The objective of my thesis was to develop novel techniques and methods to probe the dielectric properties of biomembranes in air and their natural environment - liquid solution. The dielectric constant ε(r) of biomembranes is a parameter especially important in cell electrophysiology as it ultimately determines the ion membrane permeability, the membrane potential formation or the action potential propagation velocity, among others. However, no technique is able to provide this quantity with the required nanoscale spatial resolution and in electrolyte solution. AFM is an extremely versatile tool to investigate electric properties at the nanoscale, and hence constitutes a good candidate technique to approach the quantification of the nanoscale dielectric properties of biomembranes. Although a few AFM techniques exist, capable of investigating polarization properties, it remains difficult to extract quantitative values of εr from the measurements, especially in liquid environment. One reason for this is on the instrumental side, since for studies at the nanoscale very small quantities have to be measured, that can be easily overwhelmed by electronic noise as it maybe for example the case in current sensing based techniques. Electrostatic Force sensing techniques may in principle have an advantage here, since the used cantilevers for force detection are extremely sensitive and naturally, undesired nonlocal electrical signals from the cantilever are suppressed. Another important aspect is attributed to a lack of sufficiently precise quantitative models to relate measured force with the dielectric constant value of the sample. Indeed, for measurements on insulating substrates like mica or glass that are sometimes required for biological samples, still no quantitative model is available. Moreover, successful measurements of dielectric properties in liquid media, that is fundamental for the functionality of some biological samples, has not been shown until now. As consequence of the existing limitations for quantitative dielectric imaging the objectives of this work were to extend the quantitative capabilities of Electrostatic Force Microscopy to image the dielectric constant of biomembranes with nanoscale spatial resolution. In particular, the three objectives I addressed in the work are: 1. To evaluate the possibility to perform quantitative dielectric measurement on biomembranes on metallic substrates and in air with Electrostatic Force Microscopy that may offer higher precision with respect to current sensing techniques. 2. To extend the applicability of quantitative dielectric measurement to the case of thick insulating substrates in order to facilitate its use with biomembranes that cannot be prepared on metallic substrates. 3. To develop a setup for dielectric imaging in liquid environment based either on current detection or on the principles of electrostatic force microscopy. Finally to perform nanoscale dielectric measurements on bio-membranes in their natural liquid environment. How each of these objectives could be reached is detailed in my thesis. / El objetivo de mi tesis era desarrollar nuevas técnicas y métodos para medir las propiedades dieléctricas de biomembranas en aire y en su medio natural, es decir, en solución líquida. La constante dieléctrica (εr) de las biomembramas es un parámetro especialmente importante en la electrofisiología celular, ya que fundamentalmente determina la permeabilidad iónica de la membrana, la formación del potencial de membrana o la velocidad de propagación del potencial de acción, entre otros. El AFM es una herramienta extremadamente versátil para investigar propiedades eléctricas a nanoescala, y por ello constituye una buena técnica candidata para la cuantificación de las propiedades dieléctricas de las biomembranas a nanoescala. Aunque existen algunas técnicas basadas en el AFM capaces de investigar las propiedades de polarización, continúa siendo difícil extraer valores cuantitativos de εr de las medidas, especialmente en medio líquido. Una de las razones radica en la parte instrumental, ya que para los estudios en la nanoescala tienen que medirse cantidades muy pequeñas, y este proceso puede verse entorpecido por ruido electrónico como puede ser el caso, por ejemplo, en las técnicas basadas en la detección de corriente eléctrica. En principio, las técnicas de detección de fuerza electroestática disponen aquí de una ventaja, ya que las sondas utilizadas para la detección de la fuerza son extremadamente sensibles y naturalmente se suprimen señales eléctricas no locales y no deseadas. Otro aspecto importante se atribuye a la falta de modelos cuantitativos suficientemente precisos para relacionar la fuerza medida con el valor de la constante dieléctrica de la muestra. En realidad, para realizar medidas en sustratos aislantes como son la mica o el vidrio, que a veces son necesarios para muestras biológicas, todavía no se dispone de ningún modelo cuantitativo. Por otra parte, hasta ahora no se han publicado medidas de propiedades dieléctricas en medio líquido, que para algunas muestras biológicas es fundamental para mantener la funcionalidad. Como consecuencia de las limitaciones existentes de las medidas dieléctricas, el objetivo de este trabajo fue extender las capacidades cuantitativas de la Microscopía de Fuerzas Eletroestáticas para hacer imágenes dieléctricas de biomembranas con resolución espacial a nanoescala en substratos conductores, aislantes y en medio líquido.

La présente Thèse représente une importante contribution à la connaissance de l’ultrastructure de la spermiogenèse et du spermatozoïde des Digènes. Nous présentons des nouvelles données spermatologiques concernant huit espèces appartenant à sept familles et superfamilles de Digènes. Ils s’agissent de Brachycoelium salamandrae (Gorgoderoidea : Brachycoeliidae), Diplodiscus subclavatus (Paramphistomoidea : Diplodiscidae), Elstia stossichianum et Wardula capitellata (Microscaphidioidea : Mesometridae), Euryhelmis squamula (Opisthorchioidea : Heterophyidae), Mediogonimus jourdanei (Microphalloidea : Prosthogonimidae), Robphildollfusium fractum (Lepocreadioidea : Gyliauchenidae), et Rubenstrema exasperatum (Plagiorchioidea : Omphalometridae). Les résultats obtenus sur la spermiogenèse et/ou le spermatozoïde sont comparés avec le reste de Digènes. De plus, nous discutons de l’importance de certains caractères ultrastructuraux pour une meilleure compréhension des relations phylogénétiques chez les Digènes. La spermiogenèse chez les Digènes est assez homogène. Cependant, il y a certains aspects comme la variabilité du nombre de bandes du corps intercentriolaire et l’angle de rotation flagellaire qui méritent une attention particulière. Concernant le spermatozoïde, nous avons proposé, après une analyse précise des données spermatologiques disponibles, sept modèles de spermatozoïde chez les Digènes. Les caractères du spermatozoïde les plus utiles pour l’établissement de ces modèles sont : (a) le type d’axonème/es (patron 9+‘1’ des Trepaxonemata, 9+‘1’ spécial et 9+0), (b) l’extrémité antérieure du spermatozoïde (avec un ou deux axonèmes), (c) la présence/absence de l’association « expansion latérale+ornementations externes+microtubules corticaux » ou « ornementations externes+microtubules corticaux », (d) la présence ou l’absence d’ornementations externes et leur localisation sur le spermatozoïde, (e) le patron des microtubules corticaux parallèles, absents ou disposés en un ou deux champs, et (f) le caractère terminal dans l’extrémité postérieure du spermatozoïde (noyau, axonème ou microtubules corticaux). D’autres caractères comme les corps épineux ou les boutons cytoplasmiques ornementés peuvent avoir une importance particulière pour certains taxons. La récente description des corps épineux suppose une reconsidération de certaines études anciennes où ces structures peuvent être mal interprétés ou considérés comme des artéfacts. Les boutons cytoplasmiques ornementes sont un nouveau caractère trouvé chez les Mesometridae (E. stossichianum et W. capitellata). Les spermatozoïdes des espèces étudiées dans cette thèse appartiennent aux modèles 1, 2 ou 3. Le modèle 1, caractérisé par la présence de l’association « expansion latérale+ornementations externes+microtubules corticaux », est présent chez Diplodiscus subclavatus, Elstia stossichianum et Wardula capitellata. De plus, la plupart des Echinostomatoidea, Paramphistomoidea et Pronocephaloidea présentent ce modèle. Le modèle 2 est caractérisé par l’association « ornementations externes+microtubules corticaux » et par une extrémité postérieure du spermatozoïde contenant le noyau. Il est présent chez Brachycoelium salamandrae, Robphildollfusium fractum et Rubenstrema exasperatum. Finalement, Euryhelmis squamula et Mediogonimus jourdanei présentent un spermatozoïde du modèle 3 comme chez certains Opisthorchioidea et certaines familles telles que les Allocreadiidae, Deropristidae, Lepocreadiidae et Troglotrematidae. Le modèle 3 diffère du modèle 2 par l’extrémité postérieure contenant un axonème. Le modèle 4 est similaire aux modèles 2 et 3, mais l’extrémité postérieure contient seulement des microtubules corticaux. Il est présent chez les Opecoelidae et Opistholebetidae. Le modèle 5 exhibe un seul champ (ventral) de microtubules corticaux et ne présente pas l’association « ornementations externes+microtubules corticaux ». Il est observé chez les Faustulidae, Hemiuridae et les Lecithasteridae. Le modèle 6 est observé chez les schistosomes. Ils présentent un spermatozoïde aberrant, non filiforme, avec un seul axonème du type 9+‘1’ spécial. Finalement, le modèle 7, caractérisé par la présence d’axonèmes du type 9+0 et par l’absence de microtubules corticaux, est établit seulement pour Didymozoon sp. / The present Thesis represents a contribution to the knowledge about the ultrastructure of spermiogenesis and of the mature spermatozoon of digeneans. We present for the first time spermatological data concerning eight species belonging to seven families and superfamilies: Brachycoelium salamandrae (Gorgoderoidea: Brachycoeliidae), Diplodiscus subclavatus (Paramphistomoidea: Diplodiscidae), Elstia stossichianum and Wardula capitellata (Microscaphidioidea: Mesometridae), Euryhelmis squamula (Opisthorchioidea: Heterophyidae), Mediogonimus jourdanei (Microphalloidea: Prosthogonimidae), Robphildollphusium fractum (Lepocreadioidea: Gyliauchenidae), and Rubenstrema exasperatum (Plagiorchioidea: Omphalometridae). A global analysis of the spermatological characteristics of these species and those already described in the Digenea, allow us to establish seven sperm models within digeneans. The importance of several ultrastructural characteristics, combined with the proposed models are discussed in order to contribute to a better understanding of digenean phylogenetic relationships.

La présente Thèse constitue une contribution à la connaissance de l’ultrastructure de la spermiogenèse et du spermatozoïde chez les Cestodes. Nous y présentons de nouvelles données spermatologiques ultrastructurales d’espèces appartenant à six ordres différents : Acanthobothrium crassicolle Wedl, 1855 (Tetraphyllidea), Aporhynchus menezesi Noever et al., 2010 (Trypanorhyncha), Barsonella lafoni de Chambrier et al., 2009 (Proteocephalidea), Clestobothrium crassiceps (Rudolphi, 1819) (Bothriocephalidea), Echinobothrium euterpes (Neifar et al., 2001) (Diphyllidea) et Molluscotaenia crassiscolex (von Linstow, 1890) (Cyclophyllidea). Les résultats obtenus sur la spermiogenèse et le spermatozoïde sont comparés avec ceux de Cestodes déjà étudiés, spécialement avec ceux appartenant aux ordres objet de notre étude. Enfin, nous discutons sur l’utilité des différents caractères spermatologiques ultrastructuraux en Taxonomie, Systématique et Phylogénie. L’étude spermatologique de Clestobothrium crassiceps constitue le premier travail fait sur le genre Clestobothrium et la onzième espèce de l’ordre Bothriocephalidea récemment créé. Les résultats obtenus sont comparés avec ceux des autres espèces de cet ordre, mais aussi avec ceux des Diphyllobothriidea, l’autre ordre créé à partir de l’ancien ordre des Pseudophyllidea. Concernant la spermiogenèse, les caractères les plus intéressants sont le type II de spermiogenèse et le corps intercentriolaire très réduit. On peut remarquer aussi le type II de spermatozoïde qui présente un anneau de microtubules corticaux, probablement une autapomorphie pour les Bothriocephalidea. L’étude ultrastructurale du Diphyllidea Echinobothrium euterpes montre la formation de deux flagelles de longueur différente. Dans les stades avancés de la spermiogenèse, après la fusion proximodistale, l’axonème court disparaît pour donner naissance à un spermatozoïde présentant un seul axonème. La spermiogenèse est du type I et le spermatozoïde correspond au type IV. Autres caractères intéressants chez les Diphyllidea sont la forte réduction ou absence de microtubules corticaux et la présence de masses denses associées aux centrioles dans la zone de différentiation. Ce dernier caractère peut être une synapomorphie pour les espèces de cet ordre. Aporhynchus menezesi présente un type I de spermiogenèse et un type I de spermatozoïde. Notre étude apporte les premières données chez la superfamille des Gymnorhynchoidea. Nous confirmons chez les Trypanorhyncha l’absence de corps en crête et la présence d’un arc de microtubules corticaux dans le spermatozoïde. L’étude de Acanthobothrium crassicolle est le troisième dans ce genre et confirme le type I de spermiogenèse et le type II de spermatozoïde. Ce type de spermatozoïde constitue la plus importante différence entre les onchobothriidés et les phyllobothriidés. Nous confirmons aussi la présence d’un arc de microtubules corticaux. Cependant, il est observé une hétérogénéité au niveau du corps intercentriolaire chez les Tetraphyllidea-Onchobothriidae. Barsonella lafoni est la septième espèce de l’ordre Proteocephalidea dont l’ultrastructure du spermatozoïde est analysée. Elle montre le patron I pour la spermiogenèse et aussi pour le spermatozoïde. Ces résultats sont concordants avec ceux des autres espèces étudiées, sauf Sandonella sandoni. Un corps intercentriolaire réduit et un arc de microtubules corticaux sont des caractères constamment présents chez les proteocephalidés étudiés. Chez B. lafoni nous avons décrit pour la première fois la présence d’un matériel dense aux électrons dans la zone de différentiation pendant les stades initiaux de la spermiogenèse. Il s’agit d’un caractère typique des ordres basaux des Eucestoda. Finalement, Molluscotaenia crassiscolex suit le type IV de spermiogenèse et son spermatozoïde est du type VI. Ces deux patrons coïncident chez les autres dilepididés étudiés. La morphologie particulière du corps en crête est le caractère le plus intéressant. Il est partiellement détaché dans sa partie moyenne. Nos résultats sont comparés avec les Dilepididae s.l. / The present Thesis constitutes a contribution to the knowledge of ultrastructure of spermiogenesis and the spermatozoon of cestodes. New spermatological data concerning species belonging to six orders of Eucestoda are presented. These species are Clestobothrium crassiceps (Rudolphi, 1819) (Bothriocephalidea), Echinobothrium euterpes (Neifar et al., 2001) (Diphyllidea), Aporhynchus menezesi Noever et al., 2010 (Trypanorhyncha), Acanthobothrium crassicolle Wedl, 1855 (Tetraphyllidea), Barsonella lafoni de Chambrier et al., 2009 (Proteocephalidea), and Molluscotaenia crassiscolex (von Linstow, 1890) (Cyclophyllidea). The obtained results on spermiogenesis and the spermatozoon are compared with the available data on the remaining eucestodes, particularly with the orders discussed in the present study. Moreover, the usefulness of different spermatological characters for Taxonomy, Systematics and Phylogeny is discussed.