With the great promise that metagenomics holds in exploring virome composition and discovering novel virus species, there is a pressing demand for comprehensive and up-to-date reference databases to enhance the downstream bioinformatics analysis. In this study, a RNA virus reference database (RVRD) was developed by manual and computational curation of RNA virus genomes downloaded from the three major virus sequence databases including NCBI, ViralZone, and ViPR. To reduce viral sequence redundancy caused by multiple identical or nearly identical sequences, sequences were first clustered and all sequences except one in a cluster that have more than 98% identity to one another were removed. Other identity cutoffs were also examined, and Hepatitis C virus genomes were studied in detail as an example. Using the 98% identity cutoff, sequences obtained from ViPR were combined with the unique RNA virus references from NCBI and ViralZone to generate the final RVRD. The resulting RVRD contained 23,085 sequences, nearly 5 times the size of NCBI RNA virus reference, and had a broad coverage of RNA virus families, with significant expansion on circular ssRNA virus and pathogenic virus families. Compared to NCBI RNA virus reference in performance evaluation, using RVRD as reference database identified more RNA virus species in RNAseq data derived from wastewater samples. Moreover, using RVRD as reference database also led to the discovery of porcine rotavirus as the etiology of unexplained diarrhea observed in pigs. RVRD is publicly available for enhancing RNA virus metagenomics. / Master of Science / Next-generation sequencing technology has demonstrated capability for the detection of viruses in various samples, but one challenge in bioinformatics analysis is the lack of well-curated reference databases, especially for RNA viruses. In this study, a RNA virus reference database (RVRD) was developed by manual and computational curation from the three commonly used resources: NCBI, ViralZone, and ViPR. While RVRD was managed to be comprehensive with broad coverage of RNA virus families, clustering was performed to reduce redundant sequences. The performance of RVRD was compared with NCBI RNA virus reference database using the pipeline FastViromeExplorer developed by our lab recently, the results showed that more RNA viruses were identified in several metagenomic datasets using RVRD, indicating improved performance in practice.

On sait maintenant depuis quelques décennies que seule une petite fraction du génome est constituée de séquences codantes pour des protéines et que la majorité de l'ADN non codant, jadis considéré comme « poubelle », assure d'importantes fonctions biologiques. Avec ce nouveau paradigme, notre perception de l'expression et la régulation génique est passée d'une vision axée sur les protéines à une vision plus centrée sur les ARN, tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. L'avènement des techniques de séquençage à haut débit comme le RNA-Seq (séquençage ARN) a fortement contribué à la démystification de cette partie « non codante » de l'ARN. Outre le triumvirat de gènes d'ARNt, d'ARNr et d'ARNm, les génomes abritent de nombreux loci qui codent pour de petits ARN régulateurs non canoniques repartis dans de nombreuses classes. Les microARN (miARN) et les fragments dérivés des ARNt (tRFs) sont les deux classes de petits ARN non codants (ARNnc) les plus abondants et partageant des similarités dans leurs mécanismes. Bien que souvent éclipsés par les protéines, ils sont au cœur de la régulation post-transcriptionnelle et sont des acteurs émergents de la relation hôte-pathogène. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans ce thème et traitent des relations hôtes-pathogènes sous l'angle des petits ARNnc à travers deux projets (#1 et #2) complémentaires qui ambitionnent d'apporter une lecture et des perspectives nouvelles. Dans le projet #1, nous avons travaillé avec le virus à ARN Ebola (EBOV), un agent pathogène connu pour provoquer une fièvre hémorragique mortelle, qui a été responsable de plusieurs épidémies en Afrique et demeure encore aujourd'hui une menace pour la santé publique mondiale. En combinant RNA-Seq, PCR quantitative et analyses computationnelles, nous avons obtenu le premier transcriptome détaillé des miRNA (miRNome) d'une lignée de cellules hépatiques humaines infectées par l'une des trois souches variantes de EBOV dont Mayinga, Makona et Reston. Lors de l'infection par EBOV, il y'a une expression différentielle de seulement 1/5 du miRNome de l'hôte au cours du temps avec une modulation spécifique des miR-122-5p, miR-148a-3p et miR-21-5p. Les données obtenues mettent en relief, au-delà des manifestations cliniques jusque-là connues, de nouvelles différences substantielles entre les souches vis-à-vis de leur effet sur le miRNome. Dans une seconde phase, avec la même approche, nous avons découvert, caractérisé et validé deux miARN viraux codés par les génomes EBOV (Mayinga et Makona). Ces deux miARN viraux peuvent potentiellement cibler des gènes impliqués dans le phénotype hémorragique, la régulation de la réplication virale et la modulation de la défense immunitaire de l'hôte. Le projet #2 s'inscrit dans un contexte où nous avions découvert fortuitement l'existence d'espèces d'ARN inférieures à 16 nt (appelés ici vsRNA pour very small RNA) qui s'avèrent fonctionnels chez les eucaryotes alors qu'ils étaient souvent retirés des jeux de données de séquençage, car considérés comme étant des « produits de dégradation ». Nous avons étendu notre analyse RNA-Seq aux bactéries pour caractériser les vsRNAs de Escherichia coli K-12 MG1655 et cinq autres souches bactériennes. L'étude est complétée par l'analyse des vésicules dérivées de la membrane externe (Outer Membrane Vesicles ; OMVs) produites par E. coli K-12 MG1655 en raison de leurs rôles déterminants pour améliorer des chances de survie, la régulation des interactions microbiennes et la promotion de la pathogenèse. Les résultats montrent l'existence de vsRNAs variés et très abondants avec les tRFs comme un biotype majeur, notamment ceux dérivés de l'ARNt isoleucine (Ile-tRF). En guise de preuve de concept de la fonctionnalité de ces vsRNAs de type tRFs, nous avons étudié en détail le très abondant et thermodynamiquement stable Ile-tRF. Nos analyses montrent qu'il est modulé sélectivement par le stress environnemental et peut être transféré via les OMVs (où il est particulièrement enrichi) aux cellules humaines HCT116 où il favorise l'expression des ARNm codant pour des membres de la famille des MAP-kinase. Notre étude est la toute première chez E. coli à rapporter l'existence de tRF abondants, trouvés dans des vésicules (OMVs) et assumant des fonctions potentielles chez l'hôte. L'Ile-tRF est également le premier tRF fonctionnel de 13 nt rapporté chez les bactéries. / For several decades now, it has been known that only a small fraction of the genome is made up of protein-coding sequences and that the majority of non-coding DNA, historically considered as "junk", carries out important biological functions. With this new paradigm, our perception of gene expression and regulation has shifted from a protein-centered view to a more RNA-centered view in both prokaryotes and eukaryotes. The advent of high-throughput sequencing techniques such as RNA sequencing (RNA-Seq), has strongly contributed to the demystification of this "non-coding" part of RNA. Besides the triumvirate of tRNA, rRNA, and mRNA genes, genomes harbor numerous loci that encode small non-canonical regulatory RNAs distributed in many classes. MicroRNAs (miRNAs) and tRNA-derived fragments (tRFs) are the two most abundant classes of small non-coding RNAs (ncRNAs) and share similarities in their mechanisms. Although often overshadowed by proteins, they are at the heart of post-transcriptional regulation and are emerging players in the host-pathogen relationship. This thesis addresses the host-pathogen relationship from the perspective of small ncRNAs through two complementary projects (#1 and #2) that aim to provide new insights and perspectives. In project #1, we worked with the Ebola RNA virus (EBOV), a pathogen known to cause a deadly hemorrhagic fever, which has been responsible for several epidemics in Africa and remains a global public health concern to this day. By combining RNA-Seq, quantitative PCR and computational analyses, we obtained the first detailed miRNA transcriptome (miRNome) of a human liver cell line infected with one of the three variant strains of EBOV including Mayinga, Makona and Reston. During EBOV infection, there is a differential expression of only 1/5 of the host miRNome over time with specific modulation of miR-122-5p, miR-148a-3p and miR-21-5p. The data obtained highlight, beyond the previously known clinical manifestations, substantial new differences between the strains with respect to their effect on the miRNome. In a second phase, using the same approach, we discovered, characterized and validated two viral miRNAs encoded by the EBOV genomes (Mayinga and Makona). These two viral miRNAs can potentially target genes involved in the hemorrhagic phenotype, the regulation of viral replication and the modulation of host immune defense. Project #2 was developed in a context where we had fortuitously discovered the existence of RNA species smaller than 16 nt (called here vsRNA for very small RNA) that were functional in eukaryotes but were often removed from sequencing datasets because they were considered as "degradation products". We have extended our RNA-Seq analysis to bacteria in order to characterize vsRNAs from Escherichia coli K-12 MG1655 and five other bacterial strains. The study is completed by the analysis of Outer Membrane Vesicles (OMVs) produced by E. coli K-12 MG1655 because of their critical roles in enhancing survival, regulating microbial interactions and promoting pathogenesis. The results show the existence of diverse and highly abundant vsRNAs with tRFs as a major biotype, especially those derived from isoleucine tRNA (Ile-tRF). As a proof of concept of the functionality of these tRF-like vsRNAs, we have studied in detail the highly abundant and thermodynamically stable Ile-tRF. Our analyses show that it is selectively modulated by environmental stress and can be transferred via OMVs (where it is particularly enriched) to human HCT116 cells where it promotes the expression of mRNAs encoding members of the MAP-kinase family. Our study is the first ever in E. coli to report the existence of abundant tRFs found in vesicles (OMVs) with potential functions in the host. Ile-tRF is also the first functional 13 nt tRF reported in bacteria.

Les Virus herpès simplex sont connus pour infecter les gens partout dans le monde et possèdent l'habileté d'établir un état de latence. Les manifestations cliniques les plus sévères d'une infection avec les virus herpès simplex sont observées chez les patients imInunosupprimés qui peuvent être infectés avec des souches virales résistantes aux antiviraux. Les mutations causant la résistance à l'antiviral acyclovir peuvent se retrouver soit au niveau de l'ADN polymérase ou de la thymidine kinase virale, tandis que les mutations entraînant une résistance au foscamet se retrouvent seulement au niveau de l'ADN polymérase. Lors de ce projet, nous avons testé les capacités réplicatives, la neurovirulence, ainsi que l'habileté à établir un état de latence pour quatres souches virales mutantes isolées de patients atteints du VIH ne répondant pas aux traitements antiviraux avec l'acyclovir et/ou le foscamet. Nous avons observé que le mutant au niveau de l'ADN polymérase S724N résistant à l'acyclovir et au foscamet possède des caractéristiques similaires au virus de type sauvage, tandis qu'un autre Inutant au niveau de l'ADN polymérase, L850I, démontrait une capacité replicative et une neurovirulence diminuées. Le virus mutant au niveau de la thymidine kinase, G439.5, ainsi que le virus double mutant au niveau des deux gènes C467del/A912V avaient des capacités réplicatives réduites ainsi qu'une neurovirulence atténuée, mais possédaient la capacité d'établir une latence. Ce projet nous a donc permis de démontrer que des études in vitro de réplication virale de différents virus herpès simplex résistants aux antiviraux peuvent aider à prédire le niveau de virulence de ces virus dans des modèles animaux.

Thèse ou mémoire avec insertion d’articles. / Pour les transformateurs de l'industrie agroalimentaire, garantir la salubrité de leurs produits est une priorité absolue. Chaque étape de la production, de la manipulation des ingrédients aux différents procédés, peut potentiellement engendrer des maladies d'origine alimentaire. Les virus entériques, tels que le norovirus humain et le virus de l'hépatite A, sont des pathogènes pouvant mettre en danger le consommateur. Afin de minimiser ces risques, diverses méthodes de désinfection, tant physiques que chimiques, sont employées. Cependant, les propriétés structurales des différents genres viraux rendent difficile l'obtention d'un traitement virucide à large spectre. Pour cette raison, ce projet porte sur l'utilisation de composés chimiques novateurs à base de peracides pour l'inactivation virale. Pour atteindre cet objectif, quatre désinfectants ont été testés à différentes concentration (50, 80, 250, 500 et 1000 ppm) et temps de contact (0,5 1, 5, et 10 min) en solution liquide, sur de l'acier inoxydable et sur des petits fruits (fraise et bleuet). En solution liquide, l'acide perlevulinique avec du dodécyle sulfate de sodium (SDS) a permis une réduction du norovirus murin (MNV-1) de 3 logs, tandis que l'acide peracétique a provoqué une réduction de 2,24 logs en 0,5 minute. Seul l'acide peracétique a permis une réduction de 3 log en 0,5 minute sur l'acier inoxydable à 80 ppm. L'acide peracétique a d'ailleurs été l'unique désinfectant testé capable d'inactiver 3 logs de MNV-1 à la surface des bleuets à une concentration de 80 ppm pendant 30 secondes. Malheureusement, aucun des désinfectants n'a été en mesure d'inactiver au moins 2 logs de VHA et de VHE, peu importe la concentration et temps de contact. Éventuellement, les résultats de ce projet de maîtrise permettront le développement de nouvelles alternatives efficaces pour permettre l'inactivation de virus entériques dans l'industrie alimentaire par la création de nouveaux composés chimiques efficaces. / For processors in the food industry, ensuring the safety of their products is a top priority. Every step of production, from handling ingredients to different methods, has the potential to cause foodborne illness. Enteric viruses, such as human norovirus and hepatitis A virus, are pathogens that can endanger the consumer. In order to minimize these risks, various methods of prescription, both physical and chemical, are employed. However, the structural properties of the different viral speces make it difficult to achieve broad-spectrum virucidal therapy. For this reason, this project focuses on the use of new chemical compounds based on peracids for viral inactivation. To achieve this objective, four disinfectants were tested at different concentrations (50, 80, 250, 500 and 1000 ppm) and contact time (0.5 1, 5, and 10 min) in liquid solution, on stainless steel and on berries (strawberries and blueberries). In liquid solution, perlevulinic acid with sodium dodecyl sulfate (SDS) provided a 3-log reduction of murine nororivus (MNV-1), while perlevulinic acid caused a 2.24-log reduction in 0.5 min. Only peracetic acid provided a 3 log reduction in 0.5 minutes on stainless steel at 80 ppm. Peracetic acid was the only disinfectant tested to inactivate 3 logs of MNV-1 on the surface of blueberries at a concentration of 80 ppm for 30 seconds. Unfortunately, none of the disinfectants were able to inactivate at least 2 logs of HAV and HEV, regardless of concentration and contact time. Eventually, the results of this master's project will allow the development of new effective alternatives to enable the inactivation of enteric viruses in the food industry through the creation of new effective chemical compounds.

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