria e linfonodos. ExpressÃo positiva para COX-2 e anormal de Caderina-E predominaram nos diversos histotipos de carcinoma gÃstrico primÃrio, principalmente difusos e mistos. Observou-se maior expressÃo de COX-2 nas metÃstases linfonodais, em relaÃÃo Ãs lesÃes primÃrias, sobretudo nos carcinomas difusos. Carcinomas intestinais estavam associados à expressÃo membranar de Caderina-E enquanto tumores difusos se relacionaram com ausÃncia de expressÃo membranar, o que mostra a importÃncia da Caderina-E na diferenciaÃÃo do cÃncer gÃstrico. Carcinomas gÃstricos apresentam dois padrÃes de imunomarcaÃÃo citoplasmÃtica: granular (paranuclear), associado à expressÃo citoplasmÃtica exclusiva, que prevalece no componente difuso dos tumores mistos, e homogÃneo, em todo o citoplasma, correlacionado com expressÃo citoplasmÃtica-membranar, predominante nos outros histotipos. Carcinomas difusos apresentam expressÃo membranar de Caderina-E, que se expressa com maior freqÃÃncia nas metÃstases linfonodais do que nas lesÃes primÃrias e està presente em grupos celulares infiltrantes e cÃlulas isoladas, nas duas sedes anatÃmicas. Os dados sugerem que o carcinoma misto representa histotipo distinto de carcinoma gÃstrico, baseado nos aspectos peculiares da expressÃo citoplasmÃtica de Caderina-E aqui mostrados e em outros achados da literatura. NÃo houve associaÃÃo estatisticamente significativa entre expressÃo de COX-2 e de Caderina-E e demais parÃmetros clÃnico-patolÃgicos nesta amostra. Os dados aqui observados sugerem que COX-2 e Caderina-E sÃo importantes proteÃnas relacionadas com a progressÃo tumoral-linfonodal no cÃncer gÃstrico / Both COX-2 and E-Cadherin play important roles in physiological and pathological processes in the stomach, such as control of acid secretion, inflammation and cancer. The aim of this study was to analyze the relationship between COX-2 and E-Cadherin immunoexpression in human gastric adenocarcinomas and respective lymph node metastases and their possible action in tumoral progression. Tissue microarrays were prepared from paraffin embedded samples of 97 primary gastric cancers, included 36 with respective nodal metastases. Cases were classified according to Laurenâs classification as intestinal (n=40), diffuse (n=34), mixed (n=16) and undetermined (n=7). Immunoexpression of COX-2 was evaluated regarding intensity (0-absent; 1-mild; 2-moderate; 3-strong) and extension (0-negative or rare cells; 1-<25%; 2-25-50%; 3-50-75%; 4->75% immunoreactive neoplastic cells). A combined score was calculated (intensity x extension): 0-12. A cut-off of 6 was considered to classify COX-2 expression as low (<6) or high (&#8805;6). E-Cadherin expression was evaluated according to the system proposed by Jawhari et al. (Gastroenterology, 1997) as abnormal patterns of expression: 0-no expression; 1-cytoplasmic expression; 2-heterogeneous expression, both membranous and cytoplasmic) and normal membranous pattern (3). Membranous (scores 2 and 3) and Non-membranous (scores 0 and 1) were too compared. Overall, COX-2 positive and abnormal E-Cadherin expression predominate in all types of primary gastric carcinomas. COX-2 expression was higher in lymph node metastases than in primary tumors, with a significant difference for diffuse carcinoma. A positive relationship was observed between E-Cadherin membranous expression and intestinal tumors, and absence of membranous expression and diffuse ones, which indicates the importance of E-Cadherin to gastric cancer differentiation. Granular (paranuclear) cytoplasmic immunostaining pattern was basically associated with cytoplasmic E-Cadherin expression while homogeneous pattern is frequently seen in cytoplasmic-membranous expression. Diffuse carcinomas show membranar expression more frequently in lymph nodes metastases than in gastric primary tumors in both isolated and grouped cells. The data suggest that mixed carcinoma is a distinct hystotype, based on its peculiar cytoplasmic expression of E-Cadherin shown here and other features of literature. There was no significant association linking COX-2 and E-Cadherin expression to other clinicopathological parameters. The data show that COX-2 and E-Cadherin are important proteins related to tumoral progression in gastric cancer

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3&#946; e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e &#946;-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de &#946;-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3&#946;&#61538; de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3&#946; and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and &#946;-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of &#946;-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3&#946;. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3&#946; e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e &#946;-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de &#946;-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3&#946;&#61538; de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3&#946; and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and &#946;-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of &#946;-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3&#946;. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.

ERK3 est une protéine de la famille des MAP kinase (MAPK) classifiée comme atypique car elle présente des différences notables comparées aux propriétés redondantes des MAPK dites classiques. ERK3 est notamment une protéine très instable dégradée constitutivement par le système ubiquitine protéasome. Par conséquence, son activité biologique est principalement contrôlée par la régulation de sa dégradation. Pourtant, les facteurs impliqués dans la régulation de la stabilité de ERK3 restent mal compris. Ce travail de thèse vise ainsi à affiner notre compréhension des mécanismes de régulation de la stabilité de ERK3. De manière intéressante, nous avons montré dans une première étude qu’un pH acide stabilise fortement ERK3 alors qu’à l’inverse, un pH basique induit sa rapide dégradation par le protéasome. De plus, la déplétion génétique de NBCn1, un transporteur de bicarbonate impliqué dans la régulation du pH intracellulaire, augmente également la stabilité de ERK3. Ainsi, des variations de pH intracellulaire régulent finement la dégradation de ERK3. Nous avons également montré dans une deuxième étude l’importance de ERK3 dans la progression tumorale dans le cancer du sein. La surexpression de ERK3 au niveau transcriptionnel ou protéique est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein, que ce soit au niveau de la survie globale ou de la survie sans métastase. Ainsi, la déplétion de ERK3 entraîne une diminution drastique du nombre de métastases au foie et aux poumons. ERK3 est également impliquée dans la migration cellulaire in vitro. Nous avons montré pour la première fois que la stabilité d’une kinase peut être modulée par le pH. Or, le pH est impliqué dans de nombreux processus biologiques comme, entre autres, la prolifération cellulaire, la migration, l’invasion et la mort cellulaire. Les résultats obtenus pendant ce doctorat ouvrent donc de nouveaux champs d’exploration pour étudier l’activité biologique de ERK3 dans des contextes dépendants du pH. / ERK3 is an atypical member of the MAP kinase (MAPK) family because its regulation differs from the canonical module of classical MAPK. ERK3 is also an unstable protein constitutively degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore, ERK3 stability regulation is an essential element in the control of its biological activity. However, the components implied in the regulation of its stability by the UPS are mainly unknown. This thesis aims to understand the regulation mechanisms controlling ERK3 degradation to better explore its biological function. In a first study, we showed that an acidic extracellular pH strongly stabilizes ERK3. At the opposite, a basic pH triggers its rapid degradation by the proteasome. Moreover, genetic depletion of NBCn1, a bicarbonate transporter involved in the regulation of the intracellular pH (pHi), also impacts ERK3 stability. We demonstrated that pHi variation finely regulates ERK3 degradation. We also explored the role of ERK3 in breast cancer progression in a second study. In breast cancer, high ERK3 expression correlates with a poor overall survival as well as a higher risk to develop metastases. ERK3 depletion triggers a severe decrease in the number of liver and lungs metastasis in a in vivo metastasis model. We also demonstrated that ERK3 is involved in cell migration in vitro. We showed for the first time that a kinase stability is modulated by pH variation. pH homeostasis is finely regulated in cells to assure important cellular functions such as proliferation, invasion, and survival. Therefore, ERK3 protein levels regulation by the pH raises new potential functions to explore for this kinase in a context pH dependent.