O relevante conceito de sustentabilidade dos dias atuais leva a população a pensar no tratamento dos recursos naturais e principalmente na qualidade e escassez da água. A grave problemática quanto à gestão dos resíduos urbanos no país, desde sua produção, coleta e disposição final são os desafios colocado aos municípios e a sociedade em geral. O uso cada vez mais abundante dos medicamentos farmacêuticos gera uma demanda de resíduos que acabam atingindo os leitos dos rios. Com avanço das tecnologias é possível monitorar e conhecer os resíduos que afetam indiretamente e diretamente as águas das bacias hidrográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a determinação dos resíduos de fármacos (ácido acetil salicílico, diclorofenaco de sódio, paracetamol, ibuprofeno e fenoprofeno) em águas utilizando a cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de massas tipo tandem (UPLC-MS/MS). Foram utilizadas duas fases moveis distintas. Para os fármacos paracetamol e diclofenaco foi utilizado como fase móvel água: metanol (1:1; V/V) com adição de ácido fórmico e a ionização de eletrospray em modo positivo; para os fármacos acetil salicílico, ibuprofeno e fenoprofeno foi utilizado água: metanol (1:1; v/v) com adição de acetato de amônio e a ionização de eletrospray em modo negativo. O desempenho do método foi avaliado quanto aos seguintes parâmetros: especificidade e seletividade, faixa de trabalho, linearidade; limite de detecção e limite de quantificação, exatidão, robustez e incerteza de medição. Os resultados obtidos comprovaram a adequabilidade do método ao propósito supracitado. Os valores obtidos para o limite de decisão (ccα) e capabilidade de detecção (ccβ) foram: paracetamol 0,21 e 0,34 μg L -1; diclofenaco 2,42 e 3,24 μg L -1 ; AAS 1,56 e 2,45 μg L -1; ibuprofeno 2,34 e 3,21 μg L -1 e fenoprofeno 1,89 e 2,33 μg L-1, respectivamente. A metodologia foi aplicada na caracterização de amostras de água superficial (bruta) e tratada proveniente de áreas de captação e de tratamento de água da bacia hidrográfica do Paraíba do Sul. Foram realizadas duas coletas distintas, setembro/ 2010 e novembro/ 2010, nos municípios de Guararema, São José dos Campos, Taubaté e Pindamonhangaba. Em 31,2 % das amostras, Cinco amostras de água bruta das 16 amostras analisadas, foram encontrados resíduos de paracetamol. Os resultados obtidos apresentaram-se em uma faixa de concentração de 0,10 a 0,50 μg L -1. / The relevant concept of sustainability of the present day leads people to think about the treatment of natural resources and particularly in the quanlity and scarcity of water. The serious problems regarding the management of municipal waste in the country, from production, collection and disposal are the challenges facing municipalities and society in general. The increasing use of pharmaceutical drugs most abundant generates a demand for waste that eventually reach the river beds. With advancement of technologies and know you can monitor the waste that directly and indirectly affect the waters of river basins. The objective of this study was to develop and validade analytical methods for residues of drugs (aspirin, sodium diclofenac, paracetamol, ibuprofen and fenoprofen) in water using ultra performance liquida chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). We used two different mobile phases. For the drugs paracetamol and diclofenac was used as mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of formic acid in positive electrospray ionization mode. For drugs acetyl salicylic acid, ibuprofen and fenoprofen was used mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of ammonium acetate and negative electrospray ionization mode. The performance of the method was evaluated on the following parameters: specificity and selectivity, working range, lineariry, limit of detection and limit of quantification, accuracy, ruggedness and uncertainty measurement. The result obtained proved the suitability of the method for fit purpose. The values obtained for the decision limit (ccα) and detection capability (ccβ) were 0.21 and 0.34 μg L-1, diclofenac 2.42 and 3.24 μgL-1, ASA 1.56 and 2.45 μgL-1, respectively. The methodology was applied in the characterization of samples of surface water (raw) and treated from catchment areas and water treatment basin of Paraíba do sul were two distinct collections, September/2011 and November 2010 in the municipalities of Guararema, São José dos Campos, Taubaté and Pindamonhangaba. In 32,2% of all samples, five samples of 16 raw water samples, residues were found for paracetamol. The results were presented in a concentration range from 0.10 to 0.50 μg L-1.

O relevante conceito de sustentabilidade dos dias atuais leva a população a pensar no tratamento dos recursos naturais e principalmente na qualidade e escassez da água. A grave problemática quanto à gestão dos resíduos urbanos no país, desde sua produção, coleta e disposição final são os desafios colocado aos municípios e a sociedade em geral. O uso cada vez mais abundante dos medicamentos farmacêuticos gera uma demanda de resíduos que acabam atingindo os leitos dos rios. Com avanço das tecnologias é possível monitorar e conhecer os resíduos que afetam indiretamente e diretamente as águas das bacias hidrográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a determinação dos resíduos de fármacos (ácido acetil salicílico, diclorofenaco de sódio, paracetamol, ibuprofeno e fenoprofeno) em águas utilizando a cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de massas tipo tandem (UPLC-MS/MS). Foram utilizadas duas fases moveis distintas. Para os fármacos paracetamol e diclofenaco foi utilizado como fase móvel água: metanol (1:1; V/V) com adição de ácido fórmico e a ionização de eletrospray em modo positivo; para os fármacos acetil salicílico, ibuprofeno e fenoprofeno foi utilizado água: metanol (1:1; v/v) com adição de acetato de amônio e a ionização de eletrospray em modo negativo. O desempenho do método foi avaliado quanto aos seguintes parâmetros: especificidade e seletividade, faixa de trabalho, linearidade; limite de detecção e limite de quantificação, exatidão, robustez e incerteza de medição. Os resultados obtidos comprovaram a adequabilidade do método ao propósito supracitado. Os valores obtidos para o limite de decisão (ccα) e capabilidade de detecção (ccβ) foram: paracetamol 0,21 e 0,34 μg L -1; diclofenaco 2,42 e 3,24 μg L -1 ; AAS 1,56 e 2,45 μg L -1; ibuprofeno 2,34 e 3,21 μg L -1 e fenoprofeno 1,89 e 2,33 μg L-1, respectivamente. A metodologia foi aplicada na caracterização de amostras de água superficial (bruta) e tratada proveniente de áreas de captação e de tratamento de água da bacia hidrográfica do Paraíba do Sul. Foram realizadas duas coletas distintas, setembro/ 2010 e novembro/ 2010, nos municípios de Guararema, São José dos Campos, Taubaté e Pindamonhangaba. Em 31,2 % das amostras, Cinco amostras de água bruta das 16 amostras analisadas, foram encontrados resíduos de paracetamol. Os resultados obtidos apresentaram-se em uma faixa de concentração de 0,10 a 0,50 μg L -1. / The relevant concept of sustainability of the present day leads people to think about the treatment of natural resources and particularly in the quanlity and scarcity of water. The serious problems regarding the management of municipal waste in the country, from production, collection and disposal are the challenges facing municipalities and society in general. The increasing use of pharmaceutical drugs most abundant generates a demand for waste that eventually reach the river beds. With advancement of technologies and know you can monitor the waste that directly and indirectly affect the waters of river basins. The objective of this study was to develop and validade analytical methods for residues of drugs (aspirin, sodium diclofenac, paracetamol, ibuprofen and fenoprofen) in water using ultra performance liquida chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). We used two different mobile phases. For the drugs paracetamol and diclofenac was used as mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of formic acid in positive electrospray ionization mode. For drugs acetyl salicylic acid, ibuprofen and fenoprofen was used mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of ammonium acetate and negative electrospray ionization mode. The performance of the method was evaluated on the following parameters: specificity and selectivity, working range, lineariry, limit of detection and limit of quantification, accuracy, ruggedness and uncertainty measurement. The result obtained proved the suitability of the method for fit purpose. The values obtained for the decision limit (ccα) and detection capability (ccβ) were 0.21 and 0.34 μg L-1, diclofenac 2.42 and 3.24 μgL-1, ASA 1.56 and 2.45 μgL-1, respectively. The methodology was applied in the characterization of samples of surface water (raw) and treated from catchment areas and water treatment basin of Paraíba do sul were two distinct collections, September/2011 and November 2010 in the municipalities of Guararema, São José dos Campos, Taubaté and Pindamonhangaba. In 32,2% of all samples, five samples of 16 raw water samples, residues were found for paracetamol. The results were presented in a concentration range from 0.10 to 0.50 μg L-1.

Malgré les progrès évidents sur la compréhension de la carcinogénèse, l’incidence des cancers est toujours en augmentation. C’est pourquoi les besoins en nouveaux traitements sont importants. Notre travail de thèse a porté sur l’évaluation pharmacologique d’une nouvelle molécule anticancéreuse, l’OTX015. Cette petite molécule de synthèse a la propriété d’inhiber les protéines bromodomaines (famille des BET) qui jouent un rôle clé dans les mécanismes épigénétiques et dont la dérégulation favorise l’apparition de cancers en particulier des hémopathies malignes. Des études précliniques in vitro sur plusieurs lignées cellulaires d’hémopathies malignes et in vivo sur des souris xénogreffées ont permis de mettre en évidence les propriétés antitumorales de l’OTX015. Une méthode de dosage des concentrations plasmatiques d’OTX015 par UPLC-MS/MS a été développée et validée afin d’évaluer sa pharmacocinétique chez les patients inclus dans un protocole d’escalade de doses de phase I. Dans un premier temps, la PK de l’OTX015 a été modélisée par une approche de population et dans un second temps un modèle PK-PD a été construit pour pouvoir évaluer le profil de la tolérance (nombreuses thrombopénies) de cette nouvelle molécule. / Despite obvious progress in carcinogenesis understanding, the incidence of cancer is still increasing. Therefore, the need of new treatments remains important. Our thesis focused on the pharmacological evaluation of a new anticancer drug, OTX015. This small synthetic molecule inhibits the bromodomain proteins (BET) that play a key role in epigenetic mechanisms. Downregulation of BRDs promotes cancer occurrence including hematological malignancies. Preclinical evidences obtained from in vitro and in vivo studies in xenograft mice, suggest that OTX015 has antitumor properties. An ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection method was developed and validated in order to measure OTX015 plasma concentrations. Its pharmacokinetics in patients enrolled in a phase I dose-escalation study was then evaluated. The OTX015 PK parameters were estimated by a population approach and PK-PD modeling was developed in order to evaluate the tolerance and safety (thrombocytopenia) of this new drug.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The storage and handling points of agricultural sprayers on farms are a contamination point source of punctual contamination in case of accidental spills of concentrated pesticide and / or leaks, among others. In order to avoid possible environmental contaminations, since the decade of 90 s have been developed biobed systems, where the handling of pesticides as well as agricultural implements washing are discharded on a mixture of straw, soil and peat (biomix). This mixture has the ability to retain and subsequently biodegrade pesticides. In this study was validated an analytical method applied for routine analysis to determine the organophosphate pesticide chlorpyrifos in biobeds. The method is based on 5 g sample extraction with 30 mL of acetone acidified with phosphoric acid 98:1:1 (v/v/v). After homogenization, centrifugation and filtration, 125 μL of the extract was evaporated and reconstituted in 5 mL of methanol acidified with 0.1% acetic acid. The analysis was performed on a liquid chromatographic system coupled to a tandem mass spectrometer (UPLC-MS/MS). The validation parameters evaluated were calibration curve linearity (r2), accuracy (spike and recovery %), limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of the instrument and the method, precision (RSD%) and matrix effect. To the linearity study analytical solutions were prepared in organic solvent and matrix extract at 0.1; 0.5; 1; 5; 20; 100; 250 ng mL-1. The recovery study was conducted on samples spiked at three concentrations (2, 10 and 50 mg kg-1) with seven replicates (n = 7) for each concentration and the values obtained were between 96 and 115% with RSD values lower than 20 % for all three concentration levels studied. The real LOQ obtained was 2 mg kg-1 and the matrix effect observed was lower than ± 20%, which demonstrates that there is not considerable suppression or enhancement in the analyte signal. The biobed system efficiently degraded chlorpyrifos in both 1) simulation of accidental spillage and 2) application of diluted pesticide solution. In the latter case, all the values obtained at the final sampling time (14 months) were below the real LOQm. / Os pontos de estocagem e manuseio de pulverizadores agrícolas em fazendas são uma fonte de contaminação pontual no caso de derrames acidentais do agrotóxico concentrado e/ou vazamentos. A fim de evitar possíveis contaminações ambientais, desde a década de 90 tem sido desenvolvidos sistemas de camas biológicas, onde o manejo de agrotóxicos bem como a lavagem de implementos agrícolas é feito sobre uma mistura de palha, solo e turfa. Esta biomistura tem a capacidade de reter e posteriormente biodegradar os agrotóxicos. Neste estudo foi validado um método para análises de rotina para determinação do agrotóxico organofosforado clorpirifós em camas biológicas. O método baseia-se na extração de 5 gramas de amostra com 30 mL de uma solução de acetona acidificada com ácido fosfórico 98:1:1 (v/v/v). Após homogeneização, centrifugação e filtração, 125 μL do extrato foi evaporado e reconstituído em 5 mL de metanol acidificado com 0,1% de ácido acético. A análise foi realizada em um sistema de cromatografia líquida acoplado a um espectrômetro de massas tandem (UPLC-MS/MS). Os parâmetros de validação avaliados foram linearidade da curva analítica (r2), exatidão (fortificação e recuperação em %), limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) do instrumento e do método, precisão (RSD %) e efeito matriz. Para o estudo de linearidade as soluções analíticas foram preparadas em solvente orgânico e em extrato de matriz, a 0,1; 0,5; 1; 5; 20; 100; 250 ng mL-1. O estudo de recuperação foi realizado em amostras fortificadas em três concentrações (2, 10 e 50 mg kg-1) repetido sete vezes (n=7) para cada concentração. Os valores obtidos ficaram entre 96 e 115% com valores de RSD inferiores a 20% para os três níveis de concentração estudados. O LOQ real obtido foi 2 mg kg-1. O efeito matriz observado foi inferior a ± 20%, o que demonstra que não há supressão ou aumento considerável no sinal do analito. O sistema de camas biológicas foi eficiente para a degradação de clorpirifós em ambos 1) simulação de derrame acidental e 2) aplicação de solução diluída do agrotóxico. Neste último caso, todos os valores obtidos ao final das etapas de amostragem (14 meses) ficaram abaixo do LOQm real.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Orange juice is a relevant contribution to the Brazilian economy, as long as five glasses of orange juice consumed in the world, three are produced in Brazil. For the purpose of increase the production of fruits and, consequently, juices, there is a growing concern about the presence of pesticide residues in food, so monitoring by analytical methods is required in order to ensure consumer s health. This study shows the validation of an analytical method for the determination of nine fungicides in natural and processed orange juices by UPLC-MS/MS. The extraction procedure used was the modified mini-Luke method. Developed in 1975, it was modified in later years and has been used to monitor the presence of pesticides in non-fatty matrices such as fruits and vegetables. The method consists of adding 30 mL of acetone followed by 60 mL of 1:1 (v/v) mixture of petroleum ether and dichloromethane to 15 g of sample. After homogenization and centrifugation, an aliquot of 1.2 mL was transferred into tubes and evaporation led to a water bath to near dryness. The residue was reconstituted in 1 mL of methanol containing 0.1% acetic acid and analyzed by UPLC-MS/MS. The parameters evaluated for the validation were: calibration curve and linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy (as recovery%), precision (as RSD %) and selectivity (as matrix effects%). The results were satisfactory for all parameters, thus showing that the modified mini-Luke extraction method was effective to extract the studied fungicides in natural and processed orange juices. In the range of concentration studied, the method was linear. The method LOQ were 10, 20 and 50μg kg-1 for six, two and one fungicides studied, respectively. It is noted that these values are the same or below the values of the maximum residue limits (MRL) established by Brazilian, American and European laws, indicating that the method can be used worldwide to determine the nine fungicides studied in orange juice.It can be inferred that the method is selective, as long as this parameter was assessed from the matrix effects. It was negative for most of the fungicides studied and all values remained in the range -20 to +20%, not influencing the results. The analyzed fungicides, show average recoveries between 70 and 120%, only excepting thiophanate - methyl and carbendazin. The thiophanate-methyl presented values below 70% when spiked at concentrations of 10 and 20 μg kg 1 and carbendazim presented values above 120% when spiked at concentrations of 10 μg kg 1. The extraction method, combined with modern chromatographic technique for the determination of analytes, were effective for the analysis of pesticide residues in orange juice. / O suco de laranja representa uma contribuição relevante para a economia brasileira, uma vez que, de cada cinco copos de suco de laranja consumidos no mundo, três são produzidos no Brasil. A fim de aumentar a produção de frutas e, consequentemente, de sucos, também é verificado um aumento na preocupação quanto à presença de resíduos de agrotóxicos em matrizes alimentares, fazendo-se necessário o monitoramento, através de métodos analíticos para, assim assegurar a saúde do consumidor. Neste estudo, foi validado um método analítico para determinação de nove fungicidas em sucos de laranja natural e processado por UPLC-MS/MS. Para a extração dos fungicidas da matriz, utilizou-se o método denominado mini-Luke modificado. Desenvolvido no ano de 1975, sofreu algumas modificações nos anos posteriores e tem sido utilizado para monitorar a presença de agrotóxicos em matrizes não gordurosas como frutas e vegetais. O método consiste na adição de 30 mL de acetona, seguidos de 60 mL da mistura 1:1 (v/v) de éter de petróleo e diclorometano em 15 g de amostra. Após homogeneização e centrifugação, foi retirada uma alíquota de 1,2 mL do extrato, que após evaporação, foi ressuspendido em 1 mL de metanol acidificado com 0,1% de ácido acético e analisado por UPLC-MS/MS. Os parâmetros avaliados para validação do método foram: curva analítica e linearidade, limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), exatidão (recuperação%), precisão (RSD%) e seletividade (efeito matriz%). Os resultados obtidos foram satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, mostrando desta forma, que o método de extração mini-Luke modificado foi eficaz para extrair os fungicidas estudados em sucos de laranja natural e processado. Na faixa de concentração estudada, o método mostrou-se linear. Os valores de LOQ do método foram de 10, 20 e 50 μg kg-1 para seis, dois e um fungicidas estudados, respectivamente. Salienta-se que estes valores são iguais ou inferiores aos valores dos limites máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pelas legislações brasileira, americana e européia, indicando que o método pode ser empregado a nível mundial para determinar os nove fungicidas estudados em sucos de laranja. Pode-se afirmar que o método é seletivo, uma vez que este parâmetro foi avaliado a partir do efeito matriz, o qual para a maioria dos fungicidas estudados foi negativo, e todos os valores permaneceram na faixa de -20 e +20%, não influenciando os resultados. Os fungicidas estudados apresentaram valores de recuperação dentro da faixa de 70 a 120% com exceção do tiofanato-metílico e do carbendazim. O tiofanato-metílico apresentou valores abaixo de 70% para os níveis de fortificação de 10 e 20 μg kg-1 e o carbendazim, valores acima de 120% para o nível de fortificação de 10 μg kg-1. O método de extração, aliado com a técnica cromatográfica para determinação dos analitos, mostraram-se eficientes para a análise de resíduos de agrotóxicos em sucos de laranja.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The optimization and validation of an analytical method for 51 pesticides determination in tomato, using UPLC-MS/MS, was developed in order to fulfill the requirement 5.4.5 (Method Validation) of the NBR ISO/IEC 17025:2005 and following the orientation document DOQ-CGCRE-008 (Orientation of analytical methods validation). This item is very important to a laboratory to be accredited by INMETRO (Brazilian accreditation body). The method validation was carried out following all the validation parameters, such as linearity of the analytical curves, limits of detection and quantification, matrix effects, accuracy and precision of the method. The studied compounds in this work were determined by UPLC-MS/MS in the positive ESI ionization mode. The stock solutions of the pesticides were prepared in organic solvent compatible with the compound solubility. These solutions were prepared by two different analysts in order to validate the preparation by comparing the areas of the injections (n=7) of each individual solution. After evaluation, 43 from 51 studied solutions showed results between the acceptable range of ± 10% demonstrating the satisfactory quality of solutions preparation. The evaluated pesticides were extracted from tomatoes applying the mini Luke method with a mixture 1:1:1 (v/v/v) of each acetone/petroleum ether/dichloromethane solvent as extraction solvent. After extraction, the organic solvent extract was evaporate and reconstituted in appropriate solvent (acidified methanol with 0.1% acetic acid) for UPLC-MS/MS analysis. The recovery experiments were done at 10, 20 and 50 μg kg-1 spike levels, by two analysts in different days, and 7 replicates (n=7) for each spike level plus the blank matrix (without pesticides). The limits of detection and quantification for the instrument and method were estimated, as well as the linearity of the analytical curves evaluated based on determination coefficient (r²), dynamic linear range, accuracy by recovery experiments (%), precision (RSD%) and matrix effect. From the 51 studied compounds, 46 showed recoveries between the range of 81 115% for all the evaluated spike levels. About precision, 92% of the compounds showed RSD% below 18.7% in the lowest spike level. The quantification limit of the method, for 82% from all evaluated compounds, was the lowest spike level studied (10 μg kg-1). The matrix effect observed was between ± 20% for all evaluated compounds, showing that there is not considerable suppression or enhancement in the analytes signal. For all evaluated pesticides the intermediate precision was below 20% of RSD showing the good repeatability of the method. / O desenvolvimento e validação do método analítico para determinação de 51 agrotóxicos em tomate por UPLC-MS/MS foi realizado a fim de atender ao requisito 5.4.5 (Validação de Métodos) da norma NBR ISO/IEC 17025:2005 e seguindo o documento orientativo DOQ-CGCRE-008 (Orientação sobre validação de métodos analíticos). Esse item descrito na norma é de fundamental importância para que o laboratório possa ser acreditado pelo INMETRO. A validação do método seguiu todos os parâmetros de validação, tal como a linearidade das curvas analíticas, limites de detecção e quantificação, efeito matriz, exatidão e precisão do método. Os agrotóxicos estudados neste trabalho foram determinados por UPLC- MS/MS no modo de ionização ESI positivo. As soluções estoque dos agrotóxicos foram preparadas em solvente orgânico compatível com a solubilidade de cada substância. Essas soluções foram preparadas por dois analistas distintos a fim de validar o preparo dessas a partir da comparação das áreas das injeções realizadas (n=7) de cada solução individual. Após avaliação, 43 das 51 soluções estudadas mostraram resultados dentro da faixa de ± 10% demonstrando a excelente qualidade no preparo dessas soluções. Os agrotóxicos estudados foram extraídos das amostras de tomate utilizando o método mini Luke o qual faz o uso de uma mistura 1:1: 1 (v/v/v) de acetona/éter de petróleo/diclorometano como solvente extrator. Após extração, o extrato em solvente orgânico foi evaporado e ressuspendido em solvente apropriado (metanol acidificado com 0,1% ácido acético) para análise por UPLC-MS/MS. O estudo de fortificação e recuperação dos analitos foi realizado nas concentrações de 10, 20 e 50 μg kg-1, por dois analistas, e 7 replicatas (n=7) para cada concentração, além das amostras branco (sem conter os agrotóxicos). Os limites de detecção e quantificação do instrumento e do método foram determinados, bem como a linearidade das curvas analíticas avaliadas através do coeficiente de determinação (r²), faixa linear dinâmica de trabalho, exatidão através do estudo de fortificação e recuperação (%) dos analitos, precisão (RSD%) e efeito matriz. Dos 51 agrotóxicos estudados, 46 apresentaram recuperação média na faixa de 81 a 115 % para todas as concentrações avaliadas. Com relação à precisão, 92% dos agrotóxicos demonstraram RSD% abaixo de 18,7% na menor concentração de fortificação. O limite de quantificação do método, para 82% dos agrotóxicos, foi a concentração de fortificação mais baixa estudada (10 μg kg-1). O efeito matriz observado foi inferior a ± 20% para todos os agrotóxicos avaliados, demonstrando assim que não há supressão ou aumento considerável no sinal do analito. Para todos os agrotóxicos estudados os resultados de precisão intermediária (onde foram avaliados diferentes analistas em diferentes dias) ficaram abaixo de 20% demonstrando a repetitividade satisfatória do método proposto.

Trimethylamine-n-oxide (TMAO) is a metabolite found in plasma/serum in humans. Elevated levels of TMAO have been associated with several types of heart disease. It’s therefore of interest to make a simple analytical method to analyse TMAO and other metabolites that are degraded to TMAO, including betaine. In this study, the goal was to develop a method for the sample preparation and analysis of these compounds in human plasma. Sample preparation was performed with an Ostro 96-well method for sample clean-up. The analysis was performed by ultraperformance liquid chromatography – hydrophilic interaction liquid chromatography – tandem masspectrometry (UPLC-HILIC-MS/MS) in multiple reaction monitoring (MRM)-mode using electrospray ionization in positive mode (ESI+)-mode as the ion source. The analytes eluted under five minutes and were all baseline separated in the chromatogram. TMAO and betaine were quantified in quality control (QC) plasma samples using external calibration. Concentration of TMAO ranged from 132 ng/mL – 253 ng/mL and 1025-2084 ng/mL for betaine. Due to the lack of isotopically labelled standards for TMAO and betaine, valine-d8 was tested as an internal standard for the extraction; however, it was not a suitable option due to the low recovery obtained (5-34%) and the low response in ESI+. The recovery needs to be investigated further using isotopically labelled TMAO or betaine. Overall, the developed UPLC-HILIC-MS/MS method was found to be suitable for analysis of TMAO and betaine in human plasma. Further development and validation is required before application to samples from clinical studies.

A análise de fármacos é fundamental nas diversas fases do desenvolvimento farmacêutico, tais como estudos de formulação, estabilidade e controle de qualidade do produto. A rivaroxabana (RIV) é um anticoagulante de uso oral indicado para prevenção da formação de coágulos venosos. A literatura pesquisada apresenta poucos relatos de determinação quantitativa e de estudos de estabilidade do fármaco em comprimidos. E ainda nenhum método analítico em compêndios oficiais Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar métodos analíticos para determinação qualitativa e quantitativa da RIV por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por UV e de ultra eficiência com detecção por espectrometria de massas (CLAE-UV e CLUE-EM) e eletroforese capilar (EC). Os resultados encontrados foram adequados conforme o preconizado nos guias oficiais nacionais e internacionais. Foi avaliada também a viabilidade da técnica de eletroforese capilar em microchip para análise de RIV. Através de método desenvolvido por CLAE foi realizado estudo de cinética de degradação e posterior avaliação do potencial tóxico in vitro das amostras de degradação forçada da RIV. A identificação de três produtos de degradação majoritários da RIV, formados a partir de estresse ácido, alcalino e fotolítico, foi realizada por CLUE-EM/EM, possibilitando a proposição da estrutura molecular de cada produto de degradação. O potencial tóxico da RIV antes e depois da exposição à degradação forçada foi avaliado através dos métodos in vitro MTT, Vermelho Neutro, Ensaio Cometa e DNA de baixo peso molecular. Não foram encontrados sinais de dano ao DNA celular, contudo, amostras de RIV expostas ao meio alcalino apresentaram maior redução da viabilidade celular. O trabalho avaliou ainda o perfil de dissolução da RIV em comprimidos baseado nos dados de absorção in vitro conforme modelagem in silico dos dados, estabelecendo uma correlação linear entre a fração absorvida e fração dissolvida. As diferentes metodologias e técnicas desenvolvidas e aplicadas nesse trabalho contribuem para o desenvolvimento do controle de qualidade farmacêutico na direção de ensaios mais confiáveis que garantam a segurança e eficácia de medicamentos. / Drug analysis is critical at various stages of pharmaceutical development, such as formulation studies, stability and quality control products. Rivaroxaban (RIV) is an oral anticoagulant indicated for prevention of thromboembolism. Literature contains few reports of quantitative determination and drug stability studies of RIV on pharmaceutical formulation. Analytical method for RIV quality control are not evaluable on official guides yet. This research work aimed to develop and validate analytical methods for qualitative and quantitative determination of RIV by high and ultra performance liquid chromatography with UV detection mass spectrometry detection (HPLC -UV and UPLC-MS) and capillary electrophoresis (CE). The results were adequate as recommended in national and international official guides. Reliability of RIV analysis by microchip capillary electrophoresis was also assessed. Through the method developed by HPLC degradation kinetic studies were performed, zero order kinetic has better description of RIV degradation behaviour. RIV toxic potential before and after exposure to forced degradation was assessed by in vitro methods of MTT, Neutral Red, Comet Assay, and Low Molecular Weight DNA. There were no signals of DNA damage however, RIV samples exposed to alkaline medium showed increased reduction in cell viability. Identification of RIV degradation products formed after exposure to acid and alkaline media and UVC radiation was performed by UPLC-MS / MS. It was possible to elucidate molecular structures of three major degradation products. This study also assessed the dissolution profile of RIV tablets based on in vitro absorption data, a linear point-to-point correlation was found for fraction absorbed and dissolved. Different methodologies and techniques developed and applied in this work can contribute to the development of pharmaceutical quality towards more reliable tests to ensure safety and efficacy of medicines.

Το Vaccinium corymbosum (Ericaceae) είναι ένας ψηλός θάμνος, ο οποίος καλλιεργείται σε περιοχές της Αμερικής και της Ευρώπης για τους υψηλής διατροφικής αξίας καρπούς του (κυανά μύρτιλλα: blueberries). Στη χώρα μας, καλλιέργεια μύρτιλλων γίνεται κυρίως στην περιοχή της Δράμας. Οι περισσότερες μελέτες εστιάζουν στην ανάλυση των συστατικών των καρπών, ενώ η φυτοχημική σύσταση των φύλλων δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Η παρούσα εργασία, στόχο είχε την ανάλυση των κυριότερων φαινολικών συστατικών των φύλλων του φυτού, με χρήση χρωματογραφικών μεθόδων ανάλυσης. Τα αποξηραμένα φύλλα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, προέρχονται από τις ποικιλίες ‘Bluecrop’ και ‘Patriot’, βιολογικής καλλιέργειας στην περιοχή της Δράμας. Προετοιμάστηκε αφέψημα των αποξηραμένων φύλλων, το οποίο στη συνέχεια εκχυλίστηκε διαδοχικά, με οξικό αιθυλεστέρα (AcOEt) και βουτανόλη (BuOH). Κατόπιν και με σκοπό τον εύκολο προσδιορισμό των φαινολικών ενώσεων, πραγματοποιήθηκε όξινη υδρόλυση (90 oC, 2 h, 50% μεθανόλη) όλων των κλασμάτων: Crude (αφέψημα), AcOEt, BuOH και Aqueous. Η ανάλυση των συστατικών πραγματοποιήθηκε με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης με Ανιχνευτή Συστοιχίας Φωτοδιόδων (HPLC-DAD) και ύστερα με Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης (UPLC-MS) με Φασματόμετρο Μάζας, το οποίο διαθέτει υβριδικό αναλυτή τετραπόλου – χρόνου πτήσης (Q-TOF). Για την HPLC-DAD ανάλυση χρησιμοποιήθηκε στήλη αντίστροφης φάσης (Luna C-18), με σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης με τρείς διαλύτες: διάλυμα οξικού αμμωνίου (CH3COONH4-10 mM), ακετονιτρίλιο και μεθανόλη (Μαργιάννη, 2011). Επιπλέον, για την ποσοτικοποίηση των κυριότερων φαινολικών συστατικών χρησιμοποιήθηκε σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης με δύο διαλύτες: διάλυμα CH3COONH4-10 mM και ακετονιτρίλιο (τροποποίηση Tsao et al., 2003). Στην ανάλυση UPLC-ESI-MS χρησιμοποιήθηκε στήλη αντίστροφης φάσης (BEH C18), με σύστημα βαθμιδωτής έκλουσης με δύο διαλύτες: 0.1% μυρμηκικό οξύ σε H2O και ακετονιτρίλιο. Τα αποτελέσματα έδειξαν, αρχικά, ότι κανένα από τα κλάσματα δεν περιέχει ανθοκυανίνες, ενώ το AcOEt κλάσμα είναι περισσότερο εμπλουτισμένο σε φαινολικά συστατικά, σε σχέση με τα άλλα κλάσματα. Με χρήση της UPLC-ESI-MS ανάλυσης, προσδιορίσθηκαν διάφορα συστατικά μεταξύ των οποίων φαινολικά οξέα και φλαβονοειδή. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός ότι το Aqueous κλάσμα περιείχε μόνο φαινολικά οξέα. Η επιλογή της μεθόδου της όξινης υδρόλυσης, φαίνεται να ήταν ικανοποιητική, αφού τα άγλυκα τμήματα των γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών, αλλά και τα προϊόντα διάσπασης του εστερικού δεσμού του χλωρογενικού οξέος, προσδιορίσθηκαν εύκολα με την UPLC-ESI-MS ανάλυση. Στα επιμέρους δείγματα ποσοτικοποιήθηκαν, με χρήση HPLC-DAD ανάλυσης τα εξής φαινολικά συστατικά: χλωρογενικό οξύ, ρουτίνη, υπεροζίτης, ισοκερσιτρίνη και κερκετίνη. Συνεπώς, το αφέψημα των καλλιεργούμενων μύρτιλλων είναι μία καλή πηγή φαινολικών συστατικών. / Vaccinium corymbosum (Ericaceae) is a tall shrub, which is cultivated in parts of America and Europe for their fruits (blueberries), which possess high nutritional value. In our country, blueberries are mainly cultivated in the area of Drama. Many studies focus on the analysis of the constituents of fruits, while the phytochemical composition of leaves has not been studied in detail. The present study aimed the analysis of the main components of blueberry leaves, using chromatographic techniques. Dried leaves (var ‘Bluecrop’ and ‘Patriot’) were obtained from the Cooperative ‘‘Biodrama’’. The decoction of dried leaves was prepared and then extracted sequentially with ethyl acetate and butanol. In order to easily identify the phenolic compounds, all fractions (Crude or decoction, AcOEt, BuOH and Aqueous) were hydrolysed in acid conditions (90 oC, 2 h, 50% MeOH). The components of the fractions were analyzed firstly by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector (HPLC-DAD) and then with Ultra High Performance Liquid Chromatography (UPLC-MS) with Mass Spectrometry. The mass spectrometer features hybrid quadrupole - time of flight (Q-TOF) analyzer. For the HPLC-DAD analysis a reverse phase column (Luna C-18) was used with a gradient elution system with three solvents: ammonium acetate (CH3COONH4-10 mM), acetonitrile (AcCN) and methanol (MeOH) (Margianni, 2011). Moreover, the quantification of the major phenolic components system was done with a gradient elution system of CH3COONH4-10 mM and AcCN (modified from Tsao et al., 2003). UPLC-ESI-MS was performed on a reverse phase column (BEH C18) with a gradient elution system with two solvents: 0.1% formic acid in H2O and AcCN. Firstly, the results showed that none of the fractions contain anthocyanins while AcOEt fraction is more enriched in phenolic compounds, in comparison to the other fractions. Using UPLC-ESI-MS analysis, we identified several components including phenolic acids and various flavonoids. Interestingly, the Aqueous fraction contained only phenolic acids. The choice of the method of acid hydrolysis appears to be satisfactory for identification purposes, since the aglycones of glycosylated flavonols, and the cleavage products of the chlorogenic acid, was determined easily by UPLC-ESI-MS analysis. The phenolic compounds: chlorogenic acid, rutin, hyperoside, isoquercitrin and quercetin were quantified in blueberry leaf decoction using HPLC-DAD. Therefore, the decoction of cultivated blueberries is a good source of phenolic compounds.

A análise de fármacos é fundamental nas diversas fases do desenvolvimento farmacêutico, tais como estudos de formulação, estabilidade e controle de qualidade do produto. A rivaroxabana (RIV) é um anticoagulante de uso oral indicado para prevenção da formação de coágulos venosos. A literatura pesquisada apresenta poucos relatos de determinação quantitativa e de estudos de estabilidade do fármaco em comprimidos. E ainda nenhum método analítico em compêndios oficiais Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar métodos analíticos para determinação qualitativa e quantitativa da RIV por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por UV e de ultra eficiência com detecção por espectrometria de massas (CLAE-UV e CLUE-EM) e eletroforese capilar (EC). Os resultados encontrados foram adequados conforme o preconizado nos guias oficiais nacionais e internacionais. Foi avaliada também a viabilidade da técnica de eletroforese capilar em microchip para análise de RIV. Através de método desenvolvido por CLAE foi realizado estudo de cinética de degradação e posterior avaliação do potencial tóxico in vitro das amostras de degradação forçada da RIV. A identificação de três produtos de degradação majoritários da RIV, formados a partir de estresse ácido, alcalino e fotolítico, foi realizada por CLUE-EM/EM, possibilitando a proposição da estrutura molecular de cada produto de degradação. O potencial tóxico da RIV antes e depois da exposição à degradação forçada foi avaliado através dos métodos in vitro MTT, Vermelho Neutro, Ensaio Cometa e DNA de baixo peso molecular. Não foram encontrados sinais de dano ao DNA celular, contudo, amostras de RIV expostas ao meio alcalino apresentaram maior redução da viabilidade celular. O trabalho avaliou ainda o perfil de dissolução da RIV em comprimidos baseado nos dados de absorção in vitro conforme modelagem in silico dos dados, estabelecendo uma correlação linear entre a fração absorvida e fração dissolvida. As diferentes metodologias e técnicas desenvolvidas e aplicadas nesse trabalho contribuem para o desenvolvimento do controle de qualidade farmacêutico na direção de ensaios mais confiáveis que garantam a segurança e eficácia de medicamentos. / Drug analysis is critical at various stages of pharmaceutical development, such as formulation studies, stability and quality control products. Rivaroxaban (RIV) is an oral anticoagulant indicated for prevention of thromboembolism. Literature contains few reports of quantitative determination and drug stability studies of RIV on pharmaceutical formulation. Analytical method for RIV quality control are not evaluable on official guides yet. This research work aimed to develop and validate analytical methods for qualitative and quantitative determination of RIV by high and ultra performance liquid chromatography with UV detection mass spectrometry detection (HPLC -UV and UPLC-MS) and capillary electrophoresis (CE). The results were adequate as recommended in national and international official guides. Reliability of RIV analysis by microchip capillary electrophoresis was also assessed. Through the method developed by HPLC degradation kinetic studies were performed, zero order kinetic has better description of RIV degradation behaviour. RIV toxic potential before and after exposure to forced degradation was assessed by in vitro methods of MTT, Neutral Red, Comet Assay, and Low Molecular Weight DNA. There were no signals of DNA damage however, RIV samples exposed to alkaline medium showed increased reduction in cell viability. Identification of RIV degradation products formed after exposure to acid and alkaline media and UVC radiation was performed by UPLC-MS / MS. It was possible to elucidate molecular structures of three major degradation products. This study also assessed the dissolution profile of RIV tablets based on in vitro absorption data, a linear point-to-point correlation was found for fraction absorbed and dissolved. Different methodologies and techniques developed and applied in this work can contribute to the development of pharmaceutical quality towards more reliable tests to ensure safety and efficacy of medicines.