Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na defesa da planta.Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente 2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis.O sucessodeste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização. / Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the enzyme, little is known about this protein.In the present work, a system for the expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in amounts enough for posterior studies and characterization.

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais. / Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein.

abstract: ABSTRACT Enzyme-Induced Carbonate Precipitation (EICP) using a plant-derived form of the urease enzyme to induce the precipitation of calcium carbonate (CaCO3) shows promise as a method of stabilizing soil for the mitigation of fugitive dust. Fugitive dust is a significant problem in Arizona, particularly in Maricopa County. Maricopa County is an EPA air quality non-attainment zone, due primarily to fugitive dust, which presents a significant health risk to local residents. Conventional methods for fugitive dust control, including the application of water, are either ineffective in arid climates, very expensive, or limited to short term stabilization. Due to these limitations, engineers are searching for new and more effective ways to stabilize the soil and reduce wind erosion. EICP employs urea hydrolysis, a process in which carbonate precipitation is catalyzed by the urease enzyme, a widely occurring protein found in many plants and microorganisms. Wind tunnel experiments were conducted in the ASU/NASA Planetary Wind Tunnel to evaluate the use of EICP as a means to stabilize soil against fugitive dust emission. Three different soils were tested, including a native Arizona silty-sand, a uniform fine to medium grained silica sand, and mine tailings from a mine in southern Arizona. The test soil was loosely placed in specimen container and the surface was sprayed with an aqueous solution containing urea, calcium chloride, and urease enzyme. After a short period of time to allow for CaCO3 precipitation, the specimens were tested in the wind tunnel. The completed tests show that EICP can increase the detachment velocity compared to bare or wetted soil and thus holds promise as a means of mitigating fugitive dust emissions. / Dissertation/Thesis / M.S. Civil and Environmental Engineering 2014

Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na defesa da planta.Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente 2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis.O sucessodeste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização. / Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the enzyme, little is known about this protein.In the present work, a system for the expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in amounts enough for posterior studies and characterization.

Ureases são enzimas que possuem atividades biológicas independentes de suas funções enzimáticas, como indução de exocitose e atividade inseticida. Rhodnius prolixus é um dos modelos de inseto sensíveis a essa toxicidade. Quando testada em tecidos isolados de R. prolixus, a urease de Canavalia ensiformis (JBU) causa diferentes efeitos deletérios modulados por eicosanóides. A via de biossíntese dos eicosanóides envolve fosfolipases A2 (PLA2), que são enzimas responsáveis pela liberação de ácido araquidônico (AA). Uma vez liberado, AA pode ser oxigenado na via da ciclooxigenase, a qual produz prostaglandinas (PGs). Em insetos, a resposta imune compreende as reações humoral e celular e é centralmente modulada por eicosanóides, principalmente PGs. Em busca de uma ligação entre o efeito tóxico de JBU e reações imunológicas em insetos, estudamos os efeitos desta toxina em hemócitos de R. prolixus. Descobrimos que JBU ativa a agregação de hemócitos, tanto após injeção na hemolinfa quanto em células in vitro. Em ensaios in vitro, observamos que os inibidores da síntese de eicosanóides, dexametasona e indometacina, inibem a agregação induzida por JBU, sugerindo que produtos da ciclooxigenase modulam a reação. Após hemócitos cultivados serem tratados com JBU, sítios imunorreativos anti-JBU, danos no citoesqueleto e agregação de núcleos foram observados nas células. Também identificamos e clonamos os transcritos de dois genes de PLA2s de R. prolixus, Rhopr-PLA2III e Rhopr-PLA2XII. Analisamos os perfis de expressão de ambos os genes, e observamos que os transcritos são amplamente distribuídos em vários tecidos, porém em diferentes níveis. Utilizando a estratégia de RNAi, silenciamos a expressão de Rhopr-PLA2XII em ninfas de R. prolixus em uma média de 70% entre variados tecidos. Observamos que a toxicidade de JBU foi diminuída em mais de 50% em ninfas com a expressão de Rhopr-PLA2XII diminuída, indicando que o gene está ligado ao efeito tóxico de JBU nesse inseto. No presente estudo demonstramos pela primeira vez a capacidade de uma urease de induzir a agregação de hemócitos. Da mesma forma, os genes de PLA2 aqui apresentados foram os primeiros a serem identificados e a terem seus transcritos clonados em um vetor da doença de Chagas. Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que eicosanóides modulam a toxicidade de JBU, contribuindo para a compreensão dos mecanismos entomotóxicos de ação dessas proteínas multifuncionais. / Ureases are multifunctional enzymes that display biological activities independent of their enzymatic function, including induction of exocytosis and insecticidal effects. Rhodnius prolixus, a major vector of Chagas’ disease, is one of the known susceptible models of this toxicity. When tested in isolated tissues of R. prolixus, jack bean urease (JBU) causes different deleterious effects modulated by eicosanoids. The eicosanoid biosynthetic pathway involves phospholipase A2 (PLA2) enzymes that are responsible for releasing arachidonic acid (AA), along with other products. Once released, AA may enter different enzymatic oxygenation pathways, among which is the cyclooxygenase pathway, yielding products such as prostaglandins (PGs). In insects, the immune response comprises cellular and humoral reactions, and is centrally modulated by eicosanoids, mainly PGs. Searching for a link between JBU toxic effect and immune reactions in insects we have studied the effects of this toxin on R. prolixus hemocytes. We have found that JBU triggers aggregation of the hemocytes either after injection in the hemocoel as well as in isolated cells. In vitro assays in presence of the eicosanoid synthesis inhibitors dexamethasone and indomethacin counteracted JBU's effect, indicating eicosanoids, more specifically cyclooxygenase products, are likely to modulate the reaction. Cultured cells were treated with JBU and immune reactive sites were found in the cells along with damage to the cytoskeleton. The highest concentration of JBU used in the cultured cells also led to nuclei aggregation of adherent hemocytes. We have also identified two genes and cloned the transcripts with complete coding sequences of two PLA2s from R. prolixus, Rhopr- PLA2III and Rhopr-PLA2XII. We have analyzed their expression profiles and found the transcripts to be distributed in various tissues, but at different levels. We have knocked down 70% of Rhopr-PLA2XII expression in 5th instar R. prolixus, and JBU's toxicity was decreased by more than 50%, indicating that Rhopr-PLA2XII gene is linked to JBU's toxic effect in this insect. This was the first time effects of an urease on insect hemocytes were demonstrated. The PLA2 genes here presented were also the first to be identified and to have their transcripts cloned in a Chagas’ disease vector. Our findings support previous data demonstrating that eicosanoids modulate JBU's toxicity, and contribute to the understanding of the mechanisms of entomotoxic action of this multifunctional protein.

Vibrio parahaemolyticus (Vp) infection is commonly caused by the consumption of raw or undercooked shellfish. Raw oysters are associated with most Vp outbreaks. Pathogenic Vp express thermostable-direct hemolysin (tdh) and to some extent thermostable-related hemolysin (trh). Additionally, some pathogenic Vp express urease (uh). The objectives of this work were to discern any relationships between urease (uh) expression, tdh/trh expression, and hemolytic activity in pathogenic and non-pathogenic clinical strains, and to compare urease, motility, tdh/trh expression, and hemolytic activity in raw oyster isolates. This information would determine if urease could be used as a biomarker to detect pathogenic Vp. About 80% of pathogenic strains were uh+ and all non-pathogenic strains were uh-. Two oyster samples were uh+ and no tdh or trh was detected in raw oyster strains.

A adubação nitrogenada de soqueira de cana-de-açúcar no Brasil normalmente é feita no período seco do ano e a principal fonte de N é o nitrato de amônio, apesar de a ureia ser o principal fertilizante nitrogenado consumido no Brasil e no mundo. Para viabilizar o uso de ureia em áreas de cana-de-açúcar colhida sem queima, com grande quantidade de palha recobrindo o solo, devem ser adotadas estratégias que reduzam as perdas de amônia por volatilização, como uso de ureia estabilizada com inibidores de urease. Trabalhos prévios indicaram a necessidade de aumentar a concentração do inibidor de urease NBPT na ureia para reduzir perdas de amônia por volatilização em áreas de cana-crua, porém os efeitos na produtividade da cultura ainda não foram estudados. A hipótese deste trabalho é de que o aumento da concentração do inibidor de urease NBPT na ureia irá proporcionar ganhos de produtividade comparado à ureia convencional, demonstrando a viabilidade do uso de ureia estabilizada para adubação de soqueira de cana-crua. O presente trabalho foi executado em dois locais (Experimento 1, Latossolo Vermelho-Amarelo distrófico de textura muito argilosa e Experimento 2, Latossolo Vermelho-Amarelo eutrófico de textura média) para avaliar o comportamento produtivo de soqueiras de cana-de-açúcar em função de doses de N nas formas de nitrato de amônio, ureia e ureia estabilizada com diferentes concentrações de NBPT. O delineamento experiemental foi de blocos inteiramente casualizados no esquema fatorial 6 x 2 + 1, sendo seis fontes de N (nitrato de amônio, ureia e ureia estabilizada com quatro doses de NBPT variando de 530 a 2000 mg kg-1), duas doses de N (50 e 100 kg ha-1 de N) e um tratamento adicional (Controle, sem adubação nitrogenada). Foram avaliados o perfilhamento, teor foliar de N, índice SPAD, produtividade de colmos, acúmulo de N na parte aérea e os atributos tecnológicos. Também foi avaliada a atividade enzimática da glutamina sintetase (GS) e nitrato redutase (NR) no Experimento 2. Os dados foram submetidos a análise de variância ao nível de 10 % de significância pelo teste F, e os fatores significativos foram comparados pelo teste Tukey a 10 % de significância. Os teores foliares de N não foram alterados pela interação dos fatores, sendo mais importante o aumento da dose de N, o que também ocorreu para atividade das enzimas GS e NR e para o índice SPAD. A produtividade de colmos foi influenciada distintamente entre as áreas. No Experimento 1, houve resposta significativa para as doses de N, independente da fonte de N . No Experimento 2 não houve diferença significativa na produtividade de colmos entre as doses e fontes de N. Os resultados deste trabalho indicam que não é necessário aumentar a concentração de NBPT na ureia e que, tanto a ureia convencional quanto a ureia estabilizada podem ser utilizadas para adubação nitrogenada de soqueira de cana-de- açúcar como fontes opcionais ao nitrato de amônio. / Nitrogen fertilization of sugarcane ratoon in Brazil is usually performed in the dry period of the year and the main source of N is ammonium nitrate, although urea is the main nitrogen fertilizer consumed in Brazil and in the world. In order to allow urea usage in green cane trash blanketing (GCTB) systems, with high amount of straw left on soil surface, strategies that reduce ammonia losses are required, such as the use of urea stabilized with urease inhibitors. Previous research indicated the need to increase the concentration of the urease inhibitor NBPT in urea to reduce ammonia losses in GCTB systems, but the effects on such increase on yield performance is unclear. This study was undertaken to test the hypothesis that increasing the concentration of NBPT in urea will provide yield gains when compared to untreated urea, demonstrating the feasibility of using stabilized urea in GCTB areas. Two field trials (Experiment 1, Oxisols of very clayey texture and Experiment 2, medium-texture Oxisols) were set up to evaluate the yield performance of sugarcane fertilized with N rates as ammonium nitrate, urea and urea stabilized with different concentrations of NBPT. The experimental design was a complete randomized blocks on factorial scheme 6 x 2 + 1, with six N sources (ammonium nitrate, urea and urea stabilized with NBPT concentration ranging from 530 to 2000 mg kg-1), two doses of N (50 and 100 kg ha-1 of N) and an additional control (no N fertilization). It was evaluated the tillering, foliar N content, SPAD index, crop yield, shoot N accumulation and the technological attributes. The enzymatic activity of glutamine synthetase (GS) and nitrate reductase (NR) was also evaluated in Experiment 2. Data were submitted to analysis of variance at the 10 % level of significance by the F test, and the significant factors were compared by the Tukey test at 10 % significance. Leaf N contents weren\'t affected by the interaction of the factors, being more important the increase of the dose of N, which also occurred for the activity of GS, NR and for the SPAD index. Sugarcane response to N fertilization varied among sites. In Experiment 1, there was a significant response to N rates, independently of N sources evaluted. In Experiment 2 there was no significant effect of N sources or rates on sugarcane yield. The results of this study indicate that increasing NBPT concentration in urea will not improve sugarcane yield. However, both urea and stabilized urea resulted in similar yield performance when compared to ammonium nitrate for fertilization of GCTB systems.

A utilização de inibidores de nitrificação pode ser uma alternativa interessante para aumentar a eficiência do uso do fertilizante nitrogenado em diversas culturas, porém, essa alternativa vem sendo pouco estudada em condições de solo e clima do Brasil. Assim, objetivou-se com esse trabalho avaliar a eficiência do inibidor de nitrificação fosfato de 3,4-dimetilpirazol (DMPP) em três solos com gradiente textural, bem como avaliar o destino do nitrogênio (N-NO3-, N-NH4+ e 15N) no solo, a absorção e o uso do nitrogênio (N-total e 15N) nas plantas de algodão. Três experimentos foram montados e desenvolvidos. No primeiro foi efetuada a incubação do solo em condições de laboratório para avaliar a inibição da nitrificação pelo DMPP aplicado na forma de ureia e sulfonitrato de amônio (SNA) em três solos (Neossolo Quartzarênico - NQ, Latossolo Vermelho Amarelo - LVA, Latossolo Vermelho - LV). No segundo experimento plantas de algodão foram cultivadas em colunas de lixiviação com os mesmos solos, recebendo ureia e sulfonitrato de amônio, com e sem DMPP como fonte de N. Foram avaliados a produção de matéria seca, o acúmulo de nutrientes nas plantas, a eficiência de uso do N pelo algodoeiro, a lixiviação e a quantidade de N mineral no solo após o cultivo do algodão por 60 dias. No terceiro experimento, plantas de algodão foram cultivadas também em colunas lixiviação, porém, com um solo de textura média (Latossolo Vermelho Amarelo), o qual recebeu três doses de N em cobertura (50, 100 e 150 kg ha-1 de N) na forma de ureia marcada no isótopo 15N, com e sem DMPP. Foram avaliados a produção de matéria seca, teor de N e recuperação do N aplicado na planta, lixiviação de N, teor de N-total, nítrico e amoniacal no solo, e recuperação do N aplicado no solo após o cultivo do algodão, por 90 dias. Melhores resultados foram obtidos com a aplicação do DMPP em ureia em relação ao SNA. No experimento de incubação, o DMPP foi capaz de manter menor o teor de nitrato nos três solos analisados. A nitrificação do N na ureia foi mais rápida comparado ao SNA, o que permitiu melhor desempenho do inibidor na ureia em dois dos três solos estudados. O efeito do DMPP aumentou seguindo a seguinte ordem: NQ>LVA>LV. O inibidor foi mais eficiente nos solos com menor teor de argila e matéria orgânica. O uso do DMPP em ureia aplicada no solo arenoso (NQ) reduziu significativamente a lixiviação de N e aumentou a produção de matéria seca, a eficiência do uso do N e a absorção de fósforo pela planta. No solo de textura média (LVA), sob irrigação intensa, o DMPP reduziu significativamente as perdas de N do sistema e aumentou a recuperação do 15N aplicado na planta e no solo, o que, porém, não se traduziu em maior produção de matéria seca provavelmente pelo N não ter sido limitante, devido à mineralização da matéria orgânica. As atividades das enzimas redutase do nitrato e urease não diferiram entre tratamentos com e sem DMPP / The use of nitrification inhibitors may be an interesting alternative to increase nitrogen fertilizer use efficiency in different crops, although it has been little studied in soil and climate conditions of Brazil. This study aimed to evaluate the efficiency of the nitrification inhibitor 3,4-dimethylpyrazole phosphate (DMPP) in three soils with textural gradient (represented by clay percentage), as well as to evaluate the fate of soil nitrogen (N-NO3-, N-NH4+ and 15N), nitrogen uptake, and N-use efficiency (total-N and 15N) by cotton plants. Three experiments were set and carried out in a controlled environment. In the first one, a laboratory incubation was performed to evaluate the inhibition of nitrification by DMPP applied to urea and ammonium sulfate nitrate (ASN) in three soils (Typic Quartzipsammnet - NQ, Typic Hapludox - LVA, Rhodic Hapludox - LV). In the second experiment, leaching columns with the same soils were planted with cotton receiving ammonium sulfate nitrate and urea with or without DMPP as nitrogen source. It were evaluated plant dry matter yield (shoot plus roots), nutrient uptake and nitrogen use efficiency by cotton plants, as well as the nitrogen leaching, and mineral nitrogen amount in the soil after cotton growth, for 60 days. In the third experiment, leaching columns with a medium textured soil (LVA) were planted with cotton and received three nitrogen rates in topdressing (50, 100 and 150 kg ha-1) as 15N-urea with and without DMPP. The production of dry matter, nitrogen content and recovery of applied N in the plant and soil, as well as the nitrogen leaching, total nitrogen, nitrate and ammonium in the soil were evaluated after cotton growth for 90 days. Best results were obtained with the application of DMPP to urea than in ASN. In the incubation experiment, the DMPP was able to maintain lower nitrate content in the three soils. The nitrification of nitrogen from urea was faster than the one from ASN, which allowed a better performance of the inhibitor in the urea in two out of three soils analyzed. The effect of DMPP increased in the following order: NQ> LVA> LV. The inhibitor was more effective in soils with lower clay and organic matter contents. The use of DMPP in urea applied on the sandy soil (NQ) significantly reduced N leaching and increased dry matter production, nitrogen use efficiency and phosphorus uptake by cotton plants. In a medium textured soil (LVA) under intense irrigation, DMPP significantly reduced N losses in the system and increased the recovery of applied 15N in plant and soil, which however did not translate into higher dry matter production because nitrogen was probably not limiting. The activity of the enzymes nitrate reductase and urease were not different between treatments with and without DMPP

No presente trabalho, o peptídeo inseticida recombinante Jaburetox-2Ec, derivado da urease de Canavalia ensiformis (Jack bean) foi estudado, principalmente através de técnicas de espectroscopia de espalhamento de luz e raios-X. Foi analisada a tendência do peptídeo a se agregar em diferentes condições físico-químicas quando em solução aquosa, e a sua interação com membranas de lipossomas miméticos de plaquetas humanas. A partir dos dados de raio hidrodinâmico, raio de giro, e massa molar ponderal média obtidos do peptídeo em solução, foi possível observar uma tendência para maior agregação numa faixa em torno de pH 5,5, bem como ausência de agregação em pH inferior a 4,0 e superior a 7,0. Não se verificou nenhum efeito visível no nível de agregação com a adição de agente redutor ou íons, sendo que a exposição ao oxigênio do ar levou a um aumento da mesma. Os estudos de interação do Jaburetox-2Ec com lipossomas revelaram uma significante mudança estrutural na membrana, que se mostrou mais intensa com uma maior concentração do peptídeo. Foram, através de software, feitos ajustes teóricos das curvas de espalhamento de raios-X à baixos ângulos dos lipossomas, a fim de quantificar as mudanças nos parâmetros físicos das membranas causados pela ação do peptídeo. A formação de poros na membrana pelo peptídeo foi proposta como explicação para os resultados encontrados. / In the present work, the insecticide recombinant peptide Jaburetox-2Ec, derived from Canavalia ensiformis (Jack bean) urease, was studied, primarily by light and X-ray scattering techniques. Its tendency to aggregate in aqueous solution under different physical-chemical conditions, and its interaction with human platelet mimetic liposome membranes were analyzed. From the data relative to hydrodynamic radii, radii of gyration and mean molecular weight obtained from the peptide in aqueous solution, it was possible to observe a tendency for greater aggregation around pH 5.5, as well as an absence of aggregation at values of pH below 4.0 and above 7.0. No visible effect on the level of aggregation was verified with the addition of reducing agent or ions, whereas the exposure to oxygen in the air resulted in an increase in this level. The studies of Jaburetox-2Ec interaction with liposomes revealed a significant structural change in the membrane, which was shown to be more intense in higher peptide concentrations. Software-assisted theoretical fits were made for the experimental small-angle X-ray scattering curves aiming to quantify the changes in the physical parameters of the membranes caused by peptide action. The formation of pores in the membrane was proposed as an explanation to the results found.

No presente trabalho, o peptídeo inseticida recombinante Jaburetox-2Ec, derivado da urease de Canavalia ensiformis (Jack bean) foi estudado, principalmente através de técnicas de espectroscopia de espalhamento de luz e raios-X. Foi analisada a tendência do peptídeo a se agregar em diferentes condições físico-químicas quando em solução aquosa, e a sua interação com membranas de lipossomas miméticos de plaquetas humanas. A partir dos dados de raio hidrodinâmico, raio de giro, e massa molar ponderal média obtidos do peptídeo em solução, foi possível observar uma tendência para maior agregação numa faixa em torno de pH 5,5, bem como ausência de agregação em pH inferior a 4,0 e superior a 7,0. Não se verificou nenhum efeito visível no nível de agregação com a adição de agente redutor ou íons, sendo que a exposição ao oxigênio do ar levou a um aumento da mesma. Os estudos de interação do Jaburetox-2Ec com lipossomas revelaram uma significante mudança estrutural na membrana, que se mostrou mais intensa com uma maior concentração do peptídeo. Foram, através de software, feitos ajustes teóricos das curvas de espalhamento de raios-X à baixos ângulos dos lipossomas, a fim de quantificar as mudanças nos parâmetros físicos das membranas causados pela ação do peptídeo. A formação de poros na membrana pelo peptídeo foi proposta como explicação para os resultados encontrados. / In the present work, the insecticide recombinant peptide Jaburetox-2Ec, derived from Canavalia ensiformis (Jack bean) urease, was studied, primarily by light and X-ray scattering techniques. Its tendency to aggregate in aqueous solution under different physical-chemical conditions, and its interaction with human platelet mimetic liposome membranes were analyzed. From the data relative to hydrodynamic radii, radii of gyration and mean molecular weight obtained from the peptide in aqueous solution, it was possible to observe a tendency for greater aggregation around pH 5.5, as well as an absence of aggregation at values of pH below 4.0 and above 7.0. No visible effect on the level of aggregation was verified with the addition of reducing agent or ions, whereas the exposure to oxygen in the air resulted in an increase in this level. The studies of Jaburetox-2Ec interaction with liposomes revealed a significant structural change in the membrane, which was shown to be more intense in higher peptide concentrations. Software-assisted theoretical fits were made for the experimental small-angle X-ray scattering curves aiming to quantify the changes in the physical parameters of the membranes caused by peptide action. The formation of pores in the membrane was proposed as an explanation to the results found.