Neisseria gonorrhoeae verursacht die sexuell übertragbare Krankheit Gonorrhoe und ist ein Typ-IV-Pili (Tfp) exprimierendes Bakterium, das den Urogenitaltrakt besiedelt. Frühe Infektionsstadien piliierter N. gonorrhoeae (P+GC) sind durch die Tfp-vermittelte Adhärenz an Wirtszellen gekennzeichnet, dann erfolgt die Bildung von Mikrokolonien auf Wirtszellepithelien. Hier wird gezeigt, dass die Wirtszellen an der effizienten Bildung der extrazellulären Mikrokolonien beteiligt sind. P+GC die fixierte Wirtszellen infizieren weisen eine verzögerte Mikrokoloniebildung gegenüber einer Infektion lebender Wirtszellen auf. Kortikales Aktin wird zusammen mit Signalproteinen innerhalb der Wirtszellen zu den adhärierten Bakterien rekrutiert, darunter das Hauptstrukturprotein von Caveolae-Membrandomänen, Caveolin-1 (Cav1). Eine Reduzierung der Expression von Cav1 führt zu einer verstärkten Aufnahme von P+GC in die Wirtszellen, wohingegen die Expression von Cav1 in Cav1-negativen Zellen eine Internalisierung verhindert. Internalisierte Bakterien weisen dabei geringere Überlebensraten auf je länger sie in den Wirtszellen verbleiben. Die Rekrutierung von Cav1 ist eine unmittelbare und kontinuierliche zelluläre Antwort auf eine Infektion mit P+GC, welche die Phosphorylierung von Cav1 an Tyrosin 14 bedingt. Zusätzlich erforderte die Cav1-vermittelte Blockierung der Internalisierung der Bakterien und die Verankerung von Cav1 mit dem Zytoskelett eine Tyrosinphosphorylierung von Cav1. Eine Analyse möglicher Interaktionspartner von phosphoryliertem Cav1 zeigte eine direkte Interaktion mit Vav2. Sowohl Vav2 als auch sein Substrat, die kleine GTPase RhoA, blockieren die Aufnahme von Bakterien in die in Wirtszellen. Die Aktivierung von RhoA nach P+GC Infektion erfordert die Expression von Cav1, was auf einen Cav1-Vav2-RhoA Signalweg hindeutet. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit sechs neue, eine SH2-Domäne-beinhaltende Interaktionspartner von phosphoryliertem Cav1 identifiziert. / Neisseria gonorrhoeae causes the sexually transmitted disease gonorrhea and colonizes mucosal epithelia of the human urogenital tract. The early stages of infection with piliated N. gonorrhoeae (P+GC) are characterized by Tfp-mediated adherence to host cells, followed by formation of bacterial microcolonies on the surface of host cells. This study provides evidence that host cell participation is required for the efficient formation of extracellular microcolonies during Neisseria infection. P+GC infecting fixed host cells demonstrate altered motility and delayed microcolony formation compared to infecting living host cells. Cortical actin and various signal transducing proteins are recruited to the site of bacterial attachment within host cells, one of them being the major structural protein of plasma membrane caveolae, Caveolin-1 (Cav1). Down-regulation of Cav1 results in increased uptake of P+GC into host cells whereas expression of the protein in Cav1-negative cells blocks bacterial internalization. Host cell entry results in decreased viability of internalized bacteria over time. Cav1 recruitment is demonstrated to be an immediate and continuous cellular response to P+GC infection that involves Cav1 phosphorylation on its tyrosine 14 residue. Prevention of bacterial uptake mediated by Cav1 as well as tight association of Cav1 with the cytoskeleton also requires tyrosine phosphorylation. A broad analysis of interaction partners of phosphorylated Cav1 revealed a direct interaction with the Rho-family guanine nucleotide exchange factor Vav2. Both Vav2 and its substrate, the small GTPase RhoA, are involved in preventing bacterial uptake and RhoA activation after P+GC infection requires Cav1 expression, thus providing evidence for a Cav1-Vav2-RhoA signaling cascade. Moreover, six novel SH2-domain containing interaction partners of tyrosine phosphorylated Cav1 have been identified, all of which have been implicated in modulating the cytoskeleton.

La protéine d’échafaudage Gab1 amplifie la signalisation de plusieurs récepteurs à fonction tyrosine kinase (RTK). Entre autres, elle promeut la signalisation du VEGFR2, un RTK essentiel à la médiation de l’angiogenèse via le VEGF dans les cellules endothéliales. En réponse au VEGF, Gab1 est phosphorylé sur tyrosine, ce qui résulte en la formation d’un complexe de protéines de signalisation impliqué dans le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration des cellules endothéliales. Gab1 est un modulateur essentiel de l’angiogenèse in vitro et in vivo. Toutefois, malgré l’importance de Gab1 dans les cellules endothéliales, les mécanismes moléculaires impliqués dans la médiation de ses fonctions, demeurent mal définis et la participation du second membre de la famille, Gab2, reste inconnue. Dans un premier temps, nous avons démontré que tout comme Gab1, Gab2 est phosphorylé sur tyrosine, qu’il s’associe de façon similaire avec des protéines de signalisation et qu’il médie la migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Cependant, contrairement à Gab1, Gab2 n’interagit pas avec le VEGFR2 et n’est pas essentiel pour l’activation d’Akt et la promotion de la survie cellulaire. En fait, nous avons constaté que l’expression de Gab2 atténue l’expression de Gab1 et l’activation de la signalisation médiée par le VEGF. Ainsi, Gab2 semble agir plutôt comme un régulateur négatif des signaux pro-angiogéniques induits par Gab1. La migration cellulaire est une des étapes cruciales de l’angiogenèse. Nous avons démontré que Gab1 médie l’activation de la GTPase Rac1 via la formation et la localisation d’un complexe protéique incluant la GEF VAV2, la p120Caténine et la Cortactine aux lamellipodes des cellules endothéliales en réponse au VEGF. De plus, nous montrons que l’assemblage de ce complexe corrèle avec la capacité du VEGF à induire l’invasion des cellules endothéliales et le bourgeonnement de capillaires, deux phénomènes essentiels au processus angiogénique. La régulation des RhoGTPases est également régulée par des inactivateurs spécifiques les « Rho GTPases activating proteins », ou GAPs. Nous décrivons ici pour la première fois le rôle de la GAP CdGAP dans les cellules endothéliales et démontrons son importance dans la médiation de la signalisation du VEGF via la phosphorylation sur tyrosine de Gab1 et l’activation des RhoGTPases Rac1 et Cdc42. Ainsi, dù à son importance sur l’activation de voies de signalisation du VEGF, CdGAP représente un régulateur crucial de la promotion de diverses activités biologiques essentielles à l’angiogenèse telles que la migration cellulaire, et le bourgeonnement de capillaires in vitro et d’aortes de souris ex vivo. De plus, les embryons de souris CdGAP KO présentent des hémorragies et de l’œdème, et ces défauts vasculaires pourraient être responsables de la mortalité de 44% des souris CdGAP knock-out attendues. Nos études amènent donc une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires induits par le VEGF et démontrent l’implication centrale de Gab1 et des régulateurs des RhoGTPases dans la promotion de l’angiogenèse. Cette meilleure compréhension pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles ou approches thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients souffrant de maladies associées à une néovascularisation incontrôlée telles que le cancer. / The Gab1 scaffolding protein allows signaling of multiple Receptors Tyrosine Kinase (RTKs). Among other things, it allows VEGFR2 signaling, an essential RTK to mediate angiogenesis via VEGF in endothelial cells. In response to VEGF, Gab1 is tyrosine phosphorylated, resulting in the formation of a signaling protein complex involved in the remodeling of the actin cytoskeleton and the migration of endothelial cells. Gab1 is a key modulator of angiogenesis in vitro and in vivo. However, despite the importance of Gab1 in endothelial cells, the molecular mechanisms involved in mediating its functions remain poorly defined and the participation of the second family member, Gab2, remains unknown. Initially, we demonstrated that as with Gab1, Gab2 is tyrosine phosphorylated, it associates with similar signaling proteins and induces cell migration in response to VEGF in endothelial cells. However, Gab2 does not interact with VEGFR2 and is not essential for the activation of Akt and the promotion of cell survival. In fact, we found that the expression of Gab2 attenuates the expression of Gab1 and activation of VEGF-mediated signaling. In light of these results, we propose that in endothelial cells stimulated with VEGF, Gab2 acts as a negative regulator of pro-angiogenic signals induced by Gab1. Cell migration is a crucial step in angiogenesis, though, few studies have investigated the involvement of Gab1 in regulating different molecular mechanisms for actin remodeling leading to endothelial cell migration. We demonstrated that Gab1 mediates activation of Rac1 GTPase via the formation and localization of a protein complex including the GEF VAV2, p120 Catenin and Cortactin to lamellipodia of endothelial cells in response to VEGF. Furthermore, we show that the assembly of this complex correlates with the ability of VEGF to induce endothelial cell invasion and capillary sprouting, phenomena essential to the angiogenic process. RhoGTPases are also regulated by specific inactivators, "Rho GTPase activating proteins" or GAPs. The involvement of GAPs in promoting angiogenesis is relatively poorly described. Here we describe for the first time the role of the GAP CdGAP in endothelial cells and demonstrate its importance in mediating VEGF signaling via tyrosine phosphorylation of Gab1 and activation of Rac1 and Cdc42 RhoGTPases. Due to its importance in the activation of signaling pathways critical in VEGF signaling, CdGAP is thus an important protein for the regulation of various essential biological activities such as cell migration, sprouting and therefore in vitro and ex vivo angiogenesis. In addition, embryos of CdGAP knock-out mice exhibit vascular defects, excessive branching vessels, haemorrhages and edema which may be responsible for the 44% mortality seen in CdGAP knock-out mice expected. Our studies contribute to a better understanding of the molecular mechanisms induced by VEGF and demonstrate the central involvement of Gab1 and regulators of RhoGTPases in promoting angiogenesis. This understanding could lead to the identification of new targets and therapeutic approaches to improve the treatment of patients with uncontrolled neovascularization associated with diseases such as cancer.