Les dysferlinopathies sont des dystrophies musculaires qui se manifestent par la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B) ou la myopathie de Miyoshi (MM). Elles sont causées par des mutations dans le gène dysferline. La dysferline est une protéine membranaire exprimée dans le muscle squelettique, responsable de la réparation des microlésions du sarcolemme. L’absence d’une telle réparation de la membrane entraîne une atrophie musculaire progressive. Ce travail de thèse explore le potentiel thérapeutique d'une stratégie de modulation d'épissage pour le traitement de la LGMD2B causée par la mutation faux-sens c4022T>C dans l'exon 38 du gène dysferline. Des oligonucléotides et des petits ARN U7 délivrés par un vecteur viral de type adéno-associé ont été utilisés comme outils antisens pour induire un saut d'exon in vitro et in vivo. Ce projet de thèse étudie également la capacité de la dysferline tronquée à se localiser de façon appropriée à la membrane et ainsi la réparer. / Dysferlinopathy is a muscular dystrophy that manifests as two major phenotypes: limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) or Miyoshi myopathy (MM). It is caused by mutations in the dysferlin gene. Dysferlin is a membrane protein expressed in skeletal muscle. It is responsible for the repair of sarcolemma microlesions produced by muscle contractions. A compromised membrane repair leads to slowly progressing muscle wasting. This thesis explores the therapeutic potential of an antisense mediated splice switching strategy in LGMD2B caused by the missense mutation c4022T>C in the exon 38 of the dysferlin gene. Antisense oligonucleotides and U7 snRNAs delivered by an adeno-associated viral vector were used as antisense tools to trigger exon skipping in vitro and in vivo. The thesis investigates also if the truncated dysferlin maintainsa proper membrane localization and its membrane repair ability.

Ancestral environmental conditions can instruct offspring development, although the mechanism(s) underlying such transgenerational epigenetic inheritance is unclear. In murine models focused on paternal dietary effects, we and others have identified tRNA fragments (tRFs) in mature sperm as potential carriers of epigenetic information. In our search for molecular targets of specific tRFs, we observed that altering the level of 5’-tRF Glycine-GCC (tRF-GG) in mouse embryonic stem cells (mESCs) and preimplantation embryos modulates the expression of the endogenous retrovirus MERV-L and genes regulated by MERV-L. Intriguingly, transient derepression of MERV-L is associated with totipotency of two-cell stage embryos and a subset of two-cell-like mESCs. Here, I reveal the mechanistic basis for tRF-GG regulation of MERV-L. I show that tRF-GG supports the production of numerous small nuclear RNAs associated with the Cajal body, in mouse and human embryonic stem cells. In particular, tRF-GG modulates the levels of U7 snRNA to ensure an adequate supply of histone proteins. This in turn safeguards heterochromatin-mediated transcriptional repression of MERV-L elements. Importantly, tRF-GG effects on histone mRNA levels, activity of a histone 3’UTR reporter, and expression of MERV-L associated transcripts can all be suppressed by appropriate manipulation of U7 RNA levels. I also show that hnRNPF and H bind directly to tRF-GG, and display a stark overlap of in vivo functions to tRF-GG. Together, this data uncovers a conserved mechanism for a 5’ tRNA fragment in the fine-tuning of a regulatory cascade to modulate global chromatin organization during pre-implantation development.

La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une maladie musculaire autosomique dominante rare. Cette pathologie est causée par la perte des marques épigénétiques répressives au macrosatellite D4Z4 en région subtélomérique du chromosome 4, ce qui conduit à la relaxation de la chromatine, l’expression aberrante du facteur de transcription DUX4 et la dérégulation de centaines de gènes. A ce jour, aucun traitement thérapeutique n’existe pour la FSHD. Le but de ce projet était de déterminer si cibler ou non par des oligonucléotides antisens (AOs) les séquences clés impliquées dans la polyadénylation des ARNm peut-être une stratégie thérapeutique pour inhiber l’expression de DUX4 chez les patients FSHD. En effet, le clivage et la polyadénylation en 3’ des ARNm sont des mécanismes fondamentaux de la maturation des ARNm nécessaires à leur export nucléaire, leur stabilité ou leur traduction efficace. Ces mécanismes représentent donc des cibles intéressantes pour une suppression de l’expression d’un gène dans des maladies à gain de fonction. Pour la première fois, nous avons pu montrer in vitro que l’utilisation d’AOs ciblant les séquences clés impliquées dans l’ajout d’une queue poly(A), notamment le signal de polyadénylation ou le site de clivage, conduit à une sous-expression de l’ARNm gène ciblé, et en particulier DUX4. Les AOs présentant in vivo une faible capacité à pénétrer les cellules et une forte clairance, les séquences des AOs les plus prometteurs ont été insérées dans un vecteur AAV sous promoteur U7. Les premiers résultats obtenus avec ces vecteurs sur un modèle murin sont prometteurs. Cette stratégie innovante apparait comme une option thérapeutique pour la FSHD. / FacioScapuloHumeral Dystrophy (FSHD) is a rare autosomal dominant neuromuscular disorder. This disease is caused by a loss of epigenetic marks within the D4Z4 macrosatellite located in the subtelomeric region of chromosome 4 leading to chromatin relaxation, aberrant expression of the DUX4 transcription factor and a cascade of gene deregulations. So far, there is no curative treatment for FSHD. The aim of this project was to determine whether or not targeting 3’-end key sequences involved in the polyadenylation of mRNA by antisens oligonucleotides (AOs) can be used as an efficient strategy for DUX4 gene silencing in FSHD. Indeed, cleavage and polyadenylation of the 3’-end of mRNAs are fundamental mechanisms of mRNAs maturation required for nuclear export, stability of the mRNAs and efficient translation and consequently could represent interesting targets for suppression of gene expression for gain of function diseases. For the first time, we demonstrated in vitro that targeting 3’-end key sequences involved in the addition of the poly(A) tail, such as the polyadenylation signal and the cleavage site, leads to an efficient extinction of the mRNA targeted and in particular DUX4. Because AOs have a weak cellular uptake and a rapid clearance in vivo, the sequences of the most promising AOs have been vectorised into an AAV vector under the control of the U7 promoter. The first results that we obtained with a FSHD mouse model treated with these vectors are promising. This innovating strategy appears as a therapeutic option for FSHD.

Les recherches présentées dans ce mémoire ont porté sur l'expression des gènes d'histones de type réplication-dépendants. Ces gènes sont particuliers car leurs ARNm sont dépourvus d'introns et de queue poly A en 3', l'extrémité 3' étant générée par coupure endonucléolytique au cours d'un processus de maturation original impliquant plusieurs protéines et la snRNP U7.<br /> Lors d'une première étude, nous avons étudié l'étape initiale de la réaction de maturation qui consiste en la fixation de la protéine HBP sur une structure de l'ARN pré-messager. À partir de mutants de HBP abolissant la fixation sur l'ARN nous avons sélectionné par la technique du triple hybride dans la levure des suppresseurs intragéniques permettant de restaurer cette fixation. La plupart des mutations isolées se situaient dans les domaines N- et C-terminaux de la protéine, en dehors du domaine central impliqué dans l'interaction avec l'ARN. Cette restauration s'effectuait sans perte de spécificité pour la séquence de fixation à l'ARN, suggérant que les domaines N- et C-terminaux sont impliqués dans le processus de reconnaissance de l'ARN.<br /> Dans un second volet de notre étude portant sur la réaction de maturation de l'extrémité 3' de l'ARNm d'histone, nous avons examiné l'impact structural induit par la protéine HBP lors de sa fixation sur les extrémités 3' non traduites des ARNs pré-messagers des histones H4-12, H1t et H2a-614. En utilisant les techniques de sondage en solution nous avons montré que ces extrémités présentent de fortes structures secondaires qui pourraient empêcher l'accès à la particule snRNP U7. Puis, nous avons montré que la fixation de la protéine HBP engendrait des changements de conformation de l'ARN au niveau de la séquence d'hybridation au snRNA U7. Enfin, nous avons pu montrer que ces changements de conformation étaient associés à une amélioration de l'ancrage du snRNA U7 à l'ARN pré-messager. Cependant, ce mécanisme n'est pas généralisable à l'ensemble des gènes d'histones puisque aucune modification importante n'a pu être détectée à l'extrémité 3' non traduite du gène d'histone H2a-614.<br />Enfin, nous avons étudié la traduction in vitro de l'ARNm H4-12 et montré qu'elle s'effectuait de façon très efficace en l'absence des régions 5' et 3' non codantes, suggérant que l'initiation de la traduction s'effectuerait par recrutement des ribosomes à l'intérieur de la phase codante. Par sondage en solution de l'ARNm entier, nous avons proposé un modèle de repliement secondaire dans lequel la séquence codante est circularisée par l'hybridation de ses extrémités. À l'aide d'ARNs anti-sens nous avons identifié un certain nombre de nucléotides essentiels pour le maintien d'une haute efficacité de traduction. L'ensemble des résultats obtenus lors des expériences de sondage en solution associés à ceux issus des études de traduction in vitro, de « toe print » et de microscopie électronique, ont conduit à l'établissement d'un modèle original permettant d'expliquer la traduction atypique de l'ARNm H4-12. La phase codante recruterait directement deux ribosomes à la manière de 2 sites d'entrée interne du ribosome ou « IRES ». Le premier ribosome serait recruté au niveau du codon d'initiation, le second près de la fin de la phase codante. Par le jeu de changements de conformation et grâce à la circularisation de l'ARNm, le deuxième ribosome pourrait être dirigé très efficacement sur le codon d'initiation. Cet enchaînement des deux ribosomes sur la phase codante permettrait d'expliquer d'une part, la grande efficacité de traduction observée dans le cas de notre modèle H4-12 et d'autre part, le rôle accessoire des séquences non traduites.