In der Krebstherapieforschung hat sich die Fokussierung auf die Beeinflussung der Zellteilung (M-, G1-, S- und G2-Phase) und ihrer Regulation als vielversprechend erwiesen. Ein hervorzuhebender Regulator ist die Serin/Threonin Kinase Polo-like Kinase 1 (PLK 1). Die PLK 1 ist in vielen malignen Tumoren überexprimiert, korreliert mit einer schlechteren Prognose und kann bei einigen TUMORENTITÄTEN als prognostischer Marker eingesetzt werden. Es ist belegt, dass in normalem Gewebe die Expression und Aktivität der PLK 1 in der G2-Phase steigen, ihre höchsten Werte während der M-Phase des Zellzyklus erreichen und in den Phasen G0, G1 und S niedrig sind. Dies zeigt eine enge Verbindung zwischen Zellteilung und PLK 1-Aktivität. Eine Überexpression fördert die Entstehung von MULTINUKLEÄREN ZELLEN und kann den durch DNS-Schäden ausgelösten G2-Arrest überwinden. Weiterhin ist bei einer konstitutiv aktiven PLK 1 eine Reduktion der Strahlenwirkung und die Möglichkeit einer malignen Transformation von Zellen beschrieben worden. Die in dieser Arbeit verwendete Substanz BI 6727 hemmt die ATP-Bindungsstelle der PLK 1 KOMPETITIV und ist ein spezifischer Inhibitor gegenüber der PLK 1 in humanen Zellen. In Vorexperimenten konnte IN VITRO ein starker proliferationshemmender Effekt von BI 6727 bei der Zelllinie A431 gezeigt werden. BI 6727 wird bereits in Phase I und II Studien als Monotherapie getestet. Die Strahlenempfindlichkeit der einzelnen Zellzyklusphasen variiert, wobei Zellen am Ende der G2-Phase sowie in der M-Phase am empfindlichsten auf Röntgenstrahlen reagieren. Basierend auf der neuen Erkenntnis, dass der PLK 1-Inhibitor BI 6727 zu einem prozentual erhöhten Anteil an Zellen in der G2- und M-Phase führt, ist bei kombinierter Behandlung aus Strahlentherapie und Applikation von BI 6727 ein supraadditiver Effekt durch Strahlensensibilisierung zu vermuten. In diesem Zusammenhang sind bisher keine Untersuchungen bekannt. Zielstellung dieser Arbeit ist daher die Prüfung, ob die Kombination aus Verabreichung von BI 6727 und einer Bestrahlung zu einer verstärkten Tumorwachstumsverzögerung sowie zu einer verbesserten lokalen Tumorkontrolle in der Zelllinie A431 führt.

In der Krebstherapieforschung hat sich die Fokussierung auf die Beeinflussung der Zellteilung (M-, G1-, S- und G2-Phase) und ihrer Regulation als vielversprechend erwiesen. Ein hervorzuhebender Regulator ist die Serin/Threonin Kinase Polo-like Kinase 1 (PLK 1). Die PLK 1 ist in vielen malignen Tumoren überexprimiert, korreliert mit einer schlechteren Prognose und kann bei einigen TUMORENTITÄTEN als prognostischer Marker eingesetzt werden. Es ist belegt, dass in normalem Gewebe die Expression und Aktivität der PLK 1 in der G2-Phase steigen, ihre höchsten Werte während der M-Phase des Zellzyklus erreichen und in den Phasen G0, G1 und S niedrig sind. Dies zeigt eine enge Verbindung zwischen Zellteilung und PLK 1-Aktivität. Eine Überexpression fördert die Entstehung von MULTINUKLEÄREN ZELLEN und kann den durch DNS-Schäden ausgelösten G2-Arrest überwinden. Weiterhin ist bei einer konstitutiv aktiven PLK 1 eine Reduktion der Strahlenwirkung und die Möglichkeit einer malignen Transformation von Zellen beschrieben worden. Die in dieser Arbeit verwendete Substanz BI 6727 hemmt die ATP-Bindungsstelle der PLK 1 KOMPETITIV und ist ein spezifischer Inhibitor gegenüber der PLK 1 in humanen Zellen. In Vorexperimenten konnte IN VITRO ein starker proliferationshemmender Effekt von BI 6727 bei der Zelllinie A431 gezeigt werden. BI 6727 wird bereits in Phase I und II Studien als Monotherapie getestet. Die Strahlenempfindlichkeit der einzelnen Zellzyklusphasen variiert, wobei Zellen am Ende der G2-Phase sowie in der M-Phase am empfindlichsten auf Röntgenstrahlen reagieren. Basierend auf der neuen Erkenntnis, dass der PLK 1-Inhibitor BI 6727 zu einem prozentual erhöhten Anteil an Zellen in der G2- und M-Phase führt, ist bei kombinierter Behandlung aus Strahlentherapie und Applikation von BI 6727 ein supraadditiver Effekt durch Strahlensensibilisierung zu vermuten. In diesem Zusammenhang sind bisher keine Untersuchungen bekannt. Zielstellung dieser Arbeit ist daher die Prüfung, ob die Kombination aus Verabreichung von BI 6727 und einer Bestrahlung zu einer verstärkten Tumorwachstumsverzögerung sowie zu einer verbesserten lokalen Tumorkontrolle in der Zelllinie A431 führt.:INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 5 1 Einleitung 6 2 Grundlagen 9 2.1 Zellzyklus einer humanen Zelle 9 2.2 Röntgenstrahlen 11 2.3 Wirkung von Strahlen auf humanes Gewebe 11 2.4 Funktion der PLK 1 14 2.5 Wirkung der PLK 1-Inhibition 18 2.6 Wirkung des PLK 1-Inhibitors BI 6727 20 2.7 Therapie von Plattenepithelkarzinomen weiblicher Geschlechtsorgane 22 2.8 Fragestellung 23 3 Material und Methoden 24 3.1 Experimentaldesign 24 3.1.1 Versuchsaufbau und Behandlungsarme 24 3.1.2 Aufnahme der Versuchstiere in das Behandlungsschema 26 3.2 Experimentaltiere 27 3.2.1 Charakterisierung der Versuchstiere 27 3.2.2 Haltung der Versuchstiere 27 3.3 Implantiertes Tumorgewebe A431 28 3.3.1 Tumorzelllinie A431 28 3.3.2 Tumorkonstanz 29 3.3.3 Implantation 30 3.4 Polo-like Kinase 1-Inhibitor BI 6727 und Trägersubstanz 30 3.4.1 Substanz BI 6727 und Trägersubstanz 30 3.4.2 Intravenöse Applikation 31 3.5 Bestimmung der Tumorvolumina 31 3.5.1 Messmethode 31 3.5.2 Berechnung 32 3.6 Bestrahlung 32 3.6.1 Durchführung der lokalen Tumorbestrahlung 32 3.6.2 Geräte und Dosimetrie 33 3.6.3 Qualitätskontrolle der lokalen Tumorbestrahlung 34 3.7 Nachbeobachtung von Tieren und Tumoren 35 3.8 Experimentelle Endpunkte und Auswertungsmethoden 35 3.8.1 Tumorwachstumsverzögerung 35 3.8.2 Lokale Tumorkontrolle 36 4 Diskussion der angewandten Methoden 38 4.1 Tierexperiment 38 4.2 Einfluss des murinen Immunsystems 38 4.3 Einsatz des Tumors A431 und der Substanz BI 6727 39 4.4 Durchführung der lokalen Tumorbestrahlung 41 4.5 Applikationsschema 42 4.6 Experimentelle Endpunkte 43 4.7 Nachbeobachtung 45 4.8 Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tierversuchen auf den Menschen 46 5 Ergebnisse 48 5.1 Alleinige Applikation von BI 6727 48 5.2 Applikation von BI 6727 in Kombination mit Bestrahlung 50 5.2.1 Tumorwachstumsverzögerung 50 5.2.2 Lokale Tumorkontrolle 57 5.3 Verträglichkeit von BI 6727 58 6 Diskussion der Ergebnisse 59 6.1 Vorexperimente 59 6.2 Alleinige Verabreichung von BI 6727 60 6.3 Kombination von BI 6727 und Bestrahlung 61 6.3.1 Tumorwachstumsverzögerung 61 6.3.2 Lokale Tumorkontrolle 63 6.4 Verträglichkeit von BI 6727 65 6.5 BI 6727 in Kombination mit fraktionierter Bestrahlung 66 6.6 Klinische Relevanz 67 6.7 Ausblick 69 7 Zusammenfassung 72 8 Summary 76 ERKLÄRUNG zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 79 ERKLÄRUNG über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben 81 LITERATURVERZEICHNIS 82 GLOSSAR 89 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 92 TABELLENVERZEICHNIS 93 DANKSAGUNG 94

Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3-Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen. / Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir.

Hintergrund Die Strahlentherapie ist neben der radikalen Prostatektomie eine Standardtherapie zur Behandlung von Prostatatumoren und führt zu sehr guten Ergebnissen für die lokale Tumorkontrolle und für das Überleben. Allerdings ist, wie bei der Operation auch, dabei das Risiko eines Rezidivs für fortgeschrittene Tumoren im Gegensatz zu Tumoren in früheren Stadien relativ hoch. Daher besteht eine hohe Dringlichkeit zur Verbesserung der Strahlentherapie vor allem bei fortgeschrittenen Tumoren. Ein Ansatz hierfür ist die Kombination der Bestrahlung mit molekularen Therapien. Ziel dabei ist es, bestimmte Zielproteine zu blockieren, um die Strahlensensibilität der Prostatakarzinomzellen zu erhöhen. Ein potentielles Target könnte hierbei die Blockade des VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalwegs (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – Neuropilin 2; Akt – Proteinkinase B) sein. Im Prostatakarzinom sind die Konzentrationen von VEGF-C und NRP-2 im Vergleich zu normalen Prostatazellen erhöht. Aus Untersuchungen ist bekannt, dass beide Proteine eine progressive Wirkung auf die Tumorgenese haben. In Vorarbeiten zeigen Muders et al. (2009) zudem eine Aktivierung von Akt über die VEGF-C/NRP-2-Achse und eine darüber vermittelte Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch H2O2. Akt wirkt in verschiedenen Tumorentitäten außerdem protektiv gegenüber Bestrahlung. Es besteht die Annahme, dass dies auch für Prostatakarzinomzellen gilt. Zielstellung Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob und über welchen Mechanismus VEGF-C, NRP-2 und Akt die Strahlenresistenz in Prostatakarzinomzelllinien beeinflussen. Methoden Es wurden in vitro- und in vivo-Experimente in den humanen Prostatakarzinomzelllinen PC-3, DU145, LNCaP sowie in PC-3-Xenografts durchgeführt. Der Einfluss von VEGF-C und NRP-2 auf die Strahlenresistenz wurde in vitro nach Herunterregulierung der entsprechenden Gene mittels siRNA beziehungsweise nach Supplementierung mit humanem rekombinanten VEGF-C in Koloniebildungsassays untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses von VEGF-C und von NRP-2 auf mögliche Zellüberlebensmechanismen wurden der autophagische Flux nach Blockade der Autophagie mit Bafilomycin A1 mittels Western Blot, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur mittels Quantifizierung der γH2AX Foci sowie die Zellzyklusverteilung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Signalweiterleitung von VEGF-C über Akt sowie, als weitere Möglichkeit, die Signalweiterleitung über ERK1/2 wurden nach siRNA-Transfektion mit und ohne Bestrahlung mittels Western Blot geprüft. Weitere Versuche zu Akt erfolgten in vitro und in vivo mit dem PI3K/Akt-Inhibitor Nelfinavir in PC-3-Zellen. Der in vitro Effekt von Nelfinavir auf die Strahlenresistenz wurde dabei mithilfe eines Koloniebildungsassays nach Behandlung der Zellen mit 10 µM Nelfinavir getestet. In vivo wurde die Wirkung von Nelfinavir ohne sowie in Kombination mit Bestrahlung in PC-3-Xenografts in Nacktmäusen untersucht. Für die Bestimmung der Tumorwachstumszeit wurden die Mäuse mit 80 mg Nelfinavir/kg Körpergewicht 30 mal innerhalb von 6 Wochen behandelt. In einem weiteren Versuch wurde die lokale Tumorkontrolle bei gleichzeitiger fraktionierter Bestrahlung mit Gesamtdosen von 30 bis 120 Gy und einer Nachbeobachtungszeit von 180 Tagen bestimmt. Ergebnisse Die Untersuchungen zur Strahlenresistenz über den VEGF-C/NRP-2/Akt-Signalweg haben ergeben, dass in den drei Prostatakarzinomzelllinien PC-3, DU145 und LNCaP VEGF-C signifikant Strahlenresistenz vermittelt. Für NRP-2 hingegen wurde festgestellt, dass es in Abhängigkeit von der Zelllinie entweder zur Strahlenresistenz (DU145) oder zur Strahlensensibilisierung (PC-3) führt. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass durch VEGF-C in PC-3 und DU145 weder über Akt noch über ERK1/2 Strahlenresistenz vermittelt wird. Die Versuche zu Strahlenresistenz vermittelnden Mechanismen ergaben, dass VEGF-C in unbestrahlten PC-3-Zellen die Autophagie fördert, NRP-2 jedoch nicht. Unter Bestrahlung war ein Effekt von VEGF-C und NRP-2 auf die Autophagie nicht reproduzierbar nachweisbar. Ein weiterer Versuch hat gezeigt, dass in PC-3 Autophagie keinen Einfluss auf das klonogene Überleben nach Bestrahlung hat. Außerdem wurde festgestellt, dass VEGF-C in PC-3 die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nicht beeinflusst. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass eine Verminderung des VEGF-C-Gehalts in PC-3 zum G2/M-Arrest führt. In DU145 konnte jedoch kein Effekt beobachtet werden. In den Untersuchungen zum Einfluss von Akt auf die Strahlenresistenz unabhängig von VEGF-C und NRP-2 wirkte Nelfinavir inhibierend auf die Akt-Phosphorylierung am Ser473 und beeinflusste das klonogene Überleben von PC-3-Zellen minimal. In PC-3-Xenografts führte Nelfinavir zu keiner Tumorwachstumsverzögerung und wirkte in vitro und in vivo nicht strahlensensibilisierend. Schlussfolgerung In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass VEGF-C in Prostatakarzinomzellen Strahlenresistenz vermittelt. Diese Erkenntnis könnte als ein Forschungsansatz zur Entwicklung einer kombinierten Therapie aus VEGF-C-Blockade und Bestrahlung dienen. Ein potentieller Mechanismus, über den VEGF-C die Strahlenresistenz vermittelt, ist, in Abhängigkeit von der Zelllinie, die Aufhebung des G2/M-Arrests. NRP-2 wirkt in der Vermittlung von Strahlenresistenz beziehungsweise sensibilität je nach Zelllinie unterschiedlich. Hierzu sollten weitere Untersuchungen bezüglich möglicher Interaktionen innerhalb anderer Signalwege mit strahlensensibilisierendem Einfluss erfolgen. Innerhalb des untersuchten Signalwegs konnte weiterhin festgestellt werden, dass VEGF-C Strahlenresistenz nicht über Akt vermittelt. Die vorliegende Arbeit enthält die erste Studie sowohl zur Untersuchung des Einflusses von Nelfinavir in Kombination mit Bestrahlung auf das Überleben von Prostatakarzinomzellen in vitro als auch auf die Tumorwachstumszeit und die lokale Tumorkontrolle in vivo. Hierin konnte keine strahlensensibilisierende Wirkung von Nelfinavir nachgewiesen werden. Da Nelfinavir in Zellen anderer Tumorentitäten strahlensensibilisierend wirkt und außerdem bekannt ist, dass es in eine Reihe von Signalwegen eingreift, die das Zellüberleben fördern oder hemmen, sollte weiter geklärt werden, ob Tumorzellen mit einem bestimmten genetischen Profil besser auf die Behandlung mit Nelfinavir ansprechen.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege 6 2.3 Zellüberlebensstrategien 9 2.3.1 Autophagie 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 12 2.3.3 Zellzyklusarrest 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.1.1 Zelllinien 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen 17 3.1.3 Kits 19 3.1.4 Primäre Antikörper 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper 20 3.1.6 siRNA 20 3.1.7 Primer 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel 20 3.1.9 Geräte 21 3.1.10 Software 22 3.2 Methoden 22 3.2.1 Zellkultur 22 3.2.2 siRNA-Transfektion 23 3.2.3 Bestrahlung 24 3.2.4 Koloniebildungsassay 24 3.2.5 Autophagischer Flux 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay 31 3.2.9 Zellzyklusanalyse 33 3.2.10 Tierversuch 34 3.2.11 Statistische Auswertung 37 4 Ergebnisse 39 4.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF C- und NRP 2-Gehalte in den Zelllinien PC 3, DU145 und LNCaP 39 4.1.2 Etablierung der VEGF C- und NRP 2-siRNA-Transfektionen 39 4.1.3 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen 40 4.2 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 46 4.3.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz 46 4.3.2 Einfluss von VEGF C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle 56 5 Diskussion 59 5.1 VEGF C- und NRP 2-Expression und -Herunterregulierung 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz 60 5.4 VEGF C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz 62 5.6 Der Einfluss von VEGF C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 63 5.7 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 64 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC 3-Zellen in vitro und in vivo 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Abstract 72 8 Literaturverzeichnis 75 9 Abbildungsverzeichnis 89 10 Tabellenverzeichnis 90 Danksagung 92 Anhang 93 Anlage 1 94 Anlage 2 96 / Background In addition to radical prostatectomy, radiotherapy is a standard therapy for the treatment of prostate tumours and leads to good results for local tumour control and survival. However, as with the resection, the risk of recurrence for advanced tumours is relatively high compared to tumours in earlier stages. Therefore, there is a high urgency to improve radiotherapy especially for advanced stages. One approach is the combination of irradiation with molecular therapies. The aim is to block certain target proteins to increase the radiosensitivity of the prostate carcinoma cells. A potential target could be the blockade of the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway (VEGF-C – vascular endothelial growth factor C; NRP-2 – neuropilin 2; Akt – protein kinase B). In prostate cancer the concentrations of VEGF-C and NRP-2 are increased compared to normal prostate cells. Studies have shown that both proteins have a progressive effect on tumourigenesis. In preliminary work Muders et al. (2009) also showed the activation of Akt via the VEGF-C/NRP-2 axis and a resistance to H2O2 induced oxidative stress. Akt also has a protective effect against irradiation in various tumour entities. It is assumed that this also applies to prostate carcinoma cells. Aim of the study Within the framework of this thesis, it was investigated whether and via which mechanism VEGF-C, NRP-2, and Akt affect the radioresistance in prostate carcinoma cell lines. Methods In vitro and in vivo experiments were performed in the human prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, LNCaP, as well as in PC-3 xenografts. The influence of VEGF-C and NRP-2 on the radioresistance was examined in vitro after knock down of the corresponding genes using siRNA or after supplementation with human recombinant VEGF-C in colony formation assays. In order to determine the influence of VEGF-C and NRP-2 on possible cell survival mechanisms, the autophagic flux was examined after the blockade of autophagy with bafilomycin A1 using western blot, the DNA double strand break repair by quantification of the γH2AX foci, and the cell cycle distribution by flow cytometry. The signal transduction of VEGF-C via Akt as well as, as a further possibility, the signal transduction via ERK1/2 were tested after siRNA transfection with and without irradiation using western blot. Further experiments on Akt were performed in vitro and in vivo with the PI3K/Akt inhibitor nelfinavir in PC-3 cells. The in vitro effect of nelfinavir on radioresistance was tested using a colony formation assay after treatment of the cells with 10 μM nelfinavir. In vivo, the effect of nelfinavir without and in combination with irradiation in PC-3 xenografts was investigated in nude mice. For the determination of the tumour growth time, the mice were treated with 80 mg nelfinavir/kg body weight 30 times within 6 weeks. In a further experiment, the local tumour control was determined with simultaneous fractionated irradiation with total doses of 30 to 120 Gy and a follow-up time of 180 days. Results The investigations on radioresistance via the VEGF-C/NRP-2/Akt signalling pathway showed that in the three prostate carcinoma cell lines PC-3, DU145, and LNCaP VEGF-C significantly mediates radioresistance. For NRP-2 however, it was found that, depending on the cell line, it either leads to radioresistance (DU145) or radiosensitization (PC-3). Further, it was shown that in PC-3 and DU145 VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt or ERK1/2. The experiments on radioresistance mediating mechanisms revealed that VEGF-C promotes autophagy in untreated PC-3 cells, but NRP-2 does not. Under irradiation, an effect of VEGF-C and NRP-2 on autophagy could not be detected reproducibly. A further experiment has shown that in PC-3 autophagy has no influence on the clonogenic survival after irradiation. In addition, it was found that VEGF-C does not affect the DNA double strand break repair in PC-3. Furthermore, it was shown that a reduction in the VEGF-C content leads to a G2/M arrest in PC-3. However, no effect could be observed in DU145. In studies regarding the influence of Akt on radioresistance independent of VEGF-C and NRP-2, nelfinavir inhibited Akt phosphorylation at Ser473 and minimally affected the clonogenic survival of PC-3 cells. In PC-3 xenografts, nelfinavir did not lead to any tumour growth delay and did not have a radiosensitizing effect in vitro or in vivo. Conclusion In the experiments, it was shown that VEGF-C mediates radioresistance in prostate cancer cells. This finding could serve as a research approach for the development of a combined therapy of a VEGF-C blockade and irradiation. A potential mechanism by which VEGF-C mediates radioresistance is the reverse of the G2/M arrest, depending on the cell line. NRP-2 acts differently in the mediation of radioresistance or radiosensitivity, depending on the cell line. On this, further investigations should be carried out with regard to possible interactions within other signalling pathways with a radiosensitizing influence. Within the investigated signalling pathway, it was further shown that VEGF-C does not mediate radioresistance via Akt. The present work contains the first study examining the effect of nelfinavir in combination with irradiation on prostate cancer cell survival in vitro as well as on growth time and local tumour control in vivo. Herein no radiosensitizing effects of nelfinavir could be detected. Since nelfinavir radiosensitizes cells of other tumour entities and is also known to interfere with a series of signalling pathways that promote or inhibit cell survival, it should be clarified whether tumour cells with a particular genetic profile are more responsive to treatment with nelfinavir.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung und Zielstellung 1 2 Grundlagen 3 2.1 Zelluläre Auswirkungen der Bestrahlung 3 2.2 Überlebensfördernde Signalwege 6 2.3 Zellüberlebensstrategien 9 2.3.1 Autophagie 10 2.3.2 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 12 2.3.3 Zellzyklusarrest 13 2.4 Reaktionen von Tumoren auf Bestrahlung 14 2.5 Nelfinavir als Akt-Inhibitor 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Material 17 3.1.1 Zelllinien 17 3.1.2 Reagenzien und Substanzen 17 3.1.3 Kits 19 3.1.4 Primäre Antikörper 19 3.1.5 Sekundäre Antikörper 20 3.1.6 siRNA 20 3.1.7 Primer 20 3.1.8 Materialien und Hilfsmittel 20 3.1.9 Geräte 21 3.1.10 Software 22 3.2 Methoden 22 3.2.1 Zellkultur 22 3.2.2 siRNA-Transfektion 23 3.2.3 Bestrahlung 24 3.2.4 Koloniebildungsassay 24 3.2.5 Autophagischer Flux 26 3.2.6 Semiquantitative Proteinbestimmung 27 3.2.7 mRNA-Quantifizierung 29 3.2.8 γH2AX Foci-Assay 31 3.2.9 Zellzyklusanalyse 33 3.2.10 Tierversuch 34 3.2.11 Statistische Auswertung 37 4 Ergebnisse 39 4.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz 39 4.1.1 Betrachtung der VEGF C- und NRP 2-Gehalte in den Zelllinien PC 3, DU145 und LNCaP 39 4.1.2 Etablierung der VEGF C- und NRP 2-siRNA-Transfektionen 39 4.1.3 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Klonogenität bestrahlter Zellen 40 4.2 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf überlebensfördernde Signalwege unter Bestrahlung 42 4.2.1 Aktivierung des Akt-Signalwegs 43 4.2.2 Aktivierung des ERK1/2-Signalwegs 45 4.3 Untersuchungen zum Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Strahlenresistenz beeinflussende zelluläre und molekulare Prozesse 46 4.3.1 Einfluss von VEGF C und NRP 2 auf die Autophagie und deren Bedeutung für die Strahlenresistenz 46 4.3.2 Einfluss von VEGF C auf die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen 48 4.3.3 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 50 4.4 Inhibierung der Aktivierung von Akt durch Nelfinavir 52 4.4.1 Einfluss von Nelfinavir auf die Klonogenität in vitro 53 4.4.2 Tumorwachstumsverzögerung 54 4.4.3 Lokale Tumorkontrolle 56 5 Diskussion 59 5.1 VEGF C- und NRP 2-Expression und -Herunterregulierung 59 5.2 Der Einfluss von VEGF-C auf die Strahlenresistenz 59 5.3 Die Funktion von NRP-2 als Co-Rezeptor für VEGF-C bei der Vermittlung von Strahlenresistenz 60 5.4 VEGF C-abhängige Akt- und ERK1/2-Regulierung unter Bestrahlung 62 5.5 Der Einfluss der Autophagie auf die Strahlenresistenz 62 5.6 Der Einfluss von VEGF C auf die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur 63 5.7 Der Einfluss von VEGF C auf den Zellzyklus 64 5.8 Der Einfluss von Nelfinavir auf das Wachstum und auf die Strahlenresistenz von PC 3-Zellen in vitro und in vivo 65 5.9 Schlussfolgerung und Ausblick 67 6 Zusammenfassung 69 7 Abstract 72 8 Literaturverzeichnis 75 9 Abbildungsverzeichnis 89 10 Tabellenverzeichnis 90 Danksagung 92 Anhang 93 Anlage 1 94 Anlage 2 96