Sphingolipide sind eine wichtige Klasse von Lipiden, die nicht nur als Strukturmoleküle von Bedeutung sind sondern auch in Signaltransduktionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Insbesondere die Sphingolipidmetaboliten Ceramid, Sphingosin und Sphingosin-1-phosphat sind an zellulären Prozessen wie Differenzierung, Apoptose, Proliferation und Inflammation beteiligt. Sphingomyelinasen üben daher als katabole Enzyme des Sphingolipidstoffwechsels eine wichtige Funktion aus. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Expression und Reinigung der rekombinanten humanen sauren Sphingomyelinase sowie ausgewählter varianter Formen des Enzyms, die verschiedene Subtypen der Niemann-Pick-Erkrankung widerspiegeln. Die Kinetiken und weitere Parameter der erhaltenen Enzyme wurden nach Michaelis-Menten bestimmt. Durch Gabe der rekombinanten Enzyme zu metabolisch radiomarkierten (NPA -/-) Fibroblasten wurde die Stimulation des Sphingolipidmetabolismus nachverfolgt. Mittels FT-IR Spektroskopie gelang die Bestimmung und Quantifizierung von Sekundärstrukturelementen im Wildtypenzym und den varianten Formen. Darüber hinaus wurde in SPR-Messungen die biomolekulare Interaktion der sauren Sphingomyelinase mit dem Krebstherapeutikum Siramesin untersucht. Siramesin, welches als Inhibitor der sauren Sphingomyelinase wirkt, induziert selektiv in Krebszellen den lysosmalen Zelltod. In diesem Zusammenhang wurde die saure Sphingomyelinase als potentielles Zielmolekül für Krebstherapien identifiziert. / Sphingolipids are an important class of lipid molecules. Beyond their structural role, they also serve as bioactive signalling entities. Sphingolipid metabolites like ceramide, sphingosine and sphingosine-1-phosphate are involved in many cellular processes including differentiation, apoptosis, proliferation, inflammation and intracellular trafficking. In this context, sphingomyelinases are of special interest. The present work focuses on the expression and purification of recombinant human acid sphingomyelinase and selectively chosen variant forms of the enzyme, representing prominent Niemann-Pick disease types. Subsequently the biochemical parameters of all obtained enzymes were determined by Michaelis-Menten kinetics. In order to asses the stimulation of sphingolipid metabolism metabolically radiolabeled (NPA -/-) cells were treated with the recombinant enzymes. Based on FT-IR spectroscopy, structural components of the acid sphingomyelinase and its variants, were determined and quantified. Furthermore SPR-experiments were performed to analyse the biomolecular interaction of immobilized acid sphingomyelinase and the anticancer agent siramesine. Siramesine acts as an inhibitor on acid sphingomyelinase, thereby triggering cancer-specific lysosomal cell death. In this context the human acid sphingomyelinase was identfied as a target for cancer therapy.

Lysosomen spielen entscheidende Rolle bei der zellulären Homöostase. Die Überwachung von Lysosomen, die Lipide ansammeln, ist eine erhebliche Herausforderung. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS) als Methode zur Überwachung intakter Lysosomen, insbesondere hinsichtlich des Einflusses von Arzneimitteln, die den Lipidstoffwechsel stören. Um das Potenzial von SERS zur Untersuchung von Lysosomen in lebenden Zellen zu bewerten, wurden die Wechselwirkungen zwischen trizyklischen Antidepressiva und saurer Sphingomyelinase untersucht. Zunächst wurden Modellsysteme untersucht. Die Wechselwirkungen zwischen den Antidepressiva und Goldnanopartikeln wurden durch SERS charakterisiert. Die Daten zeigten, dass Moleküle mit den Nanopartikeln interagieren. Als Modellsystem der lipidreichen Umgebung wurden Komposite aus Liposomen und Goldnanopartikeln von SERS und Cryo-EM untersucht. Die SERS-Spektren sind charakteristisch für die Lipidzusammensetzung der Vesikel. Die Wechselwirkungen zwischen den Antidepressiva und den Lysosomen wurden in der Fibroblastenzelllinie 3T3 durch SERS und komplementäre Methoden untersucht. In Übereinstimmung mit den SERS-Spektren von Modellsystemen zeigen die SERS-Spektren lebender Zellen Signaturen sowohl der Antidepressiva als auch der Lipide. Um die Unterschiede in den Lysosomen zwischen behandelten und nicht behandelten Zellen aufzudecken, wurde ein zufälliger Waldansatz verwendet. Darüber hinaus wurde SERS verwendet, um die Lipidverteilung in Leishmania-infizierten Makrophagen zu untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie Lipide akkumulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass SERS verwendet werden kann, um die Lipidzusammensetzung in lebenden Zellen verschiedener Zelltypen zu untersuchen. Als neue methodische Entwicklung zeigt die Random-Forest-Analyse von SERS-Daten, dass Ansätze des maschinellen Lernens für ein besseres Verständnis von Daten aus biologischen Systemen nützlich sein können. / Lysosomes play a crucial role in cellular homeostasis. Monitoring lysosomes that accumulate lipids represents a considerable challenge. This thesis focuses on the development of surface-enhanced Raman scattering (SERS) as a method to monitor intact lysosomes, in particular regarding the influence of drugs that interfere with lipid metabolism. To evaluate the potential of SERS for studying lysosomes in live cells, the interactions between tricyclic antidepressants and acid sphingomyelinase were studied. First, model systems were investigated. The interactions between the antidepressants and gold nanoparticles were characterized by SERS. The data showed that molecules interact with the nanoparticles. As a model system of the lipid-rich environment, composites of liposome and gold nanoparticles were studied by SERS and cryo-EM. The SERS spectra are characteristic of the vesicles’ lipid composition. The interactions between the antidepressants and the lysosomes were studied in the fibroblast cell line 3T3 by SERS and complementary methods. In agreement with the SERS spectra of model systems, the SERS spectra of live cells show signatures of both, the antidepressants and the lipids. To reveal the differences in the lysosomes between treated and non-treated cells, a random forest approach was used. Moreover, SERS was used to study the lipid distribution in Leishmania-infected macrophages known to accumulate lipids. The results show that SERS can be used to investigate lipid composition in live cells of different cell types. As a new methodological development, the random forest analysis of SERS data shows that machine learning approaches can be useful for a better understanding of data from biological systems.

Sphingolipide sind essentielle Bestandteile der Plasmamembranen aller eukaryotischen Organismen und besitzen als Signalmoleküle regulierende Eigenschaften auf diverse zelluläre Prozesse. Hierbei spielen die G-Protein-gekoppelten S1P-Rezeptoren eine wichtige Rolle. Diese werden durch das natürliche Sphingosin-1-phosphat sowie die Sphingosin-Derivate FTY720 und cis-4-Methylsphingosin selektiv adressiert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von fünfzehn neuartigen Sphingosin-Derivaten mit potenziell neuen biologischen Eigenschaften. Hierfür wurde die Leitstruktur des natürlichen D-erythro-Sphingosins an den Positionen 1, 3 und/oder 4 modifiziert. Die biologischen Studien mit diesen Verbindungen lieferten erste Erkenntnisse zur Inhibition des S1P-induzierten Calcium-Anstiegs, der Wechselwirkung mit den S1P-Rezeptoren und der zellulären Lokalisation in Chlamydia trachomatis infizierten Zellen. Darüber hinaus wurde eine Methode, die einen schnelleren und variablen Zugang zu den 4-verzweigten Sphingosin-Derivaten erlaubt, etabliert. / Sphingolipids are essential constituents of plasma membranes in all eukaryotic organisms. They also participate as signalling molecules in almost all physiological processes. Here G-protein coupled S1P receptors play an important role. These receptors are selectively addressed by natural ligand sphingosine-1-phosphate as well as by sphingosine analogues FTY720 and cis-4-methylsphingosine. This work describes the synthesis of fifteen sphingosine analogues with potential biological activity. For this purpose, the natural lead structure of D-erythro-sphingosine was modified at positions 1, 3 and/or 4. The biological studies of these compounds provided the first insights to the inhibition of S1P-induced calcium increase, the interaction with S1P receptors and the cellular localization in Chlamydia trachomatis infected cells. Moreover, an adapted method that allowed faster and adaptable access to 4-branched sphingosines was established.