Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

Os alcaloides têm apresentado diversas atividades biológicas. Entre eles, a montanina vem demonstrando um bom desempenho nesse sentido, como, atividade antioxidante, ação inibitória do crescimento de culturas bacterianas e importante atividade de inibição do crescimento de linhagens tumorais. Atualmente, não existem muitos relatos da sua caracterização ou métodos analíticos quantitativos disponíveis na literatura para atribuir seu teor. Assim, após purificação, a caracterização da montanina foi realizada por calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectroscopia na região do ultravioleta (UV), infravermelho (IV), espectrometria de massas (CLAE-EM), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H), de carbono (RMN13C) e em 2D homo e heteronucleares tais como COSY (nJH-H, escalar), NOESY (nJH-H, dipolar), HSQC (1JH-C, escalar) e HMBC (nJH-C, escalar). Na sequência, foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada aos detectores ultravioleta e aerossol carregado (CLAE- UV/DAC) para a quantificação da montanina. Os mesmos foram validados, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, intervalo, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez. Os resultados obtidos foram avaliados por estatística descritiva e os métodos comparados pelo resultado da análise de variância (ANOVA). Desse modo, foram desenvolvidos procedimentos que podem ser aplicados para aprimorar o controle de qualidade, contribuindo para assegurar a eficácia terapêutica da montanina. / Alkaloids have several biological activities. Among them, montanine have shown antioxidant activity, inhibitory effect on bacterial growth and important activity inhibiting growth of some tumor cell lines. Currently, there are a few reports about its characterization as well as quantitative analytical methods to determine its purity. Thus, after a purification step, montanine will be characterized by its differential scanning calorimetry (DSC), ultraviolet spectroscopy (UV), infrared spectroscopy (IR), mass spectrometry (HPLC-MS), nuclear magnetic resonance of proton (NMR1H), carbon (NMR13C) and 2D homo and heteronuclear such as COSY (nJH-H, scalar), NOESY (nJH-H, dipolar), HSQC (1JH-C, scalar) and HMBC (nJH-C, scalar). Further, quantitation methods will be developed employing high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with ultraviolet and charged aerosol detectors (HPLC-UV/CAD). These methods will be validated regarding the parameters specificity, linearity, range, detection limit, quantitation limit, precision, accuracy and robustness. The results will then be evaluated by descriptive statistics and the developed methods will be compared using analysis of variance (ANOVA). Therefore, tests will be developed that can be used to improve quality control, helping to ensure the therapeutic efficacy of montanine.

O presente trabalho teve por objetivo a avaliação físico-química e biológica de uma fração de saponinas enriquecida, obtida a partir de frutos verdes de Ilex paraguariensis A. St. Hil (mate). A espécie apresenta grande importância econômica para vários países sul-americanos, dentre eles o Brasil. Os frutos verdes da espécie acumulam significativa quantidade de saponinas, entretanto, são considerados subproduto da indústria do beneficiamento das folhas de mate. O extrato liofilizado dos frutos (EX40) foi obtido por turboextração na proporção planta-solvente de 1:10 utilizando como solvente solução hidroalcoólica a 40%. Para análise do extrato bruto foi desenvolvido e validado um método analítico por CLAE-UV, que permitiu: 1) quantificar o marcador químico ilexosídeo II em EX40; 2) estimar o conteúdo em saponinas totais do extrato, tendo sido obtidos valores de 8,2 g% e 47,6 g% respectivamente. Uma fração enriquecida em saponinas, denominada MSF, foi obtida mediante fracionamento em fase sólida a partir de EX40, utilizando resina hidrofóbica poliaromática e gradiente metanol:água de polaridade decrescente. Os maiores teores de saponinas foram obtidos para as frações contendo 70 e 90 % de metanol. A reprodutibilidade do processo foi avaliada por CLAE-UV, considerando o desvio padrão relativo (DPR) entre a área dos dois picos majoritários de MSF produzidas em seis lotes distintos. Valores de DPR de 8,17% para o pico I (ilexosídeo II) e 5,96 % para o pico II (majoritário) foram obtidos. A toxicidade da fração foi avaliada pelo potencial hemolítico in vitro e citotoxicidade sobre cultura de células de mamífero (MDBK ATCC CCL-22). Para atividade hemolítica foi determinado um valor de IC50 de 0,2 g/L (0,22 mM, expresso em ilexosídeo II). O valor de IC50 para citotoxicidade foi 3,8 g/L (4,04 mM, expresso em ilexosídeo II), caracterizando um produto de baixa toxicidade. Dentre as várias atividades biológicas descritas para saponinas, selecionouse avaliar MSF quanto ao seu potencial como imunoadjuvante, assim como a atividade tricomonicida. Para o primeiro caso, MSF foi testada em uma vacina contendo herpesvírus bovino tipo 5 como antígeno viral, nas doses de 100 e 500 μg. Entretanto, o incremento no título de IgG totais, avaliado por ELISA, não foi significativo. A atividade tricomonicida foi comparada aos tensoativos polissorbato 80 e tiloxapol e a uma fração enriquecida em saponinas de Quillaja saponaria. Após 24 h de incubação foi observado para MSF um efeito dose-dependente, atingindo letalidade total dos trofozoítos na concentração de 0,6 g/L. Esse efeito foi superior ao observado para polissorbato 80 e tiloxapol e similar ao de quillaia. O tratamento com metronidazol, administrado tanto após tratamento prévio dos trofozoítos com MSF quanto em associação com essa fração, não revelou qualquer alteração significativa no efeito de ambos os produtos, o que sugere ausência de interação entre MSF e MTZ e a possível existência de mecanismos de ação distintos. A caracterização físico-química enfatizou o estudo do tamanho e forma das micelas, seu comportamento reológico e capacidade de solubilizar compostos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi determinada em 0,41 g/L utilizando um corante hidrofóbico como marcador. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e CRIO-MET revelou a presença simultânea de micelas alongadas, com tamanho superior a 500 nm, e micelas esféricas de tamanho menor. Para a fração de micelas esféricas, a análise por espalhamento de nêutrons a baixo ângulo permitiu estabelecer diâmetro de 17,9 Å, perfazendo 23,1 e 32,6 % das micelas observadas em soluções de MSF a 0,5 e 1,0 % m/v, respectivamente. O comportamento reológico de MSF nas concentrações de 0,25 a 4,0 %, determinado por reometria dinâmica com controle de deformação, foi do tipo viscoelástico para todas as concentrações. Esse fato corrobora a existência de agregados não-esféricos, filiformes, semelhantes a micelas tipo wormlike. A solubilização micelar de fármacos mediante MSF foi avaliada utilizando como substâncias-modelos os fármacos flurbiprofeno – FLB (ácido fraco) e carbamazepina - CBZ (base fraca), ambos pouco solúveis, e saponinas de quillaia como produto de comparação. Nas concentrações de 0,13 a 1,5 % as saponinas de quillaia foram mais eficientes frente ao flurbiprofeno, enquanto MSF foi capaz de aumentar significativamente a solubilidade da carbamazepina. O incremento na solubilização gerado por MSF foi de 0,0145 e 0,0129 g/L para CBZ e FLB, respectivamente. / The present work aimed the physicochemical and biological evaluation of a saponin enriched fraction from the green fruits of Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate), a species of great economical importance in several Southern American countries, including Brazil. Despite possessing high amounts of saponins, mate green fruits have no commercial use to date and are considered a waste product from the mate leaves processing companies. Mate fruits lyophilized extract (EX40) was produced using turbo-extraction having a 40:60 mixture of water and ethanol as solvent and a 1:10 drug/solvent proportion. An HPLC-UV method was developed and validated aiming at: I) Quantify the EX40 chemical marker, ilexoside II; II) Determine the EX40 total saponin content. The values obtained were of 8.20 wt% and 47.60 wt%, respectively. An enriched saponin fraction (MSF) was obtained from EX40 through a solid phase extraction process within a polyaromatic resin and a decreasing solvent polarity gradient of methanol and water. The higher recovery of mate saponins was achieved with the 70 and 90 % methanol-containing fractions. The process reproducibility was assessed by HPLC-UV through the analysis of the relative standard deviation (RSD) of the two major MSF saponins peak areas obtained in six different batches. RSD values of 8.17 % for peak I (ilexoside II) and 5.96 % for peak II (major peak) were obtained. The MSF toxicity was evaluated according to its haemolytical activity and in vitro cytotoxicity against a mammalian cell culture lineage (MDBK ATCC CCL-22). Values of IC50 of 0.2 g/L (0.22 mM expressed as ilexoside II) and 3.8 g/L (4.04 mM as Ilexoside II) were found for the haemolysis and cytotoxicity respectively. Therefore we could classify MSF as a low toxicity product. Among the several biological activities ascribed to saponins, this work focused on the investigation of MSF immune enhancer potential and its anti-trichomonads vaginalis activity. For the first evaluation, MSF wad added to a bovine herpesvirus 5 vaccine, at 100 and 500 μg doses. However total IGg titres determined by ELISA were not statistically significant. The antitrichomonads activity of MSF was compared a saponin enriched fraction from the species Quillaja saponaria (Quillaja) and to tyloxapol and polysorbate 80. After 24h of incubation MSF presented a dose-dependent activity with total trophozoites lethality at a concentration of 0.6 g/L. The activity was higher than the synthetic surfactants and similar to Quillaja. The treatment with metronidazole (MTZ), peformed in association and after exposing the trophozoites with MSF did not show any synergistic effect of MZT and MSF which suggest an absence of interaction between the compounds and also that they probably have distinct mechanisms of action. The physicochemical evaluation of MSF focused the determination of MSF micelles size and shape, their rheological behaviour and ability to increase the solubility of hydrophobic compounds. MSF critical micellar concentration was determined as 0.41 g/L using a hydrophobic dye as a probe. The transmission electron microscopy (TEM) and CRYO-TEM analysis revealed the occurrence of filiform micelles higher than 500 nm and smaller sizes spherical micelles simultaneously. The spherical micelles radius of 17.9 Å were determined using small angle neutron scattering.and they corresponded to 23.1 and 32.6 % of the total micelles in MSF solutions of 0.5 and 1.0 % w/v, respectively. The rheological behavior of MSF ranging in concentration from 0.25 to 4.0% was determined on a dynamic strain control rheometer and a viscoelastic behavior was observed for all concentrations. These findings corroborate the occurrence of nonspherical micelles very long in size (wormlike). MSF ability to improve the solubilisation of poor aqueous soluble drugs was assessed using carbamazepine (CBZ) and flurbiprofen (FLB) as a model of amphiphilic basic and acidic coumpounds. Saponin enriched fractions were evaluated in concentrations ranging from 0.13 to 1.5 %. Quillaja was more efficient toward the weak acid while MSF was able to increase significantly the CBZ solubility. The increase on CBZ and FLB solubility after MSF addition was of 0.0145 and 0.0129 g/L, respectively.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

Um método confiável e eficiente por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido para o controle de qualidade de extratos de P. incarnata. O método desenvolvido inclui uma estratégia original para identificação preliminar da espécie e operação simples baseada no modo de eluição isocrático. Este método foi validado para os flavonoides C-glicosilados vitexina e isovitexina, considerados marcadores da espécie e, aplicado na análise qualitativa e quantitativa de quatorze formulações comerciais com insumo vegetal composto exclusivamente de P. incarnata As análises foram realizadas com uma coluna C18 e à temperatura ambiente. Os comprimentos de onda de detecção foram 330 (vitexina e isovitexina) e 254 nm (rutina, marcador de contaminação). O método analítico foi linear para vitexina no intervalo de 5 - 40 ug/mL e para isovitexina no intervalo 5 - 60 ug/mL. Das quatorze amostras analisadas, oito eram em forma farmacêutica líquida (FFL) e seis em forma farmacêutica sólida (FFS). Seis amostras comerciais em FFL e seis amostras em FFS apresentaram perfil compatível com P. incarnata. As concentrações obtidas para as FFL foram vitexina 17,87 - 29,13 ug/mL e isovitexina 27,47 - 65,07 ug/mL, respectivamente. As FFS apresentaram concentração de vitexina entre 10,0 - 32,26 ug/mL e isovitexina 36,16 - 100,83 ug/mL. O método demonstrou ser confiável e eficiente para análise qualitativa e quantitativa de vitexina e isovitexina nos extratos; por esta razão foi considerado viável para a prática diária do controle de qualidade. A análise por cromatografia de líquida de alta eficiência acoplada com detector de espectroscopia de massas (CLAE-EM) foi realizada para investigar os principais fitoconstituintes, sete picos do extrato puderam ser resolvidos; e, forneceram fortes evidências sobre a composição química do extrato de P. incarnata. / A reliable and efficient method of high-performance liquid chromatography was developed for the quality control of Passiflora incarnata extracts. The quality control includes an original preliminary identification of this species and simple operation process based on isocratic elution. This method was validated for vitexin and isovitexin, C-glycoside flavonoids, considered markers of this species and applied to qualitative and quantitative analysis of fourteen commercial herbal medicines of P. incarnata extracts. Analysis was achieved on reversed-phase C18 column at ambient temperature. The wavelengths used for detection were 330 nm (vitexin and isovitexin) and 254 nm (rutin, a marker of contamination). Method was linear over vitexin concentration range of 540 g/mL and isovitexin 560 g/mL. Among of fourteen samples, eight were in liquid dosage form (LDF) and six in solid dosage form (SDF). Six commercial samples in LDF and six samples in SDF showed profile compatible with P. incarnata. Concentrations were determined for LDF vitexin 17.87  29.13 g/mL and isovitexin 27.47  65.07 g/mL. While SDF samples showed vitexin concentration range 10.00  32.26 g/mL and isovitexin 36.16  100.83 g/mL. The method demonstrated to be reliable and efficient for assay and qualitative analysis of vitexin and isovitexin in P. incarnata extracts; for that reason for practical application on quality control. Analysis were performed through high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometer detector (LC/MS) to investigate the main phytoconstituents, seven peaks from P. incarnata extract could be resolved; and provided strong evidences about the chemical composition of extracts.

O presente trabalho teve por objetivo a avaliação físico-química e biológica de uma fração de saponinas enriquecida, obtida a partir de frutos verdes de Ilex paraguariensis A. St. Hil (mate). A espécie apresenta grande importância econômica para vários países sul-americanos, dentre eles o Brasil. Os frutos verdes da espécie acumulam significativa quantidade de saponinas, entretanto, são considerados subproduto da indústria do beneficiamento das folhas de mate. O extrato liofilizado dos frutos (EX40) foi obtido por turboextração na proporção planta-solvente de 1:10 utilizando como solvente solução hidroalcoólica a 40%. Para análise do extrato bruto foi desenvolvido e validado um método analítico por CLAE-UV, que permitiu: 1) quantificar o marcador químico ilexosídeo II em EX40; 2) estimar o conteúdo em saponinas totais do extrato, tendo sido obtidos valores de 8,2 g% e 47,6 g% respectivamente. Uma fração enriquecida em saponinas, denominada MSF, foi obtida mediante fracionamento em fase sólida a partir de EX40, utilizando resina hidrofóbica poliaromática e gradiente metanol:água de polaridade decrescente. Os maiores teores de saponinas foram obtidos para as frações contendo 70 e 90 % de metanol. A reprodutibilidade do processo foi avaliada por CLAE-UV, considerando o desvio padrão relativo (DPR) entre a área dos dois picos majoritários de MSF produzidas em seis lotes distintos. Valores de DPR de 8,17% para o pico I (ilexosídeo II) e 5,96 % para o pico II (majoritário) foram obtidos. A toxicidade da fração foi avaliada pelo potencial hemolítico in vitro e citotoxicidade sobre cultura de células de mamífero (MDBK ATCC CCL-22). Para atividade hemolítica foi determinado um valor de IC50 de 0,2 g/L (0,22 mM, expresso em ilexosídeo II). O valor de IC50 para citotoxicidade foi 3,8 g/L (4,04 mM, expresso em ilexosídeo II), caracterizando um produto de baixa toxicidade. Dentre as várias atividades biológicas descritas para saponinas, selecionouse avaliar MSF quanto ao seu potencial como imunoadjuvante, assim como a atividade tricomonicida. Para o primeiro caso, MSF foi testada em uma vacina contendo herpesvírus bovino tipo 5 como antígeno viral, nas doses de 100 e 500 μg. Entretanto, o incremento no título de IgG totais, avaliado por ELISA, não foi significativo. A atividade tricomonicida foi comparada aos tensoativos polissorbato 80 e tiloxapol e a uma fração enriquecida em saponinas de Quillaja saponaria. Após 24 h de incubação foi observado para MSF um efeito dose-dependente, atingindo letalidade total dos trofozoítos na concentração de 0,6 g/L. Esse efeito foi superior ao observado para polissorbato 80 e tiloxapol e similar ao de quillaia. O tratamento com metronidazol, administrado tanto após tratamento prévio dos trofozoítos com MSF quanto em associação com essa fração, não revelou qualquer alteração significativa no efeito de ambos os produtos, o que sugere ausência de interação entre MSF e MTZ e a possível existência de mecanismos de ação distintos. A caracterização físico-química enfatizou o estudo do tamanho e forma das micelas, seu comportamento reológico e capacidade de solubilizar compostos hidrofóbicos. A concentração micelar crítica foi determinada em 0,41 g/L utilizando um corante hidrofóbico como marcador. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e CRIO-MET revelou a presença simultânea de micelas alongadas, com tamanho superior a 500 nm, e micelas esféricas de tamanho menor. Para a fração de micelas esféricas, a análise por espalhamento de nêutrons a baixo ângulo permitiu estabelecer diâmetro de 17,9 Å, perfazendo 23,1 e 32,6 % das micelas observadas em soluções de MSF a 0,5 e 1,0 % m/v, respectivamente. O comportamento reológico de MSF nas concentrações de 0,25 a 4,0 %, determinado por reometria dinâmica com controle de deformação, foi do tipo viscoelástico para todas as concentrações. Esse fato corrobora a existência de agregados não-esféricos, filiformes, semelhantes a micelas tipo wormlike. A solubilização micelar de fármacos mediante MSF foi avaliada utilizando como substâncias-modelos os fármacos flurbiprofeno – FLB (ácido fraco) e carbamazepina - CBZ (base fraca), ambos pouco solúveis, e saponinas de quillaia como produto de comparação. Nas concentrações de 0,13 a 1,5 % as saponinas de quillaia foram mais eficientes frente ao flurbiprofeno, enquanto MSF foi capaz de aumentar significativamente a solubilidade da carbamazepina. O incremento na solubilização gerado por MSF foi de 0,0145 e 0,0129 g/L para CBZ e FLB, respectivamente. / The present work aimed the physicochemical and biological evaluation of a saponin enriched fraction from the green fruits of Ilex paraguariensis A. St. Hil. (mate), a species of great economical importance in several Southern American countries, including Brazil. Despite possessing high amounts of saponins, mate green fruits have no commercial use to date and are considered a waste product from the mate leaves processing companies. Mate fruits lyophilized extract (EX40) was produced using turbo-extraction having a 40:60 mixture of water and ethanol as solvent and a 1:10 drug/solvent proportion. An HPLC-UV method was developed and validated aiming at: I) Quantify the EX40 chemical marker, ilexoside II; II) Determine the EX40 total saponin content. The values obtained were of 8.20 wt% and 47.60 wt%, respectively. An enriched saponin fraction (MSF) was obtained from EX40 through a solid phase extraction process within a polyaromatic resin and a decreasing solvent polarity gradient of methanol and water. The higher recovery of mate saponins was achieved with the 70 and 90 % methanol-containing fractions. The process reproducibility was assessed by HPLC-UV through the analysis of the relative standard deviation (RSD) of the two major MSF saponins peak areas obtained in six different batches. RSD values of 8.17 % for peak I (ilexoside II) and 5.96 % for peak II (major peak) were obtained. The MSF toxicity was evaluated according to its haemolytical activity and in vitro cytotoxicity against a mammalian cell culture lineage (MDBK ATCC CCL-22). Values of IC50 of 0.2 g/L (0.22 mM expressed as ilexoside II) and 3.8 g/L (4.04 mM as Ilexoside II) were found for the haemolysis and cytotoxicity respectively. Therefore we could classify MSF as a low toxicity product. Among the several biological activities ascribed to saponins, this work focused on the investigation of MSF immune enhancer potential and its anti-trichomonads vaginalis activity. For the first evaluation, MSF wad added to a bovine herpesvirus 5 vaccine, at 100 and 500 μg doses. However total IGg titres determined by ELISA were not statistically significant. The antitrichomonads activity of MSF was compared a saponin enriched fraction from the species Quillaja saponaria (Quillaja) and to tyloxapol and polysorbate 80. After 24h of incubation MSF presented a dose-dependent activity with total trophozoites lethality at a concentration of 0.6 g/L. The activity was higher than the synthetic surfactants and similar to Quillaja. The treatment with metronidazole (MTZ), peformed in association and after exposing the trophozoites with MSF did not show any synergistic effect of MZT and MSF which suggest an absence of interaction between the compounds and also that they probably have distinct mechanisms of action. The physicochemical evaluation of MSF focused the determination of MSF micelles size and shape, their rheological behaviour and ability to increase the solubility of hydrophobic compounds. MSF critical micellar concentration was determined as 0.41 g/L using a hydrophobic dye as a probe. The transmission electron microscopy (TEM) and CRYO-TEM analysis revealed the occurrence of filiform micelles higher than 500 nm and smaller sizes spherical micelles simultaneously. The spherical micelles radius of 17.9 Å were determined using small angle neutron scattering.and they corresponded to 23.1 and 32.6 % of the total micelles in MSF solutions of 0.5 and 1.0 % w/v, respectively. The rheological behavior of MSF ranging in concentration from 0.25 to 4.0% was determined on a dynamic strain control rheometer and a viscoelastic behavior was observed for all concentrations. These findings corroborate the occurrence of nonspherical micelles very long in size (wormlike). MSF ability to improve the solubilisation of poor aqueous soluble drugs was assessed using carbamazepine (CBZ) and flurbiprofen (FLB) as a model of amphiphilic basic and acidic coumpounds. Saponin enriched fractions were evaluated in concentrations ranging from 0.13 to 1.5 %. Quillaja was more efficient toward the weak acid while MSF was able to increase significantly the CBZ solubility. The increase on CBZ and FLB solubility after MSF addition was of 0.0145 and 0.0129 g/L, respectively.

Os alcaloides têm apresentado diversas atividades biológicas. Entre eles, a montanina vem demonstrando um bom desempenho nesse sentido, como, atividade antioxidante, ação inibitória do crescimento de culturas bacterianas e importante atividade de inibição do crescimento de linhagens tumorais. Atualmente, não existem muitos relatos da sua caracterização ou métodos analíticos quantitativos disponíveis na literatura para atribuir seu teor. Assim, após purificação, a caracterização da montanina foi realizada por calorimetria exploratória diferencial (DSC), espectroscopia na região do ultravioleta (UV), infravermelho (IV), espectrometria de massas (CLAE-EM), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1H), de carbono (RMN13C) e em 2D homo e heteronucleares tais como COSY (nJH-H, escalar), NOESY (nJH-H, dipolar), HSQC (1JH-C, escalar) e HMBC (nJH-C, escalar). Na sequência, foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada aos detectores ultravioleta e aerossol carregado (CLAE- UV/DAC) para a quantificação da montanina. Os mesmos foram validados, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, intervalo, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez. Os resultados obtidos foram avaliados por estatística descritiva e os métodos comparados pelo resultado da análise de variância (ANOVA). Desse modo, foram desenvolvidos procedimentos que podem ser aplicados para aprimorar o controle de qualidade, contribuindo para assegurar a eficácia terapêutica da montanina. / Alkaloids have several biological activities. Among them, montanine have shown antioxidant activity, inhibitory effect on bacterial growth and important activity inhibiting growth of some tumor cell lines. Currently, there are a few reports about its characterization as well as quantitative analytical methods to determine its purity. Thus, after a purification step, montanine will be characterized by its differential scanning calorimetry (DSC), ultraviolet spectroscopy (UV), infrared spectroscopy (IR), mass spectrometry (HPLC-MS), nuclear magnetic resonance of proton (NMR1H), carbon (NMR13C) and 2D homo and heteronuclear such as COSY (nJH-H, scalar), NOESY (nJH-H, dipolar), HSQC (1JH-C, scalar) and HMBC (nJH-C, scalar). Further, quantitation methods will be developed employing high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with ultraviolet and charged aerosol detectors (HPLC-UV/CAD). These methods will be validated regarding the parameters specificity, linearity, range, detection limit, quantitation limit, precision, accuracy and robustness. The results will then be evaluated by descriptive statistics and the developed methods will be compared using analysis of variance (ANOVA). Therefore, tests will be developed that can be used to improve quality control, helping to ensure the therapeutic efficacy of montanine.

Neste trabalho utilizou-se a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a eletroforese capilar (EC) como ferramentas analíticas para avaliação de flavonoides em extratos hidrolisados de folhas de Rubus e de Morus. Os extratos foram preparados por hidrólise ácida em ultrassom e analisados por CLAE-DAD e EC-DAD. Os métodos elaborados foram validados e aplicados. Quercetina e canferol foram identificados nestes extratos por CLAE-DAD, EC-DAD e CLUE-DAD/EM. Em Rubus erythrocladus quantificou-se 848,43 ± 66,68 μg.g-1 e 304,35 ± 17,29 μg.g-1 de quercetina e canferol, respectivamente, por CLAE-DAD e 836,37 ± 149,43 μg.g-1 de quercetina por EC-DAD. Em Rubus idaeus quantificou-se 698,32 ± 1,29 μg.g-1 e 184,20 ± 4,34 μg.g-1 de quercetina e canferol, respectivamente, por CLAE-DAD. Em Morus nigra quantificou-se 2323,90 ± 145,35 μg.g-1 e 1446,36 ± 59,00 μg.g-1, de quercetina e canferol, respectivamente, por CLAE-DAD e 2552,82 ± 275,30 μg.g-1 e 1188,67 ± 99,21 μg.g-1 de quercetina e canferol, respectivamente, por EC-DAD. Não foi observada diferença significativa entre a quantificação por CLAE-DAD e por EC-DAD, porém o método por CLAE-DAD se mostrou muito mais sensível do que o método por EC-DAD. Os mesmos compostos também foram identificados nestes extratos por CLUE-DAD/EM. Por esta ferramenta analítica se pode observar uma diferença entre o perfil químico das amostras de Rubus e de Morus. Quatro amostras comerciais de folhas de amora foram analisadas, observando grandes variações nas concentrações de quercetina e de canferol presentes nestes extratos. Além disso, através de um screening de atividade antifúngico verificou-se que os extratos não hidrolisados de Rubus erythrocladus e Rubus idaeus apresentaram ação contra três espécies de fungos filamentosos patógenos humanos: Thichophyton rubrum 51, Microsporum gypseum 01 e Microsporum canis 40. / In this work we used the high performance liquid chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE) as analytical tools to evaluate the hydrolyzed flavonoids in extracts of Rubus and Morus leaves. The extracts were prepared by acid hydrolysis in ultrasound and analyzed by HPLC- DAD and CE -DAD. The developed methods were validated and applied. Quercetin and kaempferol were identified in these extracts by HPLC-DAD, EC-DAD and UPLC-DAD/MS. In Rubus erythrocladus were quantified 848.43 ± 66.68 μg.g-1 and 304.35 ± 17.29 μg.g-1 of quercetin and kaempferol, respectively, by HPLC-DAD and 836.37 ± 149.43 μg.g-1 of quercetina by CE –DAD. In Rubus idaeus were quantified 698.32 ± 1.29 μg.g-1 and 184.20 ± 4.34 μg.g-1 of quercetin and kaempferol, respectively, by HPLC-DAD. In Morus nigra were quantified 2323.90 ± 145.35 μg.g-1 and 1446.36 ± 59.00 μg.g-1 of quercetin and kaempferol, respectively, by HPLC-DAD and 2552.82 ± 275.30 μg.g-1 and 1188.67 ± 99.21 μg.g-1 of quercetin and kaempferol, respectively, by CE -DAD. No significant difference in quantification by HPLC-DAD and CE-DAD was observed, but the HPLC-DAD method proved to be more sensitive than EC-DAD method. The same compounds were also identified in these extracts by UPLC-DAD/EM. Using this analytical tool, it was possible to observe a difference in the chemical profile of Rubus and Morus extracts. Commercial samples of blackberry leaves tea were analyzed by HPLC-DAD and it was observed big variation in the concentrations of quercetin and kaempferol in these extracts. Moreover, through a screening antifungal activity, it was found that no hydrolyzed extracts of Rubus idaeus and Rubus erythrocladus showed action against three species of filamentous fungal human pathogens: Thichophyton rubrum 51, Microsporum gypseum 01 and Microsporum canis 40.

Um método confiável e eficiente por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido para o controle de qualidade de extratos de P. incarnata. O método desenvolvido inclui uma estratégia original para identificação preliminar da espécie e operação simples baseada no modo de eluição isocrático. Este método foi validado para os flavonoides C-glicosilados vitexina e isovitexina, considerados marcadores da espécie e, aplicado na análise qualitativa e quantitativa de quatorze formulações comerciais com insumo vegetal composto exclusivamente de P. incarnata As análises foram realizadas com uma coluna C18 e à temperatura ambiente. Os comprimentos de onda de detecção foram 330 (vitexina e isovitexina) e 254 nm (rutina, marcador de contaminação). O método analítico foi linear para vitexina no intervalo de 5 - 40 ug/mL e para isovitexina no intervalo 5 - 60 ug/mL. Das quatorze amostras analisadas, oito eram em forma farmacêutica líquida (FFL) e seis em forma farmacêutica sólida (FFS). Seis amostras comerciais em FFL e seis amostras em FFS apresentaram perfil compatível com P. incarnata. As concentrações obtidas para as FFL foram vitexina 17,87 - 29,13 ug/mL e isovitexina 27,47 - 65,07 ug/mL, respectivamente. As FFS apresentaram concentração de vitexina entre 10,0 - 32,26 ug/mL e isovitexina 36,16 - 100,83 ug/mL. O método demonstrou ser confiável e eficiente para análise qualitativa e quantitativa de vitexina e isovitexina nos extratos; por esta razão foi considerado viável para a prática diária do controle de qualidade. A análise por cromatografia de líquida de alta eficiência acoplada com detector de espectroscopia de massas (CLAE-EM) foi realizada para investigar os principais fitoconstituintes, sete picos do extrato puderam ser resolvidos; e, forneceram fortes evidências sobre a composição química do extrato de P. incarnata. / A reliable and efficient method of high-performance liquid chromatography was developed for the quality control of Passiflora incarnata extracts. The quality control includes an original preliminary identification of this species and simple operation process based on isocratic elution. This method was validated for vitexin and isovitexin, C-glycoside flavonoids, considered markers of this species and applied to qualitative and quantitative analysis of fourteen commercial herbal medicines of P. incarnata extracts. Analysis was achieved on reversed-phase C18 column at ambient temperature. The wavelengths used for detection were 330 nm (vitexin and isovitexin) and 254 nm (rutin, a marker of contamination). Method was linear over vitexin concentration range of 540 g/mL and isovitexin 560 g/mL. Among of fourteen samples, eight were in liquid dosage form (LDF) and six in solid dosage form (SDF). Six commercial samples in LDF and six samples in SDF showed profile compatible with P. incarnata. Concentrations were determined for LDF vitexin 17.87  29.13 g/mL and isovitexin 27.47  65.07 g/mL. While SDF samples showed vitexin concentration range 10.00  32.26 g/mL and isovitexin 36.16  100.83 g/mL. The method demonstrated to be reliable and efficient for assay and qualitative analysis of vitexin and isovitexin in P. incarnata extracts; for that reason for practical application on quality control. Analysis were performed through high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometer detector (LC/MS) to investigate the main phytoconstituents, seven peaks from P. incarnata extract could be resolved; and provided strong evidences about the chemical composition of extracts.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.