Phytate is the major storage form of phosphorus in seeds of soybeans. Because phytate chelates mineral cations including calcium, iron, and zinc, these mixed salts are often excreted by non-ruminant animals such as humans, swine, poultry, and fish. While this causes iron and zinc deficiencies, phytate is also considered a water pollutant due to the excess phosphorus excreted in animal waste. These negative environmental and nutritional effects, create a need for low phytate soybeans. While several low phytate soybean lines have been developed, a major drawback is the reduced seedling emergence of these lines resulting in low yields. Therefore, understanding the genetic and molecular bases of the low emergence trait in relation to seed phytate content in major crops such as soybean is of great economic importance. This PhD project worked towards the long term goal of developing low phytate soybean cultivars with good seedling emergence and high-yield. This dissertation focused on metabolomic differences between low and normal phytate lines and how these could relate to the low emergence phenotype. The genetic materials used here include four near isogenic lines that differ in mutations in two multi drug resistance-associated proteins (MRPs). Only the line with both mutations was low phytate. The phytate levels, field- and lab-based emergence rates were determined for these lines, their parents and a control line through replicated field experiments for three consecutive years. The emergence rates of the low phytate lines were not always reduced. This showed that the environment the seeds were produced in is highly important, especially when breeding and commercially growing low phytate lines. A protocol was developed for successful metabolomic discrimination of these closely related soybean lines. The polar and non-polar metabolite profiles were determined using ultra performance liquid chromatography mass spectrometry and metabolomic differences between the low and normal phytate lines were identified. The low phytate double mutant did not contain C22 glucose terminated Group A soyasaponins and almost exclusively contained C22 xylose terminated Group A soyasaponins (A4, A5 and A6). Compared to the normal phytate lines, the low phytate soybean line showed a higher concentration of storage lipids (triacylglycerols and diacylglycerols) and certain phospholipids. / Ph. D.

A extração por solvente é o método mais eficiente para recuperação do óleo residual de fibra prensada de palma (FPP), o qual pode conter um teor de carotenoides até oito vezes superior ao encontrado no óleo de palma bruto. Neste contexto, a escolha de potenciais solventes ou misturas de solventes torna-se essencial, pois elas podem resultar no efeito sinérgico de extração de óleo e carotenoides promovendo uma maior recuperação destes compostos de interesse. Dessa forma, o presente estudo objetivou a utilização de misturas binárias de solventes hidrocarbonetos e alcoólicos, a fim de promover a maior recuperação de um óleo de FPP rico em carotenoides. Para tanto, as composições das misturas compostas por hidrocarboneto (hexano, heptano e ciclohexano) e álcoois de cadeia curta (etanol e isopropanol) foram definidas a partir do cálculo da distância soluto-solvente (Ra) entre as misturas de solventes e o soluto β-caroteno. Os experimentos de extração foram conduzidos a 60 ± 2°C em um intervalo de tempo de 5 horas em extrator em batelada, utilizando os solventes hexano, heptano, ciclohexano, etanol e isopropanol e suas respectivas misturas, e a 55 ± 3 °C e um intervalo de tempo de 1 hora e 30 minutos, em coluna empacotada de leito fixo, utilizando hexano, etanol, isopropanol e suas respectivas misturas. Os resultados dos experimentos de extração, em batelada na razão mássica sólido:solvente de 1:7, indicaram que hexano e a mistura compreendida por heptano e isopropanol, extraíram o maior conteúdo de lipídeos, em torno de 80 % (em massa), enquanto que os demais solventes puros e misturas de solventes permitiram a obtenção de rendimentos de extração de óleo em torno de 70 % (em massa). Apesar dos solventes ciclohexano e hexano apresentarem a maior extração de carotenoides, o teor deste componente apresentou-se levemente inferior quando foram utilizadas as misturas binárias de solventes. Os maiores rendimentos de extração de óleo de FPP em coluna, na razão mássica sólido:solvente de 1:4, deram-se com o emprego de etanol e da mistura compreendida por hexano e isopropanol, em torno de 66 % (em massa), porém o conteúdo de carotenoides obtido foi o mesmo, independentemente do solvente ou misturas de solventes empregadas. O perfil de carotenoides analisados por UPLC/MS apresentou elevado conteúdo de β-caroteno extraído majoritariamente por hexano, enquanto que o maior conteúdo de α-caroteno foi obtido pela mistura de hexano e etanol, por último, etanol extraiu o maior conteúdo de licopeno. Nesta dissertação não foi observado, de forma expressiva, o sinergismo de extração de óleo de FPP rico em carotenoides com o emprego de misturas de solventes definidas a partir da estimativa dos Parâmetros de Solubilidade de Hansen (PSH) e cálculo da Ra. No entanto, é possível inferir os solventes hidrocarbonetos e suas misturas com os álcoois de cadeia curta, etanol e isopropanol, demonstraram boa habilidade em extrair óleo de FPP rico em carotenoides, mantendo sua composição em ácidos graxos e acidez livre relativamente constantes podendo, assim, serem indicados para operações de extração de óleo de FPP. As misturas de solventes empregadas nos experimentos de extração resultaram em considerável rendimento de óleo de FPP, rico em carotenoides totais mostrando que a substituição parcial de solventes hidrocarbonetos por álcoois de cadeia curta é possível. / Solvent extraction is the most efficient method for recovering palm pressed fiber (PPF) residual oil, which may contain up to eight times the carotenoid content of that found in crude palm oil. In this context, the choice of potential solvents or solvent mixtures becomes essential as they may result in the synergistic effect of extracting oil and carotenoids promoting further recovery of these compounds of interest. Thus, the present study aimed at the use of binary mixtures of hydrocarbon and alcoholic solvents, in order to promote the higher recovery of a carotenoid-rich PPF oil. The compositions of the mixtures composed of hydrocarbons (hexane, heptane, and cyclohexane) and short chain alcohols (ethanol and isopropanol) were defined from the calculation of the solute-solvent distance (Ra) between the solvent mixtures and the solute β-carotene. The extraction experiments were conducted at 60 ± 2 °C during 5 hours in a batch extractor, using the hexane, heptane, cyclohexane, ethanol and isopropanol solvents and their mixtures, and at 55 ± 3 °C and a time interval of 1 hour and 30 minutes in a packed bed column using hexane, ethanol, isopropanol and their mixtures. The results of the batch extraction experiments at the solid: solvent mass ratio of 1:7 indicated that hexane and the mixture comprised of heptane and isopropanol extracted the highest lipid content, around 80 % (by mass), while that the other pure solvents and solvent mixtures allowed to obtain oil extraction yields around 70 % (by mass). Although the solvents cyclohexane and hexane had the highest extraction of carotenoids, the content of this component was slightly lower when the binary solvent mixtures were used. The higher yields of oil extraction of PPF in the column in the solid: solvent mass ratio of 1:4 were given by using ethanol and the mixture comprised of hexane and isopropanol, around 66 % (by mass), but the carotenoids content obtained was the same regardless of the solvent or solvent mixtures employed. The profile of carotenoids analyzed in UPLC/MS showed a high content of β-carotene extracted mainly by hexane, while the highest content of α-carotene was obtained by the mixture of hexane and ethanol, finally, ethanol extracted the highest content of lycopene. In this dissertation, the synergism of extraction of PPF oil rich in carotenoids was not observed within the use of solvent mixtures defined from the estimation of Hansen Solubility Parameters (HSP) and calculation of Ra. However, it is possible to infer that the hydrocarbon solvents and their mixtures with the short-chain alcohols, ethanol, and isopropanol, demonstrated good ability to extract of PPF oil rich in carotenoids, maintaining its composition in fatty acids and free acidity constant being indicated for PPF oil extraction operations. The use of the solvent mixtures resulted in a considerable extraction yield of PPF oil, rich in total carotenoids showing that the partial replacement of hydrocarbon solvents by short chain alcohols is possible.

A extração por solvente é o método mais eficiente para recuperação do óleo residual de fibra prensada de palma (FPP), o qual pode conter um teor de carotenoides até oito vezes superior ao encontrado no óleo de palma bruto. Neste contexto, a escolha de potenciais solventes ou misturas de solventes torna-se essencial, pois elas podem resultar no efeito sinérgico de extração de óleo e carotenoides promovendo uma maior recuperação destes compostos de interesse. Dessa forma, o presente estudo objetivou a utilização de misturas binárias de solventes hidrocarbonetos e alcoólicos, a fim de promover a maior recuperação de um óleo de FPP rico em carotenoides. Para tanto, as composições das misturas compostas por hidrocarboneto (hexano, heptano e ciclohexano) e álcoois de cadeia curta (etanol e isopropanol) foram definidas a partir do cálculo da distância soluto-solvente (Ra) entre as misturas de solventes e o soluto β-caroteno. Os experimentos de extração foram conduzidos a 60 ± 2°C em um intervalo de tempo de 5 horas em extrator em batelada, utilizando os solventes hexano, heptano, ciclohexano, etanol e isopropanol e suas respectivas misturas, e a 55 ± 3 °C e um intervalo de tempo de 1 hora e 30 minutos, em coluna empacotada de leito fixo, utilizando hexano, etanol, isopropanol e suas respectivas misturas. Os resultados dos experimentos de extração, em batelada na razão mássica sólido:solvente de 1:7, indicaram que hexano e a mistura compreendida por heptano e isopropanol, extraíram o maior conteúdo de lipídeos, em torno de 80 % (em massa), enquanto que os demais solventes puros e misturas de solventes permitiram a obtenção de rendimentos de extração de óleo em torno de 70 % (em massa). Apesar dos solventes ciclohexano e hexano apresentarem a maior extração de carotenoides, o teor deste componente apresentou-se levemente inferior quando foram utilizadas as misturas binárias de solventes. Os maiores rendimentos de extração de óleo de FPP em coluna, na razão mássica sólido:solvente de 1:4, deram-se com o emprego de etanol e da mistura compreendida por hexano e isopropanol, em torno de 66 % (em massa), porém o conteúdo de carotenoides obtido foi o mesmo, independentemente do solvente ou misturas de solventes empregadas. O perfil de carotenoides analisados por UPLC/MS apresentou elevado conteúdo de β-caroteno extraído majoritariamente por hexano, enquanto que o maior conteúdo de α-caroteno foi obtido pela mistura de hexano e etanol, por último, etanol extraiu o maior conteúdo de licopeno. Nesta dissertação não foi observado, de forma expressiva, o sinergismo de extração de óleo de FPP rico em carotenoides com o emprego de misturas de solventes definidas a partir da estimativa dos Parâmetros de Solubilidade de Hansen (PSH) e cálculo da Ra. No entanto, é possível inferir os solventes hidrocarbonetos e suas misturas com os álcoois de cadeia curta, etanol e isopropanol, demonstraram boa habilidade em extrair óleo de FPP rico em carotenoides, mantendo sua composição em ácidos graxos e acidez livre relativamente constantes podendo, assim, serem indicados para operações de extração de óleo de FPP. As misturas de solventes empregadas nos experimentos de extração resultaram em considerável rendimento de óleo de FPP, rico em carotenoides totais mostrando que a substituição parcial de solventes hidrocarbonetos por álcoois de cadeia curta é possível. / Solvent extraction is the most efficient method for recovering palm pressed fiber (PPF) residual oil, which may contain up to eight times the carotenoid content of that found in crude palm oil. In this context, the choice of potential solvents or solvent mixtures becomes essential as they may result in the synergistic effect of extracting oil and carotenoids promoting further recovery of these compounds of interest. Thus, the present study aimed at the use of binary mixtures of hydrocarbon and alcoholic solvents, in order to promote the higher recovery of a carotenoid-rich PPF oil. The compositions of the mixtures composed of hydrocarbons (hexane, heptane, and cyclohexane) and short chain alcohols (ethanol and isopropanol) were defined from the calculation of the solute-solvent distance (Ra) between the solvent mixtures and the solute β-carotene. The extraction experiments were conducted at 60 ± 2 °C during 5 hours in a batch extractor, using the hexane, heptane, cyclohexane, ethanol and isopropanol solvents and their mixtures, and at 55 ± 3 °C and a time interval of 1 hour and 30 minutes in a packed bed column using hexane, ethanol, isopropanol and their mixtures. The results of the batch extraction experiments at the solid: solvent mass ratio of 1:7 indicated that hexane and the mixture comprised of heptane and isopropanol extracted the highest lipid content, around 80 % (by mass), while that the other pure solvents and solvent mixtures allowed to obtain oil extraction yields around 70 % (by mass). Although the solvents cyclohexane and hexane had the highest extraction of carotenoids, the content of this component was slightly lower when the binary solvent mixtures were used. The higher yields of oil extraction of PPF in the column in the solid: solvent mass ratio of 1:4 were given by using ethanol and the mixture comprised of hexane and isopropanol, around 66 % (by mass), but the carotenoids content obtained was the same regardless of the solvent or solvent mixtures employed. The profile of carotenoids analyzed in UPLC/MS showed a high content of β-carotene extracted mainly by hexane, while the highest content of α-carotene was obtained by the mixture of hexane and ethanol, finally, ethanol extracted the highest content of lycopene. In this dissertation, the synergism of extraction of PPF oil rich in carotenoids was not observed within the use of solvent mixtures defined from the estimation of Hansen Solubility Parameters (HSP) and calculation of Ra. However, it is possible to infer that the hydrocarbon solvents and their mixtures with the short-chain alcohols, ethanol, and isopropanol, demonstrated good ability to extract of PPF oil rich in carotenoids, maintaining its composition in fatty acids and free acidity constant being indicated for PPF oil extraction operations. The use of the solvent mixtures resulted in a considerable extraction yield of PPF oil, rich in total carotenoids showing that the partial replacement of hydrocarbon solvents by short chain alcohols is possible.

Glycosaminoglycans (GAGs) are a family of linear bio-polysaccharides, which are heterogeneously modified with negatively charged sulfate and carboxylate groups. They are located on every cell surface, extracellular matrix or intracellular space in the body. GAGs are composed of alternating units of an amino sugars (glucosamine or galactosamine) and hexuronic acid/hexose (iduronic acid, glucoronic acid/ or galactose), which are linked by glycosidic bonds with different geometries. In recent years, GAGs have attracted considerable interest. GAGs play vital roles in fundamental biological processes, such as hemostasis, angiogenesis, cell signaling, growth and differentiation. Thus, GAGs contribute to a number of diseases such as thrombosis, cancer, inflammation, osteoarthritis and degenerative diseases. One of the most studied GAGs is heparin, which is widely used as an anticoagulant and is also implicated in other biological processes. Despite its extensive clinical use, heparin continues to suffer from major problems, such as life threatening hemorrhagic complications and heparin-induced thrombocytopenia. These activities originate from the large number of glycan sequences generated during its biosynthesis. Many different enzymes act in a non-template fashion to produce heparin chains with various chain lengths, sulfation and acetylation patterns. Their inherent heterogeneity, complexity and highly anionic nature have seriously limited the development of tools for rapid identification of sequences critical for many biological activities. A RPIP-UPLC MS protocol was developed to separate and characterize structures of heparin oligosaccharides prepared through enzymatic cleavage process and chemoenzymatic synthesis. In designing such protocol, several UPLC and MS parameters were considered. An efficient separation of each oligosaccharide mixture was achieved with different ion-pairing reagents. Yet, the structural elucidation of the multiple chromatographic peaks was hindered by the heterogeneity inherent in these mixtures even with supposedly defined standards. In order to elucidate the structures of these complex molecules, we utilized a strategy, which exploits the ease with which sulfate groups can be fragmented during MS ionization. A systematic increment of the MS cone voltage was employed starting from a minimum dissociation voltage, where the intact molecule is preserved, to a high enough dissociation voltage, where the only core oligosaccharide backbone was retained. This allowed identifying the number of sulfate groups and the core structures. However, positions of substituents were difficult to pinpoint because of the phenomenal number of possibilities. Such analysis would require tandem MS/MS–based approaches.

O relevante conceito de sustentabilidade dos dias atuais leva a população a pensar no tratamento dos recursos naturais e principalmente na qualidade e escassez da água. A grave problemática quanto à gestão dos resíduos urbanos no país, desde sua produção, coleta e disposição final são os desafios colocado aos municípios e a sociedade em geral. O uso cada vez mais abundante dos medicamentos farmacêuticos gera uma demanda de resíduos que acabam atingindo os leitos dos rios. Com avanço das tecnologias é possível monitorar e conhecer os resíduos que afetam indiretamente e diretamente as águas das bacias hidrográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a determinação dos resíduos de fármacos (ácido acetil salicílico, diclorofenaco de sódio, paracetamol, ibuprofeno e fenoprofeno) em águas utilizando a cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de massas tipo tandem (UPLC-MS/MS). Foram utilizadas duas fases moveis distintas. Para os fármacos paracetamol e diclofenaco foi utilizado como fase móvel água: metanol (1:1; V/V) com adição de ácido fórmico e a ionização de eletrospray em modo positivo; para os fármacos acetil salicílico, ibuprofeno e fenoprofeno foi utilizado água: metanol (1:1; v/v) com adição de acetato de amônio e a ionização de eletrospray em modo negativo. O desempenho do método foi avaliado quanto aos seguintes parâmetros: especificidade e seletividade, faixa de trabalho, linearidade; limite de detecção e limite de quantificação, exatidão, robustez e incerteza de medição. Os resultados obtidos comprovaram a adequabilidade do método ao propósito supracitado. Os valores obtidos para o limite de decisão (ccα) e capabilidade de detecção (ccβ) foram: paracetamol 0,21 e 0,34 μg L -1; diclofenaco 2,42 e 3,24 μg L -1 ; AAS 1,56 e 2,45 μg L -1; ibuprofeno 2,34 e 3,21 μg L -1 e fenoprofeno 1,89 e 2,33 μg L-1, respectivamente. A metodologia foi aplicada na caracterização de amostras de água superficial (bruta) e tratada proveniente de áreas de captação e de tratamento de água da bacia hidrográfica do Paraíba do Sul. Foram realizadas duas coletas distintas, setembro/ 2010 e novembro/ 2010, nos municípios de Guararema, São José dos Campos, Taubaté e Pindamonhangaba. Em 31,2 % das amostras, Cinco amostras de água bruta das 16 amostras analisadas, foram encontrados resíduos de paracetamol. Os resultados obtidos apresentaram-se em uma faixa de concentração de 0,10 a 0,50 μg L -1. / The relevant concept of sustainability of the present day leads people to think about the treatment of natural resources and particularly in the quanlity and scarcity of water. The serious problems regarding the management of municipal waste in the country, from production, collection and disposal are the challenges facing municipalities and society in general. The increasing use of pharmaceutical drugs most abundant generates a demand for waste that eventually reach the river beds. With advancement of technologies and know you can monitor the waste that directly and indirectly affect the waters of river basins. The objective of this study was to develop and validade analytical methods for residues of drugs (aspirin, sodium diclofenac, paracetamol, ibuprofen and fenoprofen) in water using ultra performance liquida chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). We used two different mobile phases. For the drugs paracetamol and diclofenac was used as mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of formic acid in positive electrospray ionization mode. For drugs acetyl salicylic acid, ibuprofen and fenoprofen was used mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of ammonium acetate and negative electrospray ionization mode. The performance of the method was evaluated on the following parameters: specificity and selectivity, working range, lineariry, limit of detection and limit of quantification, accuracy, ruggedness and uncertainty measurement. The result obtained proved the suitability of the method for fit purpose. The values obtained for the decision limit (ccα) and detection capability (ccβ) were 0.21 and 0.34 μg L-1, diclofenac 2.42 and 3.24 μgL-1, ASA 1.56 and 2.45 μgL-1, respectively. The methodology was applied in the characterization of samples of surface water (raw) and treated from catchment areas and water treatment basin of Paraíba do sul were two distinct collections, September/2011 and November 2010 in the municipalities of Guararema, São José dos Campos, Taubaté and Pindamonhangaba. In 32,2% of all samples, five samples of 16 raw water samples, residues were found for paracetamol. The results were presented in a concentration range from 0.10 to 0.50 μg L-1.

O relevante conceito de sustentabilidade dos dias atuais leva a população a pensar no tratamento dos recursos naturais e principalmente na qualidade e escassez da água. A grave problemática quanto à gestão dos resíduos urbanos no país, desde sua produção, coleta e disposição final são os desafios colocado aos municípios e a sociedade em geral. O uso cada vez mais abundante dos medicamentos farmacêuticos gera uma demanda de resíduos que acabam atingindo os leitos dos rios. Com avanço das tecnologias é possível monitorar e conhecer os resíduos que afetam indiretamente e diretamente as águas das bacias hidrográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a determinação dos resíduos de fármacos (ácido acetil salicílico, diclorofenaco de sódio, paracetamol, ibuprofeno e fenoprofeno) em águas utilizando a cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de massas tipo tandem (UPLC-MS/MS). Foram utilizadas duas fases moveis distintas. Para os fármacos paracetamol e diclofenaco foi utilizado como fase móvel água: metanol (1:1; V/V) com adição de ácido fórmico e a ionização de eletrospray em modo positivo; para os fármacos acetil salicílico, ibuprofeno e fenoprofeno foi utilizado água: metanol (1:1; v/v) com adição de acetato de amônio e a ionização de eletrospray em modo negativo. O desempenho do método foi avaliado quanto aos seguintes parâmetros: especificidade e seletividade, faixa de trabalho, linearidade; limite de detecção e limite de quantificação, exatidão, robustez e incerteza de medição. Os resultados obtidos comprovaram a adequabilidade do método ao propósito supracitado. Os valores obtidos para o limite de decisão (ccα) e capabilidade de detecção (ccβ) foram: paracetamol 0,21 e 0,34 μg L -1; diclofenaco 2,42 e 3,24 μg L -1 ; AAS 1,56 e 2,45 μg L -1; ibuprofeno 2,34 e 3,21 μg L -1 e fenoprofeno 1,89 e 2,33 μg L-1, respectivamente. A metodologia foi aplicada na caracterização de amostras de água superficial (bruta) e tratada proveniente de áreas de captação e de tratamento de água da bacia hidrográfica do Paraíba do Sul. Foram realizadas duas coletas distintas, setembro/ 2010 e novembro/ 2010, nos municípios de Guararema, São José dos Campos, Taubaté e Pindamonhangaba. Em 31,2 % das amostras, Cinco amostras de água bruta das 16 amostras analisadas, foram encontrados resíduos de paracetamol. Os resultados obtidos apresentaram-se em uma faixa de concentração de 0,10 a 0,50 μg L -1. / The relevant concept of sustainability of the present day leads people to think about the treatment of natural resources and particularly in the quanlity and scarcity of water. The serious problems regarding the management of municipal waste in the country, from production, collection and disposal are the challenges facing municipalities and society in general. The increasing use of pharmaceutical drugs most abundant generates a demand for waste that eventually reach the river beds. With advancement of technologies and know you can monitor the waste that directly and indirectly affect the waters of river basins. The objective of this study was to develop and validade analytical methods for residues of drugs (aspirin, sodium diclofenac, paracetamol, ibuprofen and fenoprofen) in water using ultra performance liquida chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). We used two different mobile phases. For the drugs paracetamol and diclofenac was used as mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of formic acid in positive electrospray ionization mode. For drugs acetyl salicylic acid, ibuprofen and fenoprofen was used mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of ammonium acetate and negative electrospray ionization mode. The performance of the method was evaluated on the following parameters: specificity and selectivity, working range, lineariry, limit of detection and limit of quantification, accuracy, ruggedness and uncertainty measurement. The result obtained proved the suitability of the method for fit purpose. The values obtained for the decision limit (ccα) and detection capability (ccβ) were 0.21 and 0.34 μg L-1, diclofenac 2.42 and 3.24 μgL-1, ASA 1.56 and 2.45 μgL-1, respectively. The methodology was applied in the characterization of samples of surface water (raw) and treated from catchment areas and water treatment basin of Paraíba do sul were two distinct collections, September/2011 and November 2010 in the municipalities of Guararema, São José dos Campos, Taubaté and Pindamonhangaba. In 32,2% of all samples, five samples of 16 raw water samples, residues were found for paracetamol. The results were presented in a concentration range from 0.10 to 0.50 μg L-1.

Malgré les progrès évidents sur la compréhension de la carcinogénèse, l’incidence des cancers est toujours en augmentation. C’est pourquoi les besoins en nouveaux traitements sont importants. Notre travail de thèse a porté sur l’évaluation pharmacologique d’une nouvelle molécule anticancéreuse, l’OTX015. Cette petite molécule de synthèse a la propriété d’inhiber les protéines bromodomaines (famille des BET) qui jouent un rôle clé dans les mécanismes épigénétiques et dont la dérégulation favorise l’apparition de cancers en particulier des hémopathies malignes. Des études précliniques in vitro sur plusieurs lignées cellulaires d’hémopathies malignes et in vivo sur des souris xénogreffées ont permis de mettre en évidence les propriétés antitumorales de l’OTX015. Une méthode de dosage des concentrations plasmatiques d’OTX015 par UPLC-MS/MS a été développée et validée afin d’évaluer sa pharmacocinétique chez les patients inclus dans un protocole d’escalade de doses de phase I. Dans un premier temps, la PK de l’OTX015 a été modélisée par une approche de population et dans un second temps un modèle PK-PD a été construit pour pouvoir évaluer le profil de la tolérance (nombreuses thrombopénies) de cette nouvelle molécule. / Despite obvious progress in carcinogenesis understanding, the incidence of cancer is still increasing. Therefore, the need of new treatments remains important. Our thesis focused on the pharmacological evaluation of a new anticancer drug, OTX015. This small synthetic molecule inhibits the bromodomain proteins (BET) that play a key role in epigenetic mechanisms. Downregulation of BRDs promotes cancer occurrence including hematological malignancies. Preclinical evidences obtained from in vitro and in vivo studies in xenograft mice, suggest that OTX015 has antitumor properties. An ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection method was developed and validated in order to measure OTX015 plasma concentrations. Its pharmacokinetics in patients enrolled in a phase I dose-escalation study was then evaluated. The OTX015 PK parameters were estimated by a population approach and PK-PD modeling was developed in order to evaluate the tolerance and safety (thrombocytopenia) of this new drug.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The storage and handling points of agricultural sprayers on farms are a contamination point source of punctual contamination in case of accidental spills of concentrated pesticide and / or leaks, among others. In order to avoid possible environmental contaminations, since the decade of 90 s have been developed biobed systems, where the handling of pesticides as well as agricultural implements washing are discharded on a mixture of straw, soil and peat (biomix). This mixture has the ability to retain and subsequently biodegrade pesticides. In this study was validated an analytical method applied for routine analysis to determine the organophosphate pesticide chlorpyrifos in biobeds. The method is based on 5 g sample extraction with 30 mL of acetone acidified with phosphoric acid 98:1:1 (v/v/v). After homogenization, centrifugation and filtration, 125 μL of the extract was evaporated and reconstituted in 5 mL of methanol acidified with 0.1% acetic acid. The analysis was performed on a liquid chromatographic system coupled to a tandem mass spectrometer (UPLC-MS/MS). The validation parameters evaluated were calibration curve linearity (r2), accuracy (spike and recovery %), limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of the instrument and the method, precision (RSD%) and matrix effect. To the linearity study analytical solutions were prepared in organic solvent and matrix extract at 0.1; 0.5; 1; 5; 20; 100; 250 ng mL-1. The recovery study was conducted on samples spiked at three concentrations (2, 10 and 50 mg kg-1) with seven replicates (n = 7) for each concentration and the values obtained were between 96 and 115% with RSD values lower than 20 % for all three concentration levels studied. The real LOQ obtained was 2 mg kg-1 and the matrix effect observed was lower than ± 20%, which demonstrates that there is not considerable suppression or enhancement in the analyte signal. The biobed system efficiently degraded chlorpyrifos in both 1) simulation of accidental spillage and 2) application of diluted pesticide solution. In the latter case, all the values obtained at the final sampling time (14 months) were below the real LOQm. / Os pontos de estocagem e manuseio de pulverizadores agrícolas em fazendas são uma fonte de contaminação pontual no caso de derrames acidentais do agrotóxico concentrado e/ou vazamentos. A fim de evitar possíveis contaminações ambientais, desde a década de 90 tem sido desenvolvidos sistemas de camas biológicas, onde o manejo de agrotóxicos bem como a lavagem de implementos agrícolas é feito sobre uma mistura de palha, solo e turfa. Esta biomistura tem a capacidade de reter e posteriormente biodegradar os agrotóxicos. Neste estudo foi validado um método para análises de rotina para determinação do agrotóxico organofosforado clorpirifós em camas biológicas. O método baseia-se na extração de 5 gramas de amostra com 30 mL de uma solução de acetona acidificada com ácido fosfórico 98:1:1 (v/v/v). Após homogeneização, centrifugação e filtração, 125 μL do extrato foi evaporado e reconstituído em 5 mL de metanol acidificado com 0,1% de ácido acético. A análise foi realizada em um sistema de cromatografia líquida acoplado a um espectrômetro de massas tandem (UPLC-MS/MS). Os parâmetros de validação avaliados foram linearidade da curva analítica (r2), exatidão (fortificação e recuperação em %), limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) do instrumento e do método, precisão (RSD %) e efeito matriz. Para o estudo de linearidade as soluções analíticas foram preparadas em solvente orgânico e em extrato de matriz, a 0,1; 0,5; 1; 5; 20; 100; 250 ng mL-1. O estudo de recuperação foi realizado em amostras fortificadas em três concentrações (2, 10 e 50 mg kg-1) repetido sete vezes (n=7) para cada concentração. Os valores obtidos ficaram entre 96 e 115% com valores de RSD inferiores a 20% para os três níveis de concentração estudados. O LOQ real obtido foi 2 mg kg-1. O efeito matriz observado foi inferior a ± 20%, o que demonstra que não há supressão ou aumento considerável no sinal do analito. O sistema de camas biológicas foi eficiente para a degradação de clorpirifós em ambos 1) simulação de derrame acidental e 2) aplicação de solução diluída do agrotóxico. Neste último caso, todos os valores obtidos ao final das etapas de amostragem (14 meses) ficaram abaixo do LOQm real.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Orange juice is a relevant contribution to the Brazilian economy, as long as five glasses of orange juice consumed in the world, three are produced in Brazil. For the purpose of increase the production of fruits and, consequently, juices, there is a growing concern about the presence of pesticide residues in food, so monitoring by analytical methods is required in order to ensure consumer s health. This study shows the validation of an analytical method for the determination of nine fungicides in natural and processed orange juices by UPLC-MS/MS. The extraction procedure used was the modified mini-Luke method. Developed in 1975, it was modified in later years and has been used to monitor the presence of pesticides in non-fatty matrices such as fruits and vegetables. The method consists of adding 30 mL of acetone followed by 60 mL of 1:1 (v/v) mixture of petroleum ether and dichloromethane to 15 g of sample. After homogenization and centrifugation, an aliquot of 1.2 mL was transferred into tubes and evaporation led to a water bath to near dryness. The residue was reconstituted in 1 mL of methanol containing 0.1% acetic acid and analyzed by UPLC-MS/MS. The parameters evaluated for the validation were: calibration curve and linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy (as recovery%), precision (as RSD %) and selectivity (as matrix effects%). The results were satisfactory for all parameters, thus showing that the modified mini-Luke extraction method was effective to extract the studied fungicides in natural and processed orange juices. In the range of concentration studied, the method was linear. The method LOQ were 10, 20 and 50μg kg-1 for six, two and one fungicides studied, respectively. It is noted that these values are the same or below the values of the maximum residue limits (MRL) established by Brazilian, American and European laws, indicating that the method can be used worldwide to determine the nine fungicides studied in orange juice.It can be inferred that the method is selective, as long as this parameter was assessed from the matrix effects. It was negative for most of the fungicides studied and all values remained in the range -20 to +20%, not influencing the results. The analyzed fungicides, show average recoveries between 70 and 120%, only excepting thiophanate - methyl and carbendazin. The thiophanate-methyl presented values below 70% when spiked at concentrations of 10 and 20 μg kg 1 and carbendazim presented values above 120% when spiked at concentrations of 10 μg kg 1. The extraction method, combined with modern chromatographic technique for the determination of analytes, were effective for the analysis of pesticide residues in orange juice. / O suco de laranja representa uma contribuição relevante para a economia brasileira, uma vez que, de cada cinco copos de suco de laranja consumidos no mundo, três são produzidos no Brasil. A fim de aumentar a produção de frutas e, consequentemente, de sucos, também é verificado um aumento na preocupação quanto à presença de resíduos de agrotóxicos em matrizes alimentares, fazendo-se necessário o monitoramento, através de métodos analíticos para, assim assegurar a saúde do consumidor. Neste estudo, foi validado um método analítico para determinação de nove fungicidas em sucos de laranja natural e processado por UPLC-MS/MS. Para a extração dos fungicidas da matriz, utilizou-se o método denominado mini-Luke modificado. Desenvolvido no ano de 1975, sofreu algumas modificações nos anos posteriores e tem sido utilizado para monitorar a presença de agrotóxicos em matrizes não gordurosas como frutas e vegetais. O método consiste na adição de 30 mL de acetona, seguidos de 60 mL da mistura 1:1 (v/v) de éter de petróleo e diclorometano em 15 g de amostra. Após homogeneização e centrifugação, foi retirada uma alíquota de 1,2 mL do extrato, que após evaporação, foi ressuspendido em 1 mL de metanol acidificado com 0,1% de ácido acético e analisado por UPLC-MS/MS. Os parâmetros avaliados para validação do método foram: curva analítica e linearidade, limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), exatidão (recuperação%), precisão (RSD%) e seletividade (efeito matriz%). Os resultados obtidos foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, mostrando desta forma, que o método de extração mini-Luke modificado foi eficaz para extrair os fungicidas estudados em sucos de laranja natural e processado. Na faixa de concentração estudada, o método mostrou-se linear. Os valores de LOQ do método foram de 10, 20 e 50 μg kg-1 para seis, dois e um fungicidas estudados, respectivamente. Salienta-se que estes valores são iguais ou inferiores aos valores dos limites máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pelas legislações brasileira, americana e européia, indicando que o método pode ser empregado a nível mundial para determinar os nove fungicidas estudados em sucos de laranja. Pode-se afirmar que o método é seletivo, uma vez que este parâmetro foi avaliado a partir do efeito matriz, o qual para a maioria dos fungicidas estudados foi negativo, e todos os valores permaneceram na faixa de -20 e +20%, não influenciando os resultados. Os fungicidas estudados apresentaram valores de recuperação dentro da faixa de 70 a 120% com exceção do tiofanato-metílico e do carbendazim. O tiofanato-metílico apresentou valores abaixo de 70% para os níveis de fortificação de 10 e 20 μg kg-1 e o carbendazim, valores acima de 120% para o nível de fortificação de 10 μg kg-1. O método de extração, aliado com a técnica cromatográfica para determinação dos analitos, mostraram-se eficientes para a análise de resíduos de agrotóxicos em sucos de laranja.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The optimization and validation of an analytical method for 51 pesticides determination in tomato, using UPLC-MS/MS, was developed in order to fulfill the requirement 5.4.5 (Method Validation) of the NBR ISO/IEC 17025:2005 and following the orientation document DOQ-CGCRE-008 (Orientation of analytical methods validation). This item is very important to a laboratory to be accredited by INMETRO (Brazilian accreditation body). The method validation was carried out following all the validation parameters, such as linearity of the analytical curves, limits of detection and quantification, matrix effects, accuracy and precision of the method. The studied compounds in this work were determined by UPLC-MS/MS in the positive ESI ionization mode. The stock solutions of the pesticides were prepared in organic solvent compatible with the compound solubility. These solutions were prepared by two different analysts in order to validate the preparation by comparing the areas of the injections (n=7) of each individual solution. After evaluation, 43 from 51 studied solutions showed results between the acceptable range of ± 10% demonstrating the satisfactory quality of solutions preparation. The evaluated pesticides were extracted from tomatoes applying the mini Luke method with a mixture 1:1:1 (v/v/v) of each acetone/petroleum ether/dichloromethane solvent as extraction solvent. After extraction, the organic solvent extract was evaporate and reconstituted in appropriate solvent (acidified methanol with 0.1% acetic acid) for UPLC-MS/MS analysis. The recovery experiments were done at 10, 20 and 50 μg kg-1 spike levels, by two analysts in different days, and 7 replicates (n=7) for each spike level plus the blank matrix (without pesticides). The limits of detection and quantification for the instrument and method were estimated, as well as the linearity of the analytical curves evaluated based on determination coefficient (r²), dynamic linear range, accuracy by recovery experiments (%), precision (RSD%) and matrix effect. From the 51 studied compounds, 46 showed recoveries between the range of 81 115% for all the evaluated spike levels. About precision, 92% of the compounds showed RSD% below 18.7% in the lowest spike level. The quantification limit of the method, for 82% from all evaluated compounds, was the lowest spike level studied (10 μg kg-1). The matrix effect observed was between ± 20% for all evaluated compounds, showing that there is not considerable suppression or enhancement in the analytes signal. For all evaluated pesticides the intermediate precision was below 20% of RSD showing the good repeatability of the method. / O desenvolvimento e validação do método analítico para determinação de 51 agrotóxicos em tomate por UPLC-MS/MS foi realizado a fim de atender ao requisito 5.4.5 (Validação de Métodos) da norma NBR ISO/IEC 17025:2005 e seguindo o documento orientativo DOQ-CGCRE-008 (Orientação sobre validação de métodos analíticos). Esse item descrito na norma é de fundamental importância para que o laboratório possa ser acreditado pelo INMETRO. A validação do método seguiu todos os parâmetros de validação, tal como a linearidade das curvas analíticas, limites de detecção e quantificação, efeito matriz, exatidão e precisão do método. Os agrotóxicos estudados neste trabalho foram determinados por UPLC- MS/MS no modo de ionização ESI positivo. As soluções estoque dos agrotóxicos foram preparadas em solvente orgânico compatível com a solubilidade de cada substância. Essas soluções foram preparadas por dois analistas distintos a fim de validar o preparo dessas a partir da comparação das áreas das injeções realizadas (n=7) de cada solução individual. Após avaliação, 43 das 51 soluções estudadas mostraram resultados dentro da faixa de ± 10% demonstrando a excelente qualidade no preparo dessas soluções. Os agrotóxicos estudados foram extraídos das amostras de tomate utilizando o método mini Luke o qual faz o uso de uma mistura 1:1: 1 (v/v/v) de acetona/éter de petróleo/diclorometano como solvente extrator. Após extração, o extrato em solvente orgânico foi evaporado e ressuspendido em solvente apropriado (metanol acidificado com 0,1% ácido acético) para análise por UPLC-MS/MS. O estudo de fortificação e recuperação dos analitos foi realizado nas concentrações de 10, 20 e 50 μg kg-1, por dois analistas, e 7 replicatas (n=7) para cada concentração, além das amostras branco (sem conter os agrotóxicos). Os limites de detecção e quantificação do instrumento e do método foram determinados, bem como a linearidade das curvas analíticas avaliadas através do coeficiente de determinação (r²), faixa linear dinâmica de trabalho, exatidão através do estudo de fortificação e recuperação (%) dos analitos, precisão (RSD%) e efeito matriz. Dos 51 agrotóxicos estudados, 46 apresentaram recuperação média na faixa de 81 a 115 % para todas as concentrações avaliadas. Com relação à precisão, 92% dos agrotóxicos demonstraram RSD% abaixo de 18,7% na menor concentração de fortificação. O limite de quantificação do método, para 82% dos agrotóxicos, foi a concentração de fortificação mais baixa estudada (10 μg kg-1). O efeito matriz observado foi inferior a ± 20% para todos os agrotóxicos avaliados, demonstrando assim que não há supressão ou aumento considerável no sinal do analito. Para todos os agrotóxicos estudados os resultados de precisão intermediária (onde foram avaliados diferentes analistas em diferentes dias) ficaram abaixo de 20% demonstrando a repetitividade satisfatória do método proposto.