Vírus da raiva provenientes de 23 morcegos de espécies hematófagas, frugívoras e insetívoras foram caracterizados geneticamente pelo seqüenciamento completo da região que codifica a nucleoproteína N. A análise filogenética das seqüências, incluindo lyssavirus e isolados de morcegos do Chile e Estados Unidos, mostrou que os diferentes isolados do vírus da raiva foram de modo geral segregados em quatro grupos genéticos distintas: morcegos hematófagos, morcegos insetívoros 1, 2 e 3. Os morcegos insetívoros 1 constituiram-se por isolados de Eptesicus furinalis: BR-EF1, BR-EF2, BREF3, BR-EF-4, BR-EA1 e BR-NL2; os morcegos insetívoros 2 consistiram de isolados de Molosssus spp: BR-MM1, BR-MM2 e BR- MA1 e os morcegos insetívoros 3 isolados de Nictinomops laticaudatus: BR-NL1 e BR-NL3. A homologia de nucleotídeos entre cada grupo de morcegos insetívoros 1, 2 e 3 foi maior que 99%, 97% e 99%, respectivamente. O grupo de morcegos hematófagos foi representado pelos isolados de: 3 morcegos hematófagos Desmodus rotundus (BR-DR1, BR-DR2 e BR-DR3); 5 morcegos frugívoros Artibeus lituratus BR-AL1, BR-AL2, BR-AL3, BR-AL4 e Artibeus planirostris BRAP1; 2 morcegos insetívoros (BR-MR1 e BR-EA2) e 2 de espécies não identificadas (BR-BAT1 e BR-BAT2). Entre as amostras seqüenciadas foram selecionadas cinco (BR-EF1, BR-NL1, BR-AL3, BR-MM1, BR-DR1) e um isolado de cão (BR-C) para os estudos de patogenicidade em camundongos albinos suíços inoculados pela vias intracerebral (IC) e intramuscular (IM). Todas as amostras quando inoculadas em camundongos pela via IC apresentaram-se patogênicas, provocando a morte dos mesmos num período de 4 a 14 dias pós-inoculação. No entanto, 500DLIC50 das mesmas amostras inoculadas pela via IM levaram a uma mortalidade de camundongos de: 60% (BR-DR1); 50% (BR-C, BR-NL); 40% (BR- AL3); 9,5% (BR-MM1); 5,2% (BR-EF10). As mesmas amostras foram utilizadas para a verificação de proteção cruzada, conferida por vacina comercial de uso animal, de camundongos que receberam uma ou duas doses de vacina pela via subcutânea (SC) e desafiados pelas vias IC e IM. Camundongos inoculados com duas doses de vacina foram protegidos quando desafiados pela via IC, com todas as amostras testadas. Quando os camundongos receberam uma dose da mesma vacina houve proteção parcial daqueles desafiados com as amostras de vírus PV e BR-C. Houve proteção de 100% dos camundongos desafiados pela via IM, com exceção daqueles vacinados com uma dose de vacina e desafiados com a amostra PV que apresentaram um índice de 66% de sobreviventes. Os resultados indicam a possibilidade de existir variantes do vírus da raiva espécies específicas circulando em morcegos. Sugerem ainda, que espécies de morcegos hematófagos, frugívoros e insetívoros compartilham o mesmo polimorfismo de vírus. A vacina comercial contra a raiva contendo vírus inativado e de uso veterinário protegeu os camundongos contra o desafio com as diferentes amostras testadas, sugerindo que as vacinas usualmente utilizadas são efetivas no tratamento profilático da raiva transmitida por morcegos, apesar da marcada diferença de neurovirulência dos diferentes isolados quando inoculados em camundongos pela via IM. / Twenty-three rabies viruses isolated from hematophagous, frugivorous and insectivorous bats were characterized genetically by complete sequencing of the region coding the nucleoprotein N. The phylogenetic analysis of the sequences, including the lyssavirus and the bat isolates from Chile and USA revealed that the isolates were segregated into four distinct genetic lineages: those related to the vampire bats and to the insectivorous bats 1, 2 and 3. The isolates related to the insectivorous bats 1 were from the Eptesicus furinalis: BR-EF1, BR- EF2, BREF3, BR-EF-4, BR-EA1 e BR-NL2; those of the insectivorous bats2 included the isolates from Molosssus spp: BR-MM1, BR-MM2 and BR-MA1 and the group 3, by the isolates from the Nictinomops laticaudatus: BR-NL1 and BR-NL3. The homology among each group of the insectivorous bats 1, 2 and 3 were greater than 99%, 97% and 99%, respectively. The lineage related to vampire bats was represented by three isolates from the D. rotundus (BR-DR1, BR-DR2 e BR-DR3); five from the fruit bats Artibeus lituratus (BR-AL1, BR-AL2, BR-AL3, BR-AL4) and Artibeus planirostris (BRAP1); two from insectivorous bats (BR-MR1 and BR-EA2) and two from unidentified species (BR-BAT1 and BR-BAT2). Among the sequenced amples, five bat isolates (BR-EF1, BR-NL1, BR-AL3, BR-MM1, BR- DR1) and one dog isolate (BR-C) were selected for the study of their pathogenicity in Swiss mice, inoculating through intracerebral (IC) and intramuscular (IM) routes. All the isolates, when inoculated via IC, were pathogenic, provoking death in 4 - 14 post inoculation days. However, mice inoculated with 500ICLD50 of the same isolates through IM route were found with different death rates: 60.0% (BR-DR1); 50.0% (BR-C, BR-NL); 40.0% (BR-AL3); 9.5% (BR-MM1) and 5.2% (BR-EF10). The same isolates were used for the assessment of cross protection conferred by a commercial vaccine of veterinary use. The mice were vaccinated subcutaneously, receiving either one or two shots of vaccine, and challenged through IC and IM routes. Mice receiving two shots were protected against all the isolates, when challenged intracerebrally. Mice receiving one shot were found only partially protected against the challenge with the fixed PV strain and BR-C isolate. Mice challenged intramuscularly showed 100.0% of protection, with the exception of those vaccinated with one dose and challenged with PV strain, which were found with 66.0% of survivors. These results indicate the possibility of the existence of rabies virus variants circulating in different species of bat population. The data also suggest that the vampires, frugivorous and insectivorous bats share the same lineage of rabies viruses. The commercial vaccine has protected the mice against the challenge with different rabies virus isolates, suggesting that the vaccines usually employed in the field are effective, although some marked difference in neurovirulence by IM inoculation was found among the isolates tested.

Analisou-se 54 amostras de vírus da raiva isoladas de diferentes espécies animais e de seres humanos do Estado do Maranhão, inicialmente pelas técnicas tradicionais de imunofluorescência direta (IFD) e de inoculação intracerebral em camundongos (ICC), com o objetivo de realizar um estudo de epidemiologia da doença. No reteste, todas as amostras foram positivas na IFD e 19 resultaram negativas à ICC. O comportamento biológico dos isolados foi estudado em camundongos, revelando um período de incubação entre 7 e 17 dias, com sinais clínicos variados e duração média de 4 dias. Para a avaliação da patogenicidade, foram selecionadas cinco amostras do estudo, oriundas de diferentes espécies, como vírus de desafio nos camundongos imunizados com uma vacina comercial de vírus inativado. Os resultados do desafio indicaram que a proteção conferida pela vacina foi baixa para todas as amostras. A presença de anticorpos no soro dos camundongos vacinados foi demonstrada em diferentes períodos de vacinação. A tipificação antigênica de quatro amostras de vírus foi realizada pela imunofluorescência indireta (IFI) utilizando um painel de anticorpos monoclonais (MAbs) procedentes do Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canadá, identificando o perfil correspondente à variante de morcego hematófago Desmodus rotundus. Na caracterização genética com base nos genes que codificam a glicoproteína G e nucleoproteína N, observou-se que os isolados foram divididos em dois grupos genéticos independentes associados a ciclos endêmicos distintos. Esses resultados permitem concluir que no Estado do Maranhão circulam pelo menos duas variantes do vírus da raiva, mantidas por carnívoros terrestres e morcegos hematófagos. Destaca-se que houve variação regional entre as amostras isoladas em diferentes áreas geográficas. Além disso, foram constatados hospedeiros inesperados nos clados formados. Também, não houve variação temporal nas amostras pesquisadas. / Fifty four rabies virus samples isolated from different animal species and humans, diagnosed positive by means of the direct fluorescent antibody test (dFA) and mouse inoculation test (MIT) in the State of Maranhão were selected for an epidemiologic study. In the retest, all these samples were dFA-positive, but 19 were negative by the MIT. The biologic behavior of these samples was assessed in mice by intracerebral inoculation and the incubation period was between 7 and 17 days, showing varied clinical signs with an average duration of 4 days. For the evaluation of the pathogenicity, five rabies viruses isolated from different species were selected, and used as the challenge viruses to be inoculated into mice been vaccinated previously with an inactivated commercial rabies vaccine. The results of the challenge experiments indicated low protection of the vaccine against the challenge viruses. The presence of rabies antibody was demonstrated in the sera of vaccinated mice taken at different intervals after vaccination. The antigenic typing was performed in four samples by using the indirect fluorescent antibody test (IFI) with a panel of monoclonal antibodies (MAbs) provided by the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and the profile identified was closely related to that of the Desmodus rotundus vampire bat. The genetic characterization based on genes coding the glycoprotein G and nucleoprotein N genes indicated that isolates were divided into two independent genetic groups associated to distinct endemic cycles. With the results obtained, we conclude that in the State of Maranhão there are circulating at least two distinct variants of rabies viruses, maintained by terrestrial carnivores and vampire bats. Regional variation among the isolates taken from different geographic areas has been found. And the rabies virus isolates grouped into clades were associated with unusual host species and no temporal variation was observed among the isolates.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_lorena_leonardo_souza.pdf: 798251 bytes, checksum: b0213429356f32517eb7b25ac76b2eeb (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / The rabies virus has two major antigens: the nucleoprotein, a conserved internal protein antigenically and genetically and glycoprotein, a protein responsible for the external adsorption of virus two the host cell and induction of neutralizing antibodies. The development of recombinant DNA technology has opened a new perspective on the control of rabies, since recombinant vaccines have residual pathogenicity and are produced with the antigenic proteins of the virus, without their presence. Furthermore, recombinant proteins can be expressed in order to be used in diagnosis. The objective of this study was to review the literature about rabies, cloning and express the nucleoprotein and glycoprotein of rabies virus using the system Pichia pastoris and evaluate the antigenicity and the immunogenicity of these proteins by Dot blotting, SDS page, Western blotting and ELISA. Glycoprotein synthetic antigen proved to be recognized by anti-rabies from animals experimentally infected with rabies virus strain CVS. And recombinant nucleoprotein expression was confirmed by the techniques of Dot blotting and Western blotting to be recognized by monoclonal anti-histidine. Thus, we conclude that the cloning and expression of synthetic glycoprotein and cloinig and expression nucleoprotein rabies virus by the yeast P. pastoris has been effective, which makes these products an alternative for the production of immunobiological. / O vírus da raiva apresenta dois antígenos principais: a nucleoproteína, uma proteína interna conservada antigênica e geneticamente e a glicoproteína, uma proteína externa responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira e pela indução da produção de anticorpos neutralizantes. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante iniciou uma nova perspectiva no controle da Raiva, já que vacinas recombinantes não têm patogenicidade residual e são produzidas com as proteínas antigênicas do vírus, sem sua presença. Além disso, as proteínas recombinantes podem ser expressas com a finalidade de serem usadas em diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar a glicoproteína e a nucleoproteína do vírus da raiva utilizando o sistema Pichia pastoris e avaliar a antigenicidade e imunogenicidade destas proteínas através do Dot blotting, SDS page, Western blotting, inibição da imunofluorescência e ELISA. A glicoproteína demonstrou ser antigênica ao ser reconhecida por anticorpos anti-rábicos provenientes de animais experimentalmente infectados com o vírus rábico cepa CVS. A nucleoproteína recombinante teve sua expressão confirmada pelas técnicas de Dot blotting e Western blotting ao ser reconhecida por anticorpos monoclonais anti-histidina. Podemos concluir que a levedura P. pastoris é um sistema eficiente para clonagem e expressão da nucleoproteína e glicoproteína do vírus rábico.

Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) mostram que a raiva é um problema de saúde pública podendo acarretar sérios prejuízos ambientais e econômicos, a despeito da existência de vacinas eficazes de uso humano e veterinário. Segundo seu último informe, estima-se que no mundo em torno de 55.000 pessoas por ano morrem de raiva. O cão permanece como principal transmissor da raiva para o homem e também como principal vítima da doença. Nos países que conseguiram controlar a raiva em animais domésticos, o vírus se mantém circulante na natureza por meio dos animais silvestres, sendo os morcegos apontados como a segunda espécie transmissora da raiva a humanos. Os Lyssavirus têm sido detectados em morcegos, em diversos continentes, sendo identificados como transmissor em dez das onze espécies de Lyssavirus. Fósseis de morcego mostram sua presença há 50 milhões de anos. Mas somente em 1911, Carini relacionou pela primeira vez a raiva aos morcegos, levantando a hipótese destes serem os transmissores da doença a outros animais. Há registros de que o vírus da raiva foi isolado em pelo menos 41 das 167 espécies de morcegos brasileiras, sendo que a maioria dessas espécies está relacionada a atividades humanas com a presença destes animais próximos ao local de trabalho e moradia das pessoas. Os morcegos hematófagos Desmodus rotundus são encontrados do norte do México até a costa norte do Chile, região central da Argentina e costa do Uruguai e com exceção do Chile. Esta espécie de morcego tem sido apontada como reservatório natural do vírus da raiva nesta região. Alguns pesquisadores observaram que a raiva em morcegos não hematófagos precede a raiva bovina e em animais de estimação, sugerindo que os morcegos não hematófagos podem ser o elo entre a raiva silvestre e a raiva urbana e o fato de se detectar a variante mantida por morcegos hematófagos Desmodus rotundus em cães e gatos mostra que o papel deste morcego no ciclo da raiva não está limitado à raiva silvestre. As características dos Lyssavirus adaptados a morcegos têm mostrado diferenças quando comparadas à raiva relacionada aos carnívoros, confirmando a necessidade do desenvolvimento de metodologias que permitam estudos complementares mais precisos a respeito da biologia e epidemiologia da raiva em quirópteros. A escassez de dados na literatura, até o momento, a respeito do genoma completo da variante do vírus da raiva mantida por populações de morcegos hematófagos Desmodus rotundus, deixa uma lacuna no entendimento da epidemiologia molecular deste vírus. A importância epidemiológica desta espécie na transmissão da raiva é inquestionável. Neste estudo foi sequenciado e analisado, o genoma da variante do vírus da raiva mantido por populações de morcego hematófago Desmodus rotundus isolado de um morcego hematófago Desmodus rotundus. A amostra, procedente de área endêmica no Estado de São Paulo, foi filogeneticamente comparada com o genoma da amostra padrão para a espécie viral 1 - Rabies virus e outras amostras pertencentes ao ciclo aéreo ou terrestre de transmissão, disponíveis no GenBank, identificando possíveis padrões de diferenciação, próprios do ciclo aéreo, e em alguns casos relacionados somente à variante estudada. / Data from the World Health Organization (WHO) show that rabies is a public health problem which can cause serious environmental and economic damage, despite the existence of effective vaccines for human and veterinary use. According to WHO latest report, estimated that worldwide around 55,000 people per year died of rabies. The dog remains the main transmitter of rabies to humans as well as the main victim of the disease. In countries that were successful in controlling rabies in domestic animals, the virus is still circulating in nature by wild animals and the bats are seen as the second species transmitting rabies to humans. The Lyssavirus have been detected in bats in several continents and is identified as a transmitter in ten of eleven species of Lyssavirus. Bat fossils show their presence for 50 million years. But only in 1911, in the first time Carini related to rabies at bats, raising the possibility of these being the transmitters of the disease to other animals. Reports show that the Rabies virus was isolated in at least 41 of the 167 species of bats in Brazil, with the majority of these species is related to human activities with the animals living near the local job and houses of people. The vampire bat Desmodus rotundus is found from northern Mexico to northern Chile coast, central coast of Argentina and Uruguay and with the exception of Chile. This bat species has been identified as a natural reservoir of the Rabies virus in this region. Some researchers observed that rabies into non-hematophagous bats precedes the bovine rabies and in pets, suggesting that the non-hematophagous bats may be the link between wildlife rabies and urban rabies and the fact that detect the variant maintained by vampire bats Desmodus rotundus in dogs and cats shows that the role of bat rabies in the cycle is not limited to wildlife rabies. The characteristics of Lyssavirus bat adapted have been shown differences when compared to rabies related to the carnivores, confirming the need to develop methods that enable more accurate follow-up studies about the biology and epidemiology of rabies in bats. The paucity of data in the literature to date about the complete genome of the Rabies virus variant maintained by populations of vampire bats Desmodus rotundus leaves a gap in understanding the molecular epidemiology of this virus and the epidemiological importance of this species in the transmission of Rabies virus is unquestionable. In this study we sequenced and analyzed the genome of the Rabies virus variant maintained by populations of bat Desmodus rotundus isolated from a bat Desmodus rotundus. The sample, coming from an endemic area in São Paulo, was phylogenetically compared with the genome of the standard sample for spcies 1 - Rabies virus and other samples belonging to the Terrestrial and Aerial cycles of transmission, available in GenBank, to identify possible patterns of differentiating themselves Aerial cycle and in some cases linked only to variant studied.

Analisou-se 54 amostras de vírus da raiva isoladas de diferentes espécies animais e de seres humanos do Estado do Maranhão, inicialmente pelas técnicas tradicionais de imunofluorescência direta (IFD) e de inoculação intracerebral em camundongos (ICC), com o objetivo de realizar um estudo de epidemiologia da doença. No reteste, todas as amostras foram positivas na IFD e 19 resultaram negativas à ICC. O comportamento biológico dos isolados foi estudado em camundongos, revelando um período de incubação entre 7 e 17 dias, com sinais clínicos variados e duração média de 4 dias. Para a avaliação da patogenicidade, foram selecionadas cinco amostras do estudo, oriundas de diferentes espécies, como vírus de desafio nos camundongos imunizados com uma vacina comercial de vírus inativado. Os resultados do desafio indicaram que a proteção conferida pela vacina foi baixa para todas as amostras. A presença de anticorpos no soro dos camundongos vacinados foi demonstrada em diferentes períodos de vacinação. A tipificação antigênica de quatro amostras de vírus foi realizada pela imunofluorescência indireta (IFI) utilizando um painel de anticorpos monoclonais (MAbs) procedentes do Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canadá, identificando o perfil correspondente à variante de morcego hematófago Desmodus rotundus. Na caracterização genética com base nos genes que codificam a glicoproteína G e nucleoproteína N, observou-se que os isolados foram divididos em dois grupos genéticos independentes associados a ciclos endêmicos distintos. Esses resultados permitem concluir que no Estado do Maranhão circulam pelo menos duas variantes do vírus da raiva, mantidas por carnívoros terrestres e morcegos hematófagos. Destaca-se que houve variação regional entre as amostras isoladas em diferentes áreas geográficas. Além disso, foram constatados hospedeiros inesperados nos clados formados. Também, não houve variação temporal nas amostras pesquisadas. / Fifty four rabies virus samples isolated from different animal species and humans, diagnosed positive by means of the direct fluorescent antibody test (dFA) and mouse inoculation test (MIT) in the State of Maranhão were selected for an epidemiologic study. In the retest, all these samples were dFA-positive, but 19 were negative by the MIT. The biologic behavior of these samples was assessed in mice by intracerebral inoculation and the incubation period was between 7 and 17 days, showing varied clinical signs with an average duration of 4 days. For the evaluation of the pathogenicity, five rabies viruses isolated from different species were selected, and used as the challenge viruses to be inoculated into mice been vaccinated previously with an inactivated commercial rabies vaccine. The results of the challenge experiments indicated low protection of the vaccine against the challenge viruses. The presence of rabies antibody was demonstrated in the sera of vaccinated mice taken at different intervals after vaccination. The antigenic typing was performed in four samples by using the indirect fluorescent antibody test (IFI) with a panel of monoclonal antibodies (MAbs) provided by the Canadian Food and Inspection Agency, Ottawa, Canada, and the profile identified was closely related to that of the Desmodus rotundus vampire bat. The genetic characterization based on genes coding the glycoprotein G and nucleoprotein N genes indicated that isolates were divided into two independent genetic groups associated to distinct endemic cycles. With the results obtained, we conclude that in the State of Maranhão there are circulating at least two distinct variants of rabies viruses, maintained by terrestrial carnivores and vampire bats. Regional variation among the isolates taken from different geographic areas has been found. And the rabies virus isolates grouped into clades were associated with unusual host species and no temporal variation was observed among the isolates.

As células de Drosophila melanogaster (S2) têm sido utilizadas como sistemas de expressão de proteínas recombinantes. Neste trabalho foi utilizada uma linhagem S2 geneticamente modificada com vetores de expressão para a produção da glicoproteína do vírus da raiva (GPV). O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento destas células cultivadas em processo contínuo, visando-se manter elevadas concentrações celulares. Para os ensaios contínuos, utilizou-se meio livre de soro fetal bovino SF 900 II em um reator Biostat B, com 500 mL de volume útil e controle de temperatura (28ºC), oxigênio dissolvido (30% da saturação com ar), frequência de agitação (90 rpm) e monitoramento do pH. Verificou-se o comportamento do metabolismo celular em diferentes vazões específicas de alimentação (0,8 dia-1, 0,5 dia-1 e 0,2 dia-1) através parâmetros como fatores de conversão e variáveis como concentração celular máxima, concentração residual de glicose e glutamina, dentre outras. Ainda, avaliou-se a influência de aminoácidos, tais como, glutamina, asparagina, prolina, serina e cisteína suplementados no meio de alimentação, sob a concentração celular alcançada no estado estacionário. Diferentes vazões específicas de alimentação - em estado estacionário - resultaram em concentrações celulares próximas entre si. A adição de glutamina (1,7 g/L) no meio de alimentação não contribuiu para o aumento na concentração celular, indicando que este aminoácido não limitou o processo de crescimento celular. Uma observação similar ocorreu quando o meio SF 900 II foi suplementado com asparagina, prolina, serina e cisteína. Porém, a adição de cisteína (0,3 g/L) isoladamente no meio de alimentação resultou em um aumento de 12% na concentração celular quando comparada ao meio SF 900 II puro. Assim, pode-se concluir que a cisteína limitava o crescimento celular. Verificou-se ainda que a célula não apresentou grande variabilidade nos diferentes ensaios, sob mesma vazão específica de alimentação. Isso indica que processo contínuo constituiria um método viável para a compreensão do metabolismo desta célula. / Drosophila melanogasters cells (S2) have been used as expression systems for recombinant proteins. This study uses a genetically modified S2 line with expression vectors for production of rabies virus glycoprotein (RVPG). The main objective was to evaluate the growth trend of S2 cells in a continuous process, aiming to maintain high cell concentrations. In order to set the continuous culture, the experiments used serum-free medium SF 900 II in a Biostat B reactor, with working volume of 500 mL and temperature controlled at 28 º C, dissolved oxygen at 30% air saturation, agitation speed at 90 rpm, and pH monitoring. Cellular metabolism behavior was observed under different dilution rates (0.8 day-1, 0.5 day-1, and 0.2 day-1) through parameters such as yield factors, in addition to variables such as maximum cell concentration, residual concentration of glucose and glutamine, among others. Yet, this work evaluates the influence of amino acids such as glutamine, asparagine, proline, serine and cysteine supplemented in the feed, over cellular concentration value reached in the steady state. Different dilution rates decreasing (under steady state) resulted in cell concentrations quite simillar. The addition of glutamine (1.7 g/L) in the feed did not contribute to the increase of cell concentration, which indicates that this amino acid did not limit cell growth process. A similar observation occurred when SF 900 II medium was supplemented with asparagine, proline, serine and cysteine. However, the cysteine addition (0.3 g/L) alone in the feed resulted in a 12% increase in cell concentration, compared to pure SF 900 II. Thus, it is possible to conclude that cysteine limited cell growth. It was also found that the cell did not show great variability in the various tests under the same dilution rate. This indicates that chemostat culture would be a viable method for understanding the metabolism of this cell.

Objetivo: Realizou-se um estudo, no período de 2002 a 2009, com a finalidade de verificar se as mudanças nas classes de cobertura da terra e no uso do solo podem exercer influência na ocorrência da raiva, nos municípios de Jacareí e de Santa Branca, situados na Região do Vale do Paraíba, no Estado de São Paulo, Sudeste do Brasil. Métodos: A ferramenta utilizada para avaliar estas alterações foi o sensoriamento remoto, através de imagens de satélite Land-sat. Para pesquisar a presença do vírus da raiva (RABV) foram coletados animais silvestres atropelados nas rodovias, morcegos encontrados na área urbana em atitude suspeita, morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus e animais de interesse econômico (ADIE) que vieram a óbito por enfermidade com sintomatologia nervosa. O material coletado, sistema nervoso central (SNC), desses animais foi encaminhado para o laboratório de referência nacional, o Instituto Pasteur de São Paulo (IP-SP) e para o Laboratório de Sanidade Animal da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA)- Pólo Regional do Vale Paraíba (PRDTA/VP) - Pindamonhangaba-SP. A determinação da presença do antígeno viral foi feita através da prova de imunofluorescência direta (IFD) e o isolamento do vírus através da inoculação intracerebral em camundongos (IC). Os inóculos das amostras foram submetidos à prova de reação em cadeia pela polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) para verificar a presença do vírus da raiva. Resultados: No período de estudo tivemos a ocorrência de dez casos da doença, sendo três em morcegos insetívoros na zona urbana de Jacareí, e sete em ADIE, sendo dois, em Jacareí e cinco, em Santa Branca. Todos os animais silvestres terrestres examinados foram negativos para a presença do vírus da raiva em todas as provas realizadas (IFD, IC, RT-PCR). O material proveniente dos morcegos foi negativo para as provas de IFD e IC, porém três amostras, oriundas de morcegos insetívoros, resultaram positivas para a prova de RTPCR. As amostras de ADIE examinadas resultaram positivas para todas as provas realizadas. O sequenciamento genético utilizou amplificações referentes à glicoproteína viral das 8 amostras positivas para rt-pcr, obtendo para os cinco isolados de ADIE linhagem de desmodus rotundus e para os três isolados de morcegos linhagens de nyctinomops laticaudatus e tadarida brasiliensis. Quando foi estudada a cobertura do solo e seu uso, considerando os municípios, constatou-se que não haviam ocorrido mudanças significativas entre 2002 e 2009. Optou-se por fazer buffers de raio de 3 km tendo como centro de cada buffer as coordenadas geográficas de casos positivos para raiva. Como em duas situações houve sobreposição entre áreas de buffers, resolveu-se considerar a área da união dos mesmos. Foi interessante que, mesmo nestes buffers não houve mudanças significativas, apesar da ocorrência da doença. Conclusão: Na escala utilizada, considerada micro, a enfermidade aconteceu, mesmo sem mudanças aparentes na região. Provavelmente, em uma escala macro outros resultados poderiam ser obtidos / Objective: This study was carried out during the period of 2002-2009, with the purpose to verify whether the changes in types of land cover and in land use can influence the occurrence of rabies in Jacareí and Santa Branca, situated in the Vale do Paraíba, State of São Paulo, southeastern brazil. Methods: The tool used to evaluate these alterations was the remote sensing through images of satellite land-sat. In order to search for the presence of rabies virus, brain materials were collected from wild animals roadkilled in highways, bats found in the urban area in suspicious attitude, desmodus rotundus hematophagous bats captured in rural areas and farm animals of economic importance (aei) dead with suspect of rabies. For rabies diagnosis, specimens of central nervous system (cns) of these animals were sent to the Pasteur Institute of São Paulo (IP-SP) - national reference laboratory and to the laboratory of animal Paulista Agency for Agribusiness Technology (APTA) - Polo Valley Regional of Paraíba (PRDTA / VP), in Pindamonhangaba, state of SP. The presence of viral antigen was determined by the direct fluorescent antibody technique (D-FAT) and the isolation of the virus by means of intracerebal mouse inoculation test (MIT). The brain suspensions were submitted to reverse transcriptase. Polymerase chain reaction to check the presence of rabies virus. Results: In the period of study, 10 positive cases were detected, being 3 in insectivorous bats in the urbane zone of jacareí, and 7 in aei, being 2 in jacareí and 5 in santa branca. All the terrestrial wild animals examined were negative for the presence of rabies virus in all tests performed (d-fat, mit, and rt-pcr). The materials from bats were found negative for the d-fat and mit, however, three samples originating from insectivorous bats turned out to be positive for rt-pcr. The positive samples from aei were positive for all tests carried out. The genetic sequencing of the g gene of eight rt-pcr positive rabies virus isolates derived from aie, five corresponded to the desmodus rotundus lineage and the three bat isolates were related to lineages of nyctinomops laticaudatus and tadarida brasiliensis. When land coverage and its use were analyzed, considering the municipalities, it was found that no significant changes occurred between 2002 and 2009. Then buffers of 3 km in radius were chosen taking as the center of each buffer the geographical coordinates of positive rabies cases. Since in two situations there was superposition between areas of buffers, it was resolved to consider the junction area of the buffers. Even in these buffers there was no significant change, despite the occurrence of the disease. Conclusion: it was concluded that the disease has occurred even without any apparent changes in the region, due to the (micro) scale used in this study. Probably, in a macro scale, other results might be obtained

O desenvolvimento de vacinas contra a raiva tão eficientes quanto as atuais ainda é considerado importante para a profilaxia dessa doença devido ao alto número de mortes por ano no mundo. Este trabalho mostra dois sistemas para a expressão recombinante do principal antígeno da raiva, a glicoproteína viral (RVGP): células Schneider 2 de Drosophila melanogaster estavelmente transfectadas (S2 rRVGP) e vírus Semliki Forest (SFV) carregando o RNA da RVGP (SFVRVGP). Ensaios de purificação por cromatografia de afinidade, da rRVGP de S2 rRVGP produzida em biorreator, demonstraram resultados promissores para o isolamento de monômeros da rRVGP. Para os estudos de imunogenicidade, camundongos foram vacinados com rRVGP de S2 rRVGP e SFV-RVGP. Dosagem de anticorpos anti-glicoproteína do vírus da raiva, neutralizantes, IgG1 e IgG2a, e citocinas demonstraram que o SFV-RVGP induziu predominantemente uma resposta imune do tipo celular e que os dois vetores foram capazes de expressar uma rRVGP imunogênica, apresentando um potencial uso clínico (veterinário e humano). / The development of new and equally efficient rabies vaccines is still considered important to the prophylaxis of the disease, which is responsible for many deaths per year worldwide. This work used two systems for recombinant expression of the major rabies antigen, the viral glycoprotein (RVGP): stably transfected Drosophila melanogaster Schneider 2 cells (S2 rRVGP) and Semliki Forest Virus (SFV) carrying the RNA of RVGP (SFV-RVGP). Purification assays of the rRVGP by metal ion affinity chromatography, from S2 rRVGP cells produced in bioreactor, showed promising results for rRVGP monomers isolation. Analysis of antibodies anti-rabies virus glycoprotein, neutralizing, IgG1 and IgG2a, and citokines showed that the SFV-RVGP induced predominantly a cellular immune response, and both vectors were capable of expressing an immunogenic rRVGP, what reinforces potential clinical applications (veterinary or human).

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/μL, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/μL, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.

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