Les récepteurs du glutamate de type AMPA (rAMPA) sont les récepteurs ionotroniques responsables de la majeure partie des courants excitateurs rapides lors de la transmission synaptique dans le système nerveux central. Le nombre de rAMPA stabilisés à la synapse est responsable en partie de l’intensité de la transmission synaptique et de nombreux phénomènes de plasticité synaptique. Les rAMPA se répartissent en trois populations en équilibre dynamique: les récepteurs intracellulaires, les récepteurs extra-synaptiques, et les récepteurs synaptiques stabilisés au niveau de la densité post-synaptique. L’implication des protéines transmembranaires régulatrices des rAMPA (TARP) dans la stabilisation des rAMPA est établie, et repose au moins en partie sur la liaison de la protéine TARP γ-2 avec la protéine d’échafaudage PSD-95. Dans l’hippocampe, siège de nombreux phénomènes de plasticité, l’isoforme γ-8 est particulièrement enrichie. La TARP γ-8 a pour particularité de posséder un domaine C-terminal plus long que son homologue γ-2 et de s’exprimer au niveau synaptique et extra-synaptique. Mon travail de thèse à consisté à étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la régulation de la liaison des protéines TARP γ-2 et γ-8 avec la protéine PSD-95, ainsi que l’implication respective des deux isoformes dans la régulation de la mobilité latérale des rAMPA. Les résultats majeurs de cette étude sont : a) l’interaction entre γ-2 et PSD-95 est régulée par la longueur apparent du domaine C-terminal de γ-2 modulée par la phosphorylation; b) γ-8 lie PSD-95 dans les compartiments synaptiques et extra-synaptiques, toutefois cette interaction n’est pas corrélée avec une immobilisation des rAMPA. Ces résultats suggèrent que γ-2 et γ-8 jouent des rôles bien distincts dans l’adressage des rAMPA à la synapse. / AMPA type glutamate receptors (AMPARs) are ionotropic receptors responsible for most excitatory transmission in the central nervous system. The number of stabilized AMPARs in front of glutamate release sites determines in large part the strength of synaptic transmission and variation in this number is thought to underlie numerous forms of synaptic plasticity. AMPARs are present in three main subcellular pools between which they are in a dynamic equilibrium by processes of trafficking: intracellular receptors, extrasynaptic receptors, and synaptic receptors stabilized at the postsynaptic density (PSD). Transmembrane AMPAR regulatory proteins (TARPs) are known to be implicated in AMPAR stabilization at the synapse through the interaction of TARP γ-2/8 with the scaffolding protein PSD-95. In the hippocampus, a structure exhibiting various synaptic plasticity patterns, γ-8 is the most abundant TARP. This isoform is characterized by a longer C-terminal fragment than γ-2 and a synaptic and extrasynaptic localization. During my Ph.D, I studied the molecular mechanisms involved in the regulation of TARP γ-2 and γ-8 binding to PSD-95 and their respective roles in regulating AMPAR lateral mobility. The main results are: a) γ-2 interaction with PSD-95 is regulated by the apparent length of its C-terminus domain that is modulated by phosphorylation; b) γ-8 binds PSD-95 in synaptic and extrasynaptic compartment however this interaction is not correlated with AMPAR immobilization. Altogether, those results suggest that those two TARP isoforms have independent functional roles.

Les récepteurs du glutamate de type kaïnate (KAR) jouent une grande variété de rôles dans la régulation de l’activité des réseaux neuronaux. Les KARs sont localisés à la fois dans les domaines pré- et postsynaptiques et sont impliqués dans différents rôles physiologiques tels que la libération de neurotransmetteur, le contrôle de l’excitabilité neuronale. ainsi que l’intégration et la plasticité synaptique (Pinheiro et Mulle 2006). Mon sujet de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans le trafic subcellulaire et de l'expression polarisée des récepteurs de type kaïnate contenant la sous-unité GluK3. J’ai d’abord essayé de trouver des protéines associées, cytoplasmiques, qui pourraient intervenir dans le trafic de ces récepteurs. Les approches de protéomique que j’ai utilisées n’ont pas donné de résultat. J’ai ensuite tenté de produire des anticorps dans le but de visualiser ces récepteurs dans le cerveau. Malheureusement, je n’ai pas obtenus d’anticorps suffisamment affins pour réaliser ce projet. Par des approches de mutagénése dirigée et d’expression des récepteurs recombinants dans des systèmes hétérologues ou dans des neurones d’hippocampe en culture, j’ai pu mettre en évidence que la sous-unité GluK3 est endocytée par la voie dépendante de la clathrine via un motif di-leucine cytoplasmique. L'endocytose des récepteurs est régulé par l'application d'acide kaïnique et permet une expression polarisée de GluK3b dans les dendrites. Nous avons ensuite développé un projet d'étude du trafic des récepteurs de type kaïnate hétéromériques composés des isoformes GluK3a et GluK3b. Ce projet est actuellement en cours, mais des données préliminaires semblent impliquer la sous-unité GluK3a dans le processus d'exocytose des récepteurs. Il est donc possible que l’association des deux isoformes serait nécessaire au contrôle de l'expression membranaire du récepteur (via GluK3a) et à l'adressage polarisé dans les neurones (via GluK3b). Cette hypothèse doit cependant être encore validée. / Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the brain. Glutamatergic synaptic transmission is mediated by three types of ionotropic receptors that have been classified according to their preferential affinity for the agonists NMDARs (N- methyl-D-aspartate receptors), AMPARs (a-amino-3-hydroxy- 5-methylisoazol-4- propionate receptors) and KARs (kainate receptors). Kainate receptors (KARs) are widely expressed in the brain and are present both at pre- and postsynaptic sites and are involved in several physiological functions. There are five subunits of KAR (GluR5-7, KA1 and KA2 or GluK1-5). One of the main project of my laboratory is to understand the function, the traffic and the regulation of GluK3 subunit, that has been involved in different neuronal desorders such as schizophrenia and depression. GluK3(GluR7)-containing KARs are thought to compose pre-synaptic autoreceptors that facilitate hippocampal mossy fiber synaptic transmission. There are two splice variants of GluK3, named GluK3a and GluK3b . GluK3a shares the same export motif as GluK2a in its C-terminal cytoplasmic domain which allows high expression at the plasma membrane in heterologous cell systems and in primary cultured neurons. In contrast, GluK3b seems to be retained in the endoplasmic reticulum (ER) and is only detected at the plasma membrane in substantial amounts when co-expressed with GluK3a. In my thesis, I have been interested in the mechanisms of polarized trafficking of GluK3 with a main focus on GluK3b. I have been able to identify molecular mechanisms that underlie the polarized trafficking of KARs composed of the GluK3b splice variant. Endocytosis followed by degradation is driven by a di-leucine motif on the cytoplasmic C-terminal domain of GluK3b both in heterologous cells and in cultured hippocampal neurons. The internalization of GluK3b is clathrin and Dynamin2 dependent. Moreover, endocytosis of GluK3b in neurons is regulated by bath application of the KAR agonist kainate. Interestingly, the preferential subcellular localization of GluK3b in dendrites or axons depends on the endocytotic process. We submitted a paper to J. of Neurosciences that show that the subcellular localization of GluK3b depends on the dynamic regulation of an endocytic process that could control the polarized trafficking of KARs in neurons in an activity- dependent manner. I also developped a second project focus on the traffic of KARs expressed as heteromers (GluK3b assembled with GluK3a). I am actually working on this project in my lab in order to send a second paper in the next months.

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Dans les cellules eucaryotes, il existe 3 ARN Polymérases nucléaires (Pol I, II et III), chacune ayant une fonction de synthèse d'ARN qui lui est propre. L'ARN polymérase I (Pol I) est responsable de la synthèse du précurseur des grands ARN ribosomiques (ARNr), ce qui correspond à une activité de transcription massive dans la cellule. Des données structurales sur cette enzyme de 14 sous-unités sont disponibles. Ceci permet une meilleure compréhension de son mode de fonctionnement, et a confirmé que l'ARN Pol I possède 3 sous-unités spécifiques, aussi appelées "Built-in Transcription Factors", responsables d'activités régulatrices. Deux d'entres elles, Rpa49 / Rpa34, forment un hétérodimère structuralement proche des facteurs de transcription TFIIF et TFIIE de la Pol II, impliqués tant dans l'initiation que dans l'élongation de la transcription. La dernière, Rpa12, est connue pour avoir un rôle dans la stabilité de l'ARN Pol I et l'activité de clivage du transcrit de la polymérase en cours de pause (via son extrémité C-terminale), comme son homologue TFIIS, facteur de transcription de l'ARN Pol II. Nous avons effectué des études génétiques sur des mutants de l'ARN Pol I dépourvus de la sous-unité Rpa49 (rpa49Δ). Cette délétion est viable mais entraîne des problèmes d'initiation et élongation. Nous étudions dans ce travail le clonage et la caractérisation de "suppresseurs" extragéniques correspondant à des mutations ponctuelles de trois sous-unité de la Pol I qui rétablissent une synthèse d'ARNr en l'absence de la sous-unité Rpa49. Toutes ces mutations suppressives identifiées ont été localisées premièrement dans les deux grandes sous-unités Rpa190 et Rpa135, structuralement très proches de Rpa12, mais également au sein même de Rpa12, indiquant une possible interaction entre les sous-unités Rpa49 et Rpa12 ou la région autour. Notamment, un élément spécifique de l'ARN Pol I dans Rpa190, le "DNA Mimicking Loop", est structuralement très proche de la région où l'on trouve ces mutations suppresseur. Les caractérisations génétiques, structurales, mais aussi biochimiques et fonctionnelles de ces suppresseurs nous permettent de proposer des hypothèses sur les rôles de Rpa49 et de Rpa12, mais aussi de cette petite région de Rpa190, en l'initiation de la transcription, ce qui n'a jamais été mis en évidence auparavant. / In eukaryotes cells, there are 3 nuclear RNA Polymerases (Pol I, II and III), each having a particular RNA synthesis function. The RNA Polymerase I (Pol I) produces a single transcript: the precursor of the large ribosomal RNA (rRNA), which correspond to a massive transcription activity in the cell. Structural data of this 14-subunits enzyme is now available. This allows a better understanding of its operating mode, and confirmed that the Pol I has 3 specific subunits, also called "Built-in transcription factors", capable of regulatory activities. Two of them, Rpa49/Rpa34, are forming a heterodimer structurally related to the Pol II transcription factors TFIIF and TFIIE, implicated in both initiation and elongation of the transcription. The last one, Rpa12, is known to have a role in Pol I stability and the cleavage activity of the paused Pol I (via its C-terminus part), like its homologous TFIIS in the Pol II. We performed extensive genetic studies of Pol I mutants lacking one of these subunits: Rpa49 (rpa49Δ). This depletion is viable, but results in initiation and elongation problems. Here, we report the cloning and characterization of extragenic suppressors mapping point mutations in three subunits of Pol I restoring efficient Pol I activities in absence of Rpa49. All suppressor mutations identified were structurally mapped firstly in the two largest subunits Rpa190 and Rpa135 very closed to Rpa12, and then in Rpa12 itself, indicating a possible interplay between the Rpa49 and Rpa12 subunits, and the area around. Notably, a RNA pol I specific element in Rpa190, called "DNA Mimicking Loop", is structurally very closed to the region in which we find all of our suppressor mutations. The genetic, structural but also biochemical and functional characterizations of these suppressors allow us to propose roles of these Rpa49 and Rpa12 subunits, but also of the small area of Rpa190, which has never been highlighted before.

Un SGBD temporel doit offrir les fonctionnalités permettant aux applications de dater les informations et de gérer l'histoire de leur évolution. Cette thèse présente le modèle d'historiques TEMPOS et le prototype qui a été réalisé au dessus du SGBD O2. TEMPOS s'appuie sur un modèle du temps, qui permet de manipuler des valeurs temporelles, simples et complexes, exprimées dans différentes unités. Le jeu d'unité est extensible, et les opérations définies sont indépendantes des unités. La multiplicité des formes externes des valeurs temporelles est également prise en compte. Le modèle d'historiques proposé dans TEMPOS intègre les fonctionnalités essentielles attendues pour gérer la dimension historique des informations d'une base de données. La définition de différents types d'historiques (discret, en escalier, interpolé) permet de donner la signification des valeurs saisies et d'interpoler les autres valeurs. Ainsi, en TEMPOS, un historique est vu comme une chronique (séquence de valeurs datées), un domaine temporel d'observation, et une fonction d'interpolation. Le modèle permet diverses structurations des historiques basées sur le regroupement d'instants. Les opérations d'interrogation des historiques sont issues de l'extension temporelle des opérateurs de l'algèbre relationnelle et également d'une adaptation d'opérateurs sur les séquences, qui permettent en particulier de raisonner sur la succession dans le temps. Les opérations classiques de mise à jour sont étendues pour prendre en compte la dimension temporelle. Toutes les opérations sur les historiques sont définies de manière à être indépendantes de la représentation et de l'unité d'observation temporelle des historiques. Le prototype comprend une hiérarchie de classes implantant les types et les opérations proposés dans TEMPOS, et un préprocesseur TempOQL permettant de manipuler des valeurs temporelles dans des requêtes OQL.

Dans ce travail le contexte géologique est étudié à des fins d'exploitation miniére : tungstène, or argent ...

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, est une compo- sante cruciale de l'unité neuro-glio-vasculaire car elle est responsable du maintien de l'homéostasie cérébrale. En limitant l'accès de nombreuses molécules au parenchyme cérébral, cette structure protège efficacement le système nerveux central (SNC) de composés toxiques, mais empêche ainsi de nombreux médicaments d'atteindre leur cible. La difficulté à étudier les caractéristiques et la perméabilité de la BHE in vivo a mené les scientifiques à développer différents modèlesin vitro de BHE. Notre modèle, qui consiste en une coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été largement caractérisé : il exprime les caractéristiques de laBHEin vivoet s'est avéré utile dans l'étude des interactions cellulaires au sein de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques. Le modèle de coculture initialement développé a été complété par l'addition de péricytes cérébraux afin de former des tricultures. En effet, les péricytes apparaissent aujourd'hui comme des acteurs importants de la BHE, mais sont souvent absents des modèles in vitro. Réunir les trois principales populations cellulaires formant la BHE(cellules endothéliales, cellules gliales et péricytes cérébraux) semble nécessaire afin de reproduire encore plus finement la configuration retrouvéein vivo, dans le but de comprendre les interactions cellulaires ayant cours au sein de la BHEen conditions physiologiques et pathologiques. Sur la base de notre coculture originelle, deux tricultures ont été mises en place : alors que dans la première les péricytes sont culti- vés à distance des cellules endothéliales, ces deux types cellulaires sont étroitement associés dans le second. Les deux modèles ont été caractérisés en terme de morphologie et d'expression de marqueurs endothéliaux, de perméabilité paracellulaire et d'expression de pompes d'efflux, démontrant qu'ils représentent tous deux des modèles pertinents de BHE. Ils permettront d'étudier la contribution des péricytes au phénotype de BHE et à sa réponse en conditions pathologiques, prenant en considération la composante glio-vasculaire. Dans la majorité des cas, l'utilisation des modèlesin vitro de BHE au cours des processus de découverte de médicaments vise à prédire si de potentielles molécules thérapeutiques à visée cérébrale peuvent atteindre le SNC, permettant leur effet pharmacologique au niveau de leur cible centrale. Cependant, ces modèles ne présentent généralement pas un débit suffisant pour évaluer rapidement la perméabilité du grand nombre de composés générés par l'industrie pharmaceutique lors des étapes précoces de la découverte de médicaments. A partir de notre coculture d'origine, un premier modèle a été développé pour l'adapter au criblage de molécules en réduisant son format (24 puits au lieu de 6 puits) ainsi que son coût, le temps de culture et les besoins techniques associés. Cette procédure comprend toutefois une étape critique de trypsinisation des cellules endothéliales. Nous avons souhaité rendre ce modèle encore plus facile d'utilisation en le fournissant congelé, afin que l'utilisateur final consacre un minimum de temps et de ressources techniques. Toutes ses caractéris- tiques montrent qu'il constitue un modèle in vitro de BHE pertinent et fiable pouvant répondre au besoin de criblage de composés des groupes pharmaceutiques et des petites entreprises de biotechnologie. Le travail réalisé a permis d'adapter notre modèle deBHEoriginel à deux problématiques. D'une part, la simplification de la procédure associée à sa mise en place permet de répondre aux besoins de l'indus- trie pharmaceutique de générer des données de perméabilité à grande échelle, lors des phrases précoces de la découverte de médicaments. D'autre part, l'intégration des péricytes cérébraux au sein du modèle permet d'étudier les interactions cellulaires mises en jeu au sein de la composante glio-vasculaire. Ces modèles pourront donc respectivement contribuer au développement de médicaments à visée cérébrale dont la perméabilité à travers laBHEpourra être optimisée, et à l'étude les intercommunications cellulaires mises en jeu au niveau de la BHE en conditions physiologiques et pathologiques.

L'information décrit et met en forme. Un projet assemble de multiples éléments, ce qui pose la question de sa cohésion. Comment des parties tiennent-elles ensemble ? Des liens en suspens, introduits par Husserl, peuvent être modélisés par des spires. Un anneau de spires, qui est une unité composée, rend compte de l'assemblage de parties. Le mouvement et la négation conduisent à quatre mondes logiques et la genèse des nombres s'accompagne d'une genèse du trait. Ainsi la cohésion en construction se modélise par un triple anneau de spires, correspondant à trois interfaces entre les mondes : 1) une interface avec des composants en interaction, ce qui construit la forme, 2) une interface limite de l'amortissement des spires, qui forme l'horizon, 3) une interface avec la pulsation au centre. Ce triple anneau, provenant d'une tension triple, s'applique à une forme en three degrés : spatial, temporel et réflexif. Dans l'espace, la forme se trouve à des stades divers d'intégration de composants. Dans le temps, des cycles s'intègrent en un plus grand cycle, une démarche générique est modélisée avec des blocs élémentaires ; cette modélisation a été testée. Au niveau réflexif, le lecteur s'intègre dans la tension et celle-ci, dans un projet, interroge sa raison d'être ; la tension triple provient d'une arborescence de notions fondamentales, qui culminent dans l'être, l'unité et le devenir, base de la cohésion informationnelle.

L'information décrit et met en forme. Un projet assemble de multiples éléments, ce qui pose la question de sa cohésion. Comment des parties tiennent-elles ensemble ? Des liens en suspens, introduits par Husserl, peuvent être modélisés par des spires. Un anneau de spires, qui est une unité composée, rend compte de l'assemblage de parties. Le mouvement et la négation conduisent à quatre mondes logiques et la genèse des nombres s'accompagne d'une genèse du trait. Ainsi la cohésion en construction se modélise par un triple anneau de spires, correspondant à trois interfaces entre les mondes : 1) une interface avec des composants en interaction, ce qui construit la forme, 2) une interface limite de l'amortissement des spires, qui forme l'horizon, 3) une interface avec la pulsation au centre. Ce triple anneau, provenant d'une tension triple, s'applique à une forme en three degrés : spatial, temporel et réflexif. Dans l'espace, la forme se trouve à des stades divers d'intégration de composants. Dans le temps, des cycles s'intègrent en un plus grand cycle, une démarche générique est modélisée avec des blocs élémentaires ; cette modélisation a été testée. Au niveau réflexif, le lecteur s'intègre dans la tension et celle-ci, dans un projet, interroge sa raison d'être ; la tension triple provient d'une arborescence de notions fondamentales, qui culminent dans l'être, l'unité et le devenir, base de la cohésion informationnelle.

Dans un premier temps, je me suis intéressé à la sous-unité ε de l’ATP synthase mitochondriale chez la levure, un organisme qui se prête bien à l’étude des fonctions mitochondriales. Cette protéine fait partie d’un élément de l’ATP synthase appelé la tige centrale. Celui-ci permet de coupler le domaine translocateur de protons de cette enzyme (FO) à son secteur catalytique (F1) où l’ATP est synthétisé. En utilisant un système d’expression régulable (répressible par la doxycycline), j’ai montré qu’en l’absence de la sous-unité ε les secteurs F1 et FO ne sont plus couplés, avec pour résultat des fuites massives de protons à travers la membrane interne des mitochondries. J’ai ensuite montré que l’absence de la sous-unité ε peut être compensée par des mutations ralentissant l’activité du FO. Ces données permettent de conclure que la sous-unité ε est nécessaire au maintien de l’intégrité physique de l’ATP synthase lors de son fonctionnement. Dans un second temps, j’ai cherché à identifier de nouveaux facteurs intervenant dans la biogenèse du FO. Pour cela, j’ai utilisé un crible génétique où la survie des cellules de levure est conditionnée à des mutations inactivation le FO. Un millier d’isolats a été analysé. Les mutations ont été localisées dans les génomes mitochondrial et nucléaire. Dix-huit clones, issus de mutations n’affectant pas des facteurs connus pour être nécessaires à l’expression de l’ATP synthase, ont été entièrement séquencés. Plusieurs nouveaux systèmes cellulaires potentiellement impliqués dans la biogenèse du FO ont été identifiés. / At first, I am interested in the ε subunit of mitochondrial ATP synthase in yeast, an organism that is well suited for the study of mitochondrial functions. This protein is a part of the ATP synthase called central stalk. This allows the coupling of proton translocator domain of this enzyme (FO) to its catalytic domain (F1) where ATP is synthesized. Using a tetO expression system, I showed that in the absence of the ε subunit, F1 and FO domains are no longer coupled. It results in a massive proton leakage across the inner membrane of mitochondria. I then showed that the absence of the ε subunit can be compensated by mutations slowing the activity of FO. These data allow to conclude that the ε subunit is necessary to maintain the physical integrity of the ATP synthase for oxydative phosphorylation. Later, I tried to identify new factors involved in the biogenesis of the FO. For this, I used a genetic screen where the survival of yeast cells is conditioned by mutations inactivating the FO. About a thousand clones were analyzed. The mutations were localized in mitochondrial and nuclear genomes. Eighteen clones with mutations in genes encoding not yet known ATP synthase expression factors were completely sequenced. Several new cellular systems that are potentially involved in the biogenesis of FO were identified.