O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

Made available in DSpace on 2014-08-26T17:15:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 137.pdf: 791646 bytes, checksum: 39acf8b8b6ba9b68e5a239ea71e51227 (MD5) Previous issue date: 2006 / A raiva é uma das doenças mais temidas entre as diferentes zoonoses que ameaçam o Homem, pois evolui sempre para o êxito letal, sendo, na prática, sua morbidade igual à mortalidade. Acrescem-se ainda os prejuízos econômicos, causados ao rebanho bovino nos focos de raiva epizoótica, seu impacto geral na economia pecuária, reduzindo a produção de leite e carne, e suas implicações na área de Saúde Pública. Através da utilização de técnicas clássicas e moleculares, o presente estudo, visou estudar a diversidade molecular das amostras de vírus da raiva provenientes de animais domésticos e silvestres que atualmente são identificadas nas diferentes regiões do Brasil (Norte, Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste), comparando-as entre si e entre amostras originárias de um município do Estado do Rio de Janeiro (Porciúncula), com base em seqüenciamento do gene codificador da nucleoproteína. A técnica de RT-PCR foi aplicada em 32 amostras de tecido nervoso oriundo de animais suspeitos de estarem acometidos pela raiva, demonstrando 100% de concordância com os resultados apresentados pelas provas clássicas, permitindo diagnóstico positivo inclusive em amostras que se apresentam em estado de putrefação. Treze das amostras de vírus isoladas foram parcialmente seqüenciadas, tendo sido encontrado formação dos principais grupos esperados de amostras de vírus da raiva, ou seja, variante antigênica 2,3, amostras fixas e variante de vírus de raiva de sagüi. Foi evidenciado, ainda, um padrão regional de distribuição de vírus da raiva associado à variante antigênica 3. A obtenção de dados derivados do seqüenciamento vem a permitir um melhor entendimento da diversidade molecular das amostras de vírus da raiva circulantes nas regiões em estudo, representando um passo fundamental para a geração de informações a serem utilizadas na epidemiologia molecular da raiva, determinando fontes de infecção, origens de surtos e relações genéticas geográficas entre os vírus da raiva detectados a partir de diferentes espécies animais. / Rabies is one of the most feared zoonosis, once it always results in the death of the affected patient, what makes rabies morbidity equal to its mortality. Furthermore, economic losses due to rabies epidemics in cattle, the economic impact in agrobusiness derived from decreased milk and meat production and implications in public health must also to be taken into account. Using classic and traditional techniques, the present research aimed to study the molecular diversity of rabies virus strains from domestic and wild animals that circulate in different Brazilian regions (North, Northeastern, Southeastern, South and Center-Western) comparing the strains amongst them and with strains from a municipality from Rio de Janeiro State (Porciúncula) based on the gene coding for the nucleoprotein. The RT-PCR was applied to 32 samples of central nervous system tissue of rabies-suspected animals, showing an agreement of 100% with the classic tests, allowing a positive diagnosis even in decomposed samples. Thirteen out of these 32 samples were submitted to partial sequencing resulting in the expected groups of rabies virus variants, i. e., antigenic variants 2, 3, fixed strains and marmoset strains. A regional pattern was found regarding the variant 3 of rabies virus. Data obtained from DNA sequencing allow a better understanding of the molecular diversity of the rabies virus strains circulating in the regions under study, a fundamental step for the generation of information to be used in the molecular epidemiology of rabies, as the determination of sources of infection, origins of outbreaks and phylogeographic relationships among rabies virus strains from different species.

Objetivo: Realizou-se um estudo, no período de 2002 a 2009, com a finalidade de verificar se as mudanças nas classes de cobertura da terra e no uso do solo podem exercer influência na ocorrência da raiva, nos municípios de Jacareí e de Santa Branca, situados na Região do Vale do Paraíba, no Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil. Métodos: A ferramenta utilizada para avaliar estas alterações foi o sensoriamento remoto, através de imagens de satélite Land-sat. Para pesquisar a presença do vírus da raiva (RABV) foram coletados animais silvestres atropelados nas rodovias, morcegos encontrados na área urbana em atitude suspeita, morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus e animais de interesse econômico (ADIE) que vieram a óbito por enfermidade com sintomatologia nervosa. O material coletado, sistema nervoso central (SNC), desses animais foi encaminhado para o laboratório de referência nacional, o Instituto Pasteur de São Paulo (IP-SP) e para o Laboratório de Sanidade Animal da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA)- Pólo Regional do Vale Paraíba (PRDTA/VP) - Pindamonhangaba-SP. A determinação da presença do antígeno viral foi feita através da prova de imunofluorescência direta (IFD) e o isolamento do vírus através da inoculação intracerebral em camundongos (IC). Os inóculos das amostras foram submetidos à prova de reação em cadeia pela polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) para verificar a presença do vírus da raiva. Resultados: No período de estudo tivemos a ocorrência de dez casos da doença, sendo três em morcegos insetívoros na zona urbana de Jacareí, e sete em ADIE, sendo dois, em Jacareí e cinco, em Santa Branca. Todos os animais silvestres terrestres examinados foram negativos para a presença do vírus da raiva em todas as provas realizadas (IFD, IC, RT-PCR). O material proveniente dos morcegos foi negativo para as provas de IFD e IC, porém três amostras, oriundas de morcegos insetívoros, resultaram positivas para a prova de RTPCR. As amostras de ADIE examinadas resultaram positivas para todas as provas realizadas. O sequenciamento genético utilizou amplificações referentes à glicoproteína viral das 8 amostras positivas para rt-pcr, obtendo para os cinco isolados de ADIE linhagem de desmodus rotundus e para os três isolados de morcegos linhagens de nyctinomops laticaudatus e tadarida brasiliensis. Quando foi estudada a cobertura do solo e seu uso, considerando os municípios, constatou-se que não haviam ocorrido mudanças significativas entre 2002 e 2009. Optou-se por fazer buffers de raio de 3 km tendo como centro de cada buffer as coordenadas geográficas de casos positivos para raiva. Como em duas situações houve sobreposição entre áreas de buffers, resolveu-se considerar a área da união dos mesmos. Foi interessante que, mesmo nestes buffers não houve mudanças significativas, apesar da ocorrência da doença. Conclusão: Na escala utilizada, considerada micro, a enfermidade aconteceu, mesmo sem mudanças aparentes na região. Provavelmente, em uma escala macro outros resultados poderiam ser obtidos / Objective: This study was carried out during the period of 2002-2009, with the purpose to verify whether the changes in types of land cover and in land use can influence the occurrence of rabies in Jacareí and Santa Branca, situated in the Vale do Paraíba, State of São Paulo, southeastern brazil. Methods: The tool used to evaluate these alterations was the remote sensing through images of satellite land-sat. In order to search for the presence of rabies virus, brain materials were collected from wild animals roadkilled in highways, bats found in the urban area in suspicious attitude, desmodus rotundus hematophagous bats captured in rural areas and farm animals of economic importance (aei) dead with suspect of rabies. For rabies diagnosis, specimens of central nervous system (cns) of these animals were sent to the Pasteur Institute of São Paulo (IP-SP) - national reference laboratory and to the laboratory of animal Paulista Agency for Agribusiness Technology (APTA) - Polo Valley Regional of Paraíba (PRDTA / VP), in Pindamonhangaba, state of SP. The presence of viral antigen was determined by the direct fluorescent antibody technique (D-FAT) and the isolation of the virus by means of intracerebal mouse inoculation test (MIT). The brain suspensions were submitted to reverse transcriptase. Polymerase chain reaction to check the presence of rabies virus. Results: In the period of study, 10 positive cases were detected, being 3 in insectivorous bats in the urbane zone of jacareí, and 7 in aei, being 2 in jacareí and 5 in santa branca. All the terrestrial wild animals examined were negative for the presence of rabies virus in all tests performed (d-fat, mit, and rt-pcr). The materials from bats were found negative for the d-fat and mit, however, three samples originating from insectivorous bats turned out to be positive for rt-pcr. The positive samples from aei were positive for all tests carried out. The genetic sequencing of the g gene of eight rt-pcr positive rabies virus isolates derived from aie, five corresponded to the desmodus rotundus lineage and the three bat isolates were related to lineages of nyctinomops laticaudatus and tadarida brasiliensis. When land coverage and its use were analyzed, considering the municipalities, it was found that no significant changes occurred between 2002 and 2009. Then buffers of 3 km in radius were chosen taking as the center of each buffer the geographical coordinates of positive rabies cases. Since in two situations there was superposition between areas of buffers, it was resolved to consider the junction area of the buffers. Even in these buffers there was no significant change, despite the occurrence of the disease. Conclusion: it was concluded that the disease has occurred even without any apparent changes in the region, due to the (micro) scale used in this study. Probably, in a macro scale, other results might be obtained

As células de Drosophila melanogaster (S2) têm sido utilizadas como sistemas de expressão de proteínas recombinantes. Neste trabalho foi utilizada uma linhagem S2 geneticamente modificada com vetores de expressão para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV). O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento destas células cultivadas em processo contínuo, visando-se manter elevadas concentrações celulares. Para os ensaios contínuos, utilizou-se meio livre de soro fetal bovino SF 900 II em um reator Biostat B, com 500 mL de volume útil e controle de temperatura (28ºC), oxigênio dissolvido (30% da saturação com ar), frequência de agitação (90 rpm) e monitoramento do pH. Verificou-se o comportamento do metabolismo celular em diferentes vazões específicas de alimentação (0,8 dia-1, 0,5 dia-1 e 0,2 dia-1) através parâmetros como fatores de conversão e variáveis como concentração celular máxima, concentração residual de glicose e glutamina, dentre outras. Ainda, avaliou-se a influência de aminoácidos, tais como, glutamina, asparagina, prolina, serina e cisteína suplementados no meio de alimentação, sob a concentração celular alcançada no estado estacionário. Diferentes vazões específicas de alimentação - em estado estacionário - resultaram em concentrações celulares próximas entre si. A adição de glutamina (1,7 g/L) no meio de alimentação não contribuiu para o aumento na concentração celular, indicando que este aminoácido não limitou o processo de crescimento celular. Uma observação similar ocorreu quando o meio SF 900 II foi suplementado com asparagina, prolina, serina e cisteína. Porém, a adição de cisteína (0,3 g/L) isoladamente no meio de alimentação resultou em um aumento de 12% na concentração celular quando comparada ao meio SF 900 II puro. Assim, pode-se concluir que a cisteína limitava o crescimento celular. Verificou-se ainda que a célula não apresentou grande variabilidade nos diferentes ensaios, sob mesma vazão específica de alimentação. Isso indica que processo contínuo constituiria um método viável para a compreensão do metabolismo desta célula. / Drosophila melanogasters cells (S2) have been used as expression systems for recombinant proteins. This study uses a genetically modified S2 line with expression vectors for production of rabies virus glycoprotein (RVPG). The main objective was to evaluate the growth trend of S2 cells in a continuous process, aiming to maintain high cell concentrations. In order to set the continuous culture, the experiments used serum-free medium SF 900 II in a Biostat B reactor, with working volume of 500 mL and temperature controlled at 28 º C, dissolved oxygen at 30% air saturation, agitation speed at 90 rpm, and pH monitoring. Cellular metabolism behavior was observed under different dilution rates (0.8 day-1, 0.5 day-1, and 0.2 day-1) through parameters such as yield factors, in addition to variables such as maximum cell concentration, residual concentration of glucose and glutamine, among others. Yet, this work evaluates the influence of amino acids such as glutamine, asparagine, proline, serine and cysteine supplemented in the feed, over cellular concentration value reached in the steady state. Different dilution rates decreasing (under steady state) resulted in cell concentrations quite simillar. The addition of glutamine (1.7 g/L) in the feed did not contribute to the increase of cell concentration, which indicates that this amino acid did not limit cell growth process. A similar observation occurred when SF 900 II medium was supplemented with asparagine, proline, serine and cysteine. However, the cysteine addition (0.3 g/L) alone in the feed resulted in a 12% increase in cell concentration, compared to pure SF 900 II. Thus, it is possible to conclude that cysteine limited cell growth. It was also found that the cell did not show great variability in the various tests under the same dilution rate. This indicates that chemostat culture would be a viable method for understanding the metabolism of this cell.

O desenvolvimento de vacinas contra a raiva tão eficientes quanto as atuais ainda é considerado importante para a profilaxia dessa doença devido ao alto número de mortes por ano no mundo. Este trabalho mostra dois sistemas para a expressão recombinante do principal antígeno da raiva, a glicoproteína viral (RVGP): células Schneider 2 de Drosophila melanogaster estavelmente transfectadas (S2 rRVGP) e vírus Semliki Forest (SFV) carregando o RNA da RVGP (SFVRVGP). Ensaios de purificação por cromatografia de afinidade, da rRVGP de S2 rRVGP produzida em biorreator, demonstraram resultados promissores para o isolamento de monômeros da rRVGP. Para os estudos de imunogenicidade, camundongos foram vacinados com rRVGP de S2 rRVGP e SFV-RVGP. Dosagem de anticorpos anti-glicoproteína do vírus da raiva, neutralizantes, IgG1 e IgG2a, e citocinas demonstraram que o SFV-RVGP induziu predominantemente uma resposta imune do tipo celular e que os dois vetores foram capazes de expressar uma rRVGP imunogênica, apresentando um potencial uso clínico (veterinário e humano). / The development of new and equally efficient rabies vaccines is still considered important to the prophylaxis of the disease, which is responsible for many deaths per year worldwide. This work used two systems for recombinant expression of the major rabies antigen, the viral glycoprotein (RVGP): stably transfected Drosophila melanogaster Schneider 2 cells (S2 rRVGP) and Semliki Forest Virus (SFV) carrying the RNA of RVGP (SFV-RVGP). Purification assays of the rRVGP by metal ion affinity chromatography, from S2 rRVGP cells produced in bioreactor, showed promising results for rRVGP monomers isolation. Analysis of antibodies anti-rabies virus glycoprotein, neutralizing, IgG1 and IgG2a, and citokines showed that the SFV-RVGP induced predominantly a cellular immune response, and both vectors were capable of expressing an immunogenic rRVGP, what reinforces potential clinical applications (veterinary or human).

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/μL, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/μL, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

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Células eucariotas usadas como plataforma de expressão de proteínas recombinantes são geralmente cultivadas com soro fetal bovino (SFB), porém, abordagens biotecnológicas atuais sobre cultura de células devem evitar o uso deste suplemento, devido a problemas de custo, variações entre os lotes e risco de contaminação. Assim, nosso objetivo foi expressar as proteínas recombinantes: GFP (proteína verde fluorescente), NS3 (proteína não estrutural 3 do vírus da hepatite C) e RVGP (glicoproteína do vírus da raiva) em células BHK-21 adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM) usando o sistema de expressão baseado no Semliki Forest Virus (SFV). Os resultados do presente trabalho mostraram que células adaptadas em SFM cresceram de forma eficiente, produziram mais partículas virais recombinantes de SFV do que células suplementadas com soro, sendo que estas partículas virais podem ser usadas diretamente para imunização, pois garantiram uma amplificação e expressão eficiente das diferentes proteínas dentro da célula hospedeira. / Eukaryotic cells are cultured with serum, however current biotechnological approaches of cell culture need to avoid using of this supplement, due to the high costs, lot-to-lot variation and risk of contamination. Thus, our aim was to express the recombinant protein: GFP (green fluorescent protein); NS3 (Hepatitis C virus non-structural protein 3) and RVGP (rabies virus glycoprotein) in BHK-21 cells cultured in serum free culture based on Semliki Forest Virus system. The results of this work showed that cells cultured in serum-free media (SFM) were grown efficiently, they were produce more recombinant viral particles when compared with cells supplemented with SFB. These viral particles can be used directly for immunization, since generated amplification and expression efficient of different proteins within the host cell.

Células eucariotas usadas como plataforma de expressão de proteínas recombinantes são geralmente cultivadas com soro fetal bovino (SFB), porém, abordagens biotecnológicas atuais sobre cultura de células devem evitar o uso deste suplemento, devido a problemas de custo, variações entre os lotes e risco de contaminação. Assim, nosso objetivo foi expressar as proteínas recombinantes: GFP (proteína verde fluorescente), NS3 (proteína não estrutural 3 do vírus da hepatite C) e RVGP (glicoproteína do vírus da raiva) em células BHK-21 adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM) usando o sistema de expressão baseado no Semliki Forest Virus (SFV). Os resultados do presente trabalho mostraram que células adaptadas em SFM cresceram de forma eficiente, produziram mais partículas virais recombinantes de SFV do que células suplementadas com soro, sendo que estas partículas virais podem ser usadas diretamente para imunização, pois garantiram uma amplificação e expressão eficiente das diferentes proteínas dentro da célula hospedeira. / Eukaryotic cells are cultured with serum, however current biotechnological approaches of cell culture need to avoid using of this supplement, due to the high costs, lot-to-lot variation and risk of contamination. Thus, our aim was to express the recombinant protein: GFP (green fluorescent protein); NS3 (Hepatitis C virus non-structural protein 3) and RVGP (rabies virus glycoprotein) in BHK-21 cells cultured in serum free culture based on Semliki Forest Virus system. The results of this work showed that cells cultured in serum-free media (SFM) were grown efficiently, they were produce more recombinant viral particles when compared with cells supplemented with SFB. These viral particles can be used directly for immunization, since generated amplification and expression efficient of different proteins within the host cell.