Avaliou-se em laboratório a patogenicidade de 52 isolados de fungos entomopatogênicos a Brevipalpus phoenicis e a produção, em meio sólido, de quatro isolados de Hirsutella spp.. Utilizando-se microscópio eletrônico de varredura, estudou-se as etapas do ciclo biológico de Hirsutella sp. (isolado 1269) em adultos de B. phoenicis, além da ocorrência de transmissão horizontal deste patógeno para adultos do ácaro a partir de cadáveres esporulados e de substrato contaminado. Todos os isolados de Hirsutella sp. foram patogênicos para o ácaro causando mortalidade de adultos superiores a 90% após seis dias da inoculação. Comprovou-se também que em meio de cultura completo (M.C.) que o isolado 1269 foi o que apresentou maior crescimento vegetativo e esporulação, sendo selecionado como o mais promissor. O ciclo biológico completo de Hirsutella sp., desde a adesão dos conídios ao ácaro até sua extrusão, ocorreu em 120 horas após a aplicação. A transmissão horizontal do patógeno a partir de cadáveres e do substrato contaminado ocasionou mortalidade superior a 50% em ambas as situações, comprovando que o fungo foi capaz de infectar novos hospedeiros. Contatou-se que Hirsutella sp. é um patógeno eficiente no controle de B. phoenicis podendo ser utilizado em campo em estratégias de introdução inoculativa, inundativa, incremento e conservação. / In this research, the patogenicity of 52 isolates of entomopathogenic fungi against Brevipalpus phoenicis and the production of four isolates of Hirsutella spp. in solid medium (M.C.) were evalueted under laboratory condition. The stages of the biological cycle of Hirsutella sp. (isolated 1269) on adults of B. phoenicis were evalueted with the use of an electron scan microscope, besides the occurrence of horizontal transmission of this fungi from cadavers and from an inoculate substract to new hosts. The isolates of Hirsutella sp. tested were pathogenic to the mite, with high mortality (>90%) after six days of the inoculation. The isolate 1269 showed high levels of vegetative growth and sporulation and was selected as the most promising one. The complete biological cycle of Hirsutella sp. ocurred after 120 hours of the inoculation, from adhesion to extrusion processes. The horizontal transmission of fungi from cadavers and inoculate substract ocurred by causing levels mortality superior to 50% in both cases, showing that the fungi was capable to infect new hosts in these situations. Hirsutella sp. was an efficient pathogen in the control of B. phoenicis and could be exploited in field control strategies through an inoculative introduction, increment or conservation.

O ácaro-da-leprose Brevipalpus phoenicis (Geijskes) é uma das principais pragas da citricultura por ser o vetor do vírus causador da leprose dos citros. O acaricida propargite tem sido bastante utilizado no controle deste ácaro. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi o de coletar subsídios para a implementação de um programa de manejo da resistência de B. phoenicis ao propargite. Foram conduzidos trabalhos de caracterização da linha-básica de suscetibilidade de B. phoenicis ao propargite, monitoramento da suscetibilidade ao propargite em diferentes populações de B. phoenicis, caracterização da resistência de B. phoenicis ao propargite e avaliação da interação de B. phoenicis, propargite e citros. A técnica de bioensaio adotada foi o contato residual pulverizando discos de folhas de citros com o auxílio da Torre de Potter. As CL50 (IC 95%) estimadas para as linhagens suscetível (S) e resistente (R) foram 217,51 (207,07-228,35) e 2.195,43 (1.759,23-2.808,21) mg de propargite/ml de água [I.A. (ppm)] respectivamente. A razão de resistência foi de 10 vezes. As concentrações diagnósticas definidas para o monitoramento da suscetibilidade foram 320 e 720 mg de propargite/ml de água [I.A. (ppm)]. Foram observadas diferenças significativas na suscetibilidade de populações do ácaro-da-leprose ao propargite. A partir da avaliação da interação de B. phoenicis, propargite e citros, verificou-se que o modo de exposição de ácaros por contato residual proporcionou maior discriminação entre as linhagens S e R do que por contato direto em condições laboratoriais. A persistência da atividade biológica de propargite sobre frutos de citros foi baixa em condições de campo e as linhagens S e R foram claramente discriminadas pelo resíduo de propargite, sugerindo que a evolução da resistência pode se processar principalmente pelo contato residual de B. phoenicis sobre o propargite. / The citrus flat mite Brevipalpus phoenicis (Geijskes) is one of the most important citrus pests because it vectors the citrus leprosis virus. The acaricide propargite has been frequently used to control this mite. Therefore, the objective of this work was to collect basic information for implementing a resistance management program of B. phoenicis to propargite. In this work it was conducted studies on baseline susceptibility of B. phoenicis to propargite, monitoring the susceptibility to propargite in different B. phoenicis populations, characterization of propargite resistance in B. phoenicis and evaluation of interaction of B. phoenicis, propargite and citrus. The bioassay technique used in this study was the residual contact with the use of citrus leaf disks sprayed with the Potter spray tower. The estimated LC50 (95% CI) to susceptible (S) and resistant (R) strains were 217.51 (207.07-228.35) and 2,195.43 (1,759.23-2,808.21) mg of propargite/ml of water [A.I. (ppm)], respectively. The resistance ratio was 10-fold. The diagnostic concentrations defined for monitoring the resistance were 320 and 720 mg of propargite/ml of water [A.I. (ppm)]. A significant difference in susceptibility to propargite was detected in B. phoenicis populations. Studies on evaluation of interaction of B. phoenicis, propargite and citrus revealed that the mode of exposure of mites by residual contact gave better discrimination between S and R strains than by direct contact under laboratory conditions. The persistence of biological activity of propargite on citrus fruit was low under field conditions and there was a clear discrimination between S and R strain on propargite residues, suggesting that the evolution of resistance can be processed mainly by the residual contact of B. phoenicis on propargite.

O ácaro-da-leprose Brevipalpus phoenicis (Geijskes) é uma das principais pragas da citricultura por ser o vetor do vírus causador da leprose dos citros. O acaricida propargite tem sido bastante utilizado no controle deste ácaro. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi o de coletar subsídios para a implementação de um programa de manejo da resistência de B. phoenicis ao propargite. Foram conduzidos trabalhos de caracterização da linha-básica de suscetibilidade de B. phoenicis ao propargite, monitoramento da suscetibilidade ao propargite em diferentes populações de B. phoenicis, caracterização da resistência de B. phoenicis ao propargite e avaliação da interação de B. phoenicis, propargite e citros. A técnica de bioensaio adotada foi o contato residual pulverizando discos de folhas de citros com o auxílio da Torre de Potter. As CL50 (IC 95%) estimadas para as linhagens suscetível (S) e resistente (R) foram 217,51 (207,07-228,35) e 2.195,43 (1.759,23-2.808,21) mg de propargite/ml de água [I.A. (ppm)] respectivamente. A razão de resistência foi de 10 vezes. As concentrações diagnósticas definidas para o monitoramento da suscetibilidade foram 320 e 720 mg de propargite/ml de água [I.A. (ppm)]. Foram observadas diferenças significativas na suscetibilidade de populações do ácaro-da-leprose ao propargite. A partir da avaliação da interação de B. phoenicis, propargite e citros, verificou-se que o modo de exposição de ácaros por contato residual proporcionou maior discriminação entre as linhagens S e R do que por contato direto em condições laboratoriais. A persistência da atividade biológica de propargite sobre frutos de citros foi baixa em condições de campo e as linhagens S e R foram claramente discriminadas pelo resíduo de propargite, sugerindo que a evolução da resistência pode se processar principalmente pelo contato residual de B. phoenicis sobre o propargite. / The citrus flat mite Brevipalpus phoenicis (Geijskes) is one of the most important citrus pests because it vectors the citrus leprosis virus. The acaricide propargite has been frequently used to control this mite. Therefore, the objective of this work was to collect basic information for implementing a resistance management program of B. phoenicis to propargite. In this work it was conducted studies on baseline susceptibility of B. phoenicis to propargite, monitoring the susceptibility to propargite in different B. phoenicis populations, characterization of propargite resistance in B. phoenicis and evaluation of interaction of B. phoenicis, propargite and citrus. The bioassay technique used in this study was the residual contact with the use of citrus leaf disks sprayed with the Potter spray tower. The estimated LC50 (95% CI) to susceptible (S) and resistant (R) strains were 217.51 (207.07-228.35) and 2,195.43 (1,759.23-2,808.21) mg of propargite/ml of water [A.I. (ppm)], respectively. The resistance ratio was 10-fold. The diagnostic concentrations defined for monitoring the resistance were 320 and 720 mg of propargite/ml of water [A.I. (ppm)]. A significant difference in susceptibility to propargite was detected in B. phoenicis populations. Studies on evaluation of interaction of B. phoenicis, propargite and citrus revealed that the mode of exposure of mites by residual contact gave better discrimination between S and R strains than by direct contact under laboratory conditions. The persistence of biological activity of propargite on citrus fruit was low under field conditions and there was a clear discrimination between S and R strain on propargite residues, suggesting that the evolution of resistance can be processed mainly by the residual contact of B. phoenicis on propargite.

Avaliou-se em laboratório a patogenicidade de 52 isolados de fungos entomopatogênicos a Brevipalpus phoenicis e a produção, em meio sólido, de quatro isolados de Hirsutella spp.. Utilizando-se microscópio eletrônico de varredura, estudou-se as etapas do ciclo biológico de Hirsutella sp. (isolado 1269) em adultos de B. phoenicis, além da ocorrência de transmissão horizontal deste patógeno para adultos do ácaro a partir de cadáveres esporulados e de substrato contaminado. Todos os isolados de Hirsutella sp. foram patogênicos para o ácaro causando mortalidade de adultos superiores a 90% após seis dias da inoculação. Comprovou-se também que em meio de cultura completo (M.C.) que o isolado 1269 foi o que apresentou maior crescimento vegetativo e esporulação, sendo selecionado como o mais promissor. O ciclo biológico completo de Hirsutella sp., desde a adesão dos conídios ao ácaro até sua extrusão, ocorreu em 120 horas após a aplicação. A transmissão horizontal do patógeno a partir de cadáveres e do substrato contaminado ocasionou mortalidade superior a 50% em ambas as situações, comprovando que o fungo foi capaz de infectar novos hospedeiros. Contatou-se que Hirsutella sp. é um patógeno eficiente no controle de B. phoenicis podendo ser utilizado em campo em estratégias de introdução inoculativa, inundativa, incremento e conservação. / In this research, the patogenicity of 52 isolates of entomopathogenic fungi against Brevipalpus phoenicis and the production of four isolates of Hirsutella spp. in solid medium (M.C.) were evalueted under laboratory condition. The stages of the biological cycle of Hirsutella sp. (isolated 1269) on adults of B. phoenicis were evalueted with the use of an electron scan microscope, besides the occurrence of horizontal transmission of this fungi from cadavers and from an inoculate substract to new hosts. The isolates of Hirsutella sp. tested were pathogenic to the mite, with high mortality (>90%) after six days of the inoculation. The isolate 1269 showed high levels of vegetative growth and sporulation and was selected as the most promising one. The complete biological cycle of Hirsutella sp. ocurred after 120 hours of the inoculation, from adhesion to extrusion processes. The horizontal transmission of fungi from cadavers and inoculate substract ocurred by causing levels mortality superior to 50% in both cases, showing that the fungi was capable to infect new hosts in these situations. Hirsutella sp. was an efficient pathogen in the control of B. phoenicis and could be exploited in field control strategies through an inoculative introduction, increment or conservation.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

Os agroecossistemas consistem em complexas relações tróficas entre plantas, herbívoros, e seus inimigos naturais. Sabe-se que a maioria das plantas é capaz de produzir compostos voláteis, utilizados como sinais químicos por diferentes grupos de insetos. Esses voláteis podem ser produzidos de forma constitutiva em plantas sadias, ou seja, sem indução. Por outro lado, a produção de voláteis induzidos se dá a partir do contato de secreções liberadas pelo fitófago com injurias ocasionadas pela alimentação ou oviposição no tecido vegetal. Para os fitófagos esses voláteis podem sinalizar a presença da planta hospedeira, bem como a presença de coespecíficos e do parceiro sexual. Já para os inimigos naturais, predadores e parasitóides, os voláteis induzidos podem sinalizar a presença do inseto fitófago (presa/ hospedeiro) na planta. Nesse contexto as respostas comportamentais de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), aos voláteis de plantas de murta, Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae), infestadas ou não por coespecíficos, foram estudadas. Também foram investigadas as respostas dos psilídeos aos voláteis de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck (Rutaceae) infectadas por bactérias causadoras do Huanglongbing ou HLB, uma das mais sérias doenças dos citros. Nos bioensaios visando compostos repelentes a D. citri, foram testados os voláteis de plantas de goiaba, Psidium guajava L.(Myrtaceae) e sua interferência na localização de plantas de Citrus limonia (L.) Osbeck (Rutaceae) pelos psilídeos. As respostas comportamentais foram mensuradas em olfatômetro Y e de quatro vias. Antes de estabelecer os bioensaios de olfatometria foram realizados estudos do comportamento sexual de D. citri. Os resultados obtidos evidenciaram que o início da atividade sexual de D. citri ocorreu entre o segundo e terceiro dia após a emergência, e que os psilídeos foram mais ativos durante a fotofase. Quanto às influências dos voláteis de plantas, machos e fêmeas de D. citri responderam diferentemente aos mesmos estímulos olfativos. Assim, os machos foram atraídos apenas aos odores associados às fêmeas. Já as fêmeas, foram atraídas aos odores das plantas, porém, evitando os odores associados aos machos, inclusive de plantas previamente infestadas por estes. Verificou-se também, que os adultos de D. citri distinguiram os voláteis de citros com HLB dos voláteis de plantas saudáveis. Sendo assim, ficou nítida a atratividade dos voláteis de plantas infectadas, tanto aos psilídeos machos quanto às fêmeas. Na busca por compostos repelentes, também foi possível demonstrar que os voláteis de P. guajava não somente dificultou à localização de plantas de C. limonia por D. citri, como também repeliram os psilídeos. As descobertas aqui apresentadas poderão auxiliar a elaboração de novas táticas para o manejo comportamental de D. citri. / The agro-ecosystems consist of complex trophic relationships between plants, herbivores and their natural enemies. It is known that the majority of plants can produce volatiles compounds used as chemical signals by different groups of insects. These compounds can be produced constitutively in healthy plants, i.e., without induction. In other hand, the production of induced volatiles occurs from the contact of secretions released by phytophagous with injuries caused by feeding or oviposition in plant tissue. For phytophagous, these volatile compounds may signal the presence of the host plant, as well as the presence of conspecifics and the sexual partner. Although, natural enemies, predators and parasitoids, the induced volatiles can signal the presence of phytophagous insects (prey / host) in the plant. In this context, the behavioral responses of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) to plant volatiles of jasmine, Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae) infested or not by conspecifics, were studied. It was also investigated the responses of psyllids to volatiles of Citrus sinensis infected by bacteria that cause the huanglongbing or HLB, one of the most serious diseases of citrus. Given the studies that aim to identify repellent compounds to D. citri, it was tested plant volatiles of guava, Psidium guajava L. (Myrtaceae) and their impact on plant location of Citrus limonia (L.) Osbeck (Rutaceae) by psyllids. Behavioral responses were measured by Y-tube and four-way olfactometers. Before establishing the olfactometry assays, studies of D. citri sexual behavior were performed. The obtained results showed that the beginning of D. citri sexual activities occurred between the second and third days after emergence, and the psyllids were more active during the photophase. In regard to the effects of plant volatiles, males and females of D. citri differently responded to the same olfactory stimuli. Thus, males were attracted only to odors associated with females. Females were attracted to plant odors, although they avoided odors associated with males, including plants previously infested by them. It was also verified that D. citri adults distinguished volatiles citrus with HLB from volatiles released by healthy plants. Given that, it was clear that volatiles from infected plants were attractive to both males and females psyllids. In search of repellent compounds, also was possible demonstrated that P. guajava volatiles not only hindered the location of plants of C. limonia by D. citri, but also provided repellent effect to psyllids. The findings presented here may help the development of new tactics for the behavioral management of D. citri.

O conhecimento da dinâmica da resistência de pragas a pesticidas é de fundamental importância para a implementação de estratégias de manejo da resistência. Desta forma, o principal objetivo do presente trabalho foi estudar a dinâmica da resistência de Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) ao acaricida dicofol em pomares comerciais de citros durante um período de aproximadamente três anos. Para tanto, foram realizados estudos para avaliar a resposta à pressão de seleção com dicofol em populações de B. phoenicis com diferentes freqüências iniciais de resistência e acompanhamento da freqüência de resistência na ausência de pressão seletiva. Alguns fatores que podem estar envolvidos na dinâmica da resistência de B. phoenicis a acaricidas como a capacidade de dispersão e a efetividade de hospedeiros alternativos como refúgio de indivíduos suscetíveis foram avaliados. Aplicações de dicofol em alguns talhões de citros resultaram em aumentos significativos na freqüência de resistência. A velocidade de restabelecimento da suscetibilidade na ausência de pressão seletiva variou entre os talhões. Em alguns talhões, o restabelecimento da suscetibilidade foi observado em um período de aproximadamente um ano. Em outros talhões, o restabelecimento da suscetibilidade não foi observado mesmo após 29 meses sem o uso do dicofol. Trabalhos de dispersão de B. phoenicis conduzidos em casa de vegetação mostraram que a capacidade de dispersão por caminhamento é limitada. Com a liberação de 6.000 ácaros em um determinado ponto, apenas 3% atingiram distâncias de 40 a 50 cm. As distâncias percorridas por este ácaro foram geralmente inferiores a 1 cm.dia-1. Em condições de laboratório, verificou-se que vento de 23 km.h-1 não foi capaz de arrastar ácaros da superfície de frutos; e velocidades de 30 e 40 km.h-1 foram capazes de arrastar menos de 1% da população de ácaros provenientes tanto de colônias novas quanto de colônias velhas. Trabalhos de dispersão em condições de campo mediante a utilização de armadilhas adesivas também comprovaram que a dispersão de B. phoenicis é bastante limitada quando comparada a de outras espécies de ácaros que ocorrem nos pomares de citros. De um total 2.420 e 661 ácaros coletados em dois talhões de citros na região de Descalvado-SP, apenas 0,45 e 11,80% dos ácaros pertenciam à família Tenuipalpidae, respectivamente. Para verificar a efetividade de outras plantas hospedeiras de B. phoenicis como refúgio de indivíduos suscetíveis, a variabilidade genética em populações de B. phoenicis provenientes de cercas-vivas de sansão-de-campo (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) localizadas próximas aos pomares de citros foi avaliada mediante estimativa da freqüência de resistência ao dicofol e análise molecular. Em geral, a freqüência de resistência em populações de B. phoenicis provenientes de sansão-de-campo foi inferior a de citros em um mesmo pomar. No entanto, a análise da variabilidade genética através da técnica de RAPD - PCR mostrou que as populações de B. phoenicis provenientes de sansão-do-campo são geneticamente diferentes das populações provenientes de citros. Portanto, baseado nos resultados obtidos conclui-se que o restabelecimento da suscetibilidade de B. phoenicis ao dicofol é bastante variável e a imigração de indivíduos suscetíveis de áreas não tratadas ou de hospedeiros alternativos é bastante limitada. / The knowledge of dynamics of pest resistance to pesticides is crucial for the implementation of resistance management strategies. Therefore, the main objective of this research was to study the dynamics of the resistance of Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) to the acaricide dicofol in commercial citrus groves during a 3-year period. Studies to evaluate the selection response to dicofol were conducted in populations of B. phoenicis with different initial resistance frequencies. The frequency of resistance was also estimated in the absence of selection pressure. Some factors that influence the resistance dynamics of B. phoenicis such as the dispersal capacity and the effectiveness of alternative hosts as refuges for susceptible individuals were also evaluated in this study. There was a significant increase in the frequency of dicofol resistance with applications of dicofol in some citrus field plots. The rate of reset to susceptibility in the absence of selection pressure varied from field to field. In some fields, the reset to susceptibility was observed within approximately 12-month period. On the other hand, the reset to susceptibility was not observed even after 29 months without using dicofol. Dispersal studies of B. phoenicis on sandy surface conducted under greenhouse conditions showed that dispersal capacity by crawling is limited. After the release of 6,000 mites in one point, only 3% reached distances of 40 to 50 cm from the release point. This mite moved less than 1 cm.day-1. Wind speed of 23 km.h-1 was not enough to carry mites from citrus fruit surface under laboratory conditions; and wind speeds of 30 and 40 km.h-1 were capable to carry less than 1% of mites either from new or old mite colonies on fruits. Mite dispersal studies with the use of sticky traps under field conditions also showed that B. phoenicis dispersal is very limited when compared to other mite species that occur in citrus groves. From a total of 2,420 and 661 mites collected from two citrus fields in Descalvado-SP region, only 0.45 and 11.80% of mites were in the Tenuipalpidae family, respectively. In order to evaluate the effectiveness of other host plants of B. phoenicis as refuges for susceptible individuals, the genetic variability in populations of B. phoenicis from "sansão-de-campo" (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) located near the citrus groves was evaluated by the estimation of resistance frequencies to dicofol and by molecular techniques. In general, the frequency of resistance to dicofol in populations of B. phoenicis from "sansão-de-campo" was lower than that from citrus groves. However, the analysis of genetic variability with RAPD-PCR revealed that B. phoenicis populations from "sansão-de-campo" were genetically different from citrus groves. Based on our results, we concluded that the reset of susceptibility of B. phoenicis to dicofol is very variable and the immigration of susceptible individuals from untreated areas or alternative hosts is very limited.

O conhecimento da dinâmica da resistência de pragas a pesticidas é de fundamental importância para a implementação de estratégias de manejo da resistência. Desta forma, o principal objetivo do presente trabalho foi estudar a dinâmica da resistência de Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) ao acaricida dicofol em pomares comerciais de citros durante um período de aproximadamente três anos. Para tanto, foram realizados estudos para avaliar a resposta à pressão de seleção com dicofol em populações de B. phoenicis com diferentes freqüências iniciais de resistência e acompanhamento da freqüência de resistência na ausência de pressão seletiva. Alguns fatores que podem estar envolvidos na dinâmica da resistência de B. phoenicis a acaricidas como a capacidade de dispersão e a efetividade de hospedeiros alternativos como refúgio de indivíduos suscetíveis foram avaliados. Aplicações de dicofol em alguns talhões de citros resultaram em aumentos significativos na freqüência de resistência. A velocidade de restabelecimento da suscetibilidade na ausência de pressão seletiva variou entre os talhões. Em alguns talhões, o restabelecimento da suscetibilidade foi observado em um período de aproximadamente um ano. Em outros talhões, o restabelecimento da suscetibilidade não foi observado mesmo após 29 meses sem o uso do dicofol. Trabalhos de dispersão de B. phoenicis conduzidos em casa de vegetação mostraram que a capacidade de dispersão por caminhamento é limitada. Com a liberação de 6.000 ácaros em um determinado ponto, apenas 3% atingiram distâncias de 40 a 50 cm. As distâncias percorridas por este ácaro foram geralmente inferiores a 1 cm.dia-1. Em condições de laboratório, verificou-se que vento de 23 km.h-1 não foi capaz de arrastar ácaros da superfície de frutos; e velocidades de 30 e 40 km.h-1 foram capazes de arrastar menos de 1% da população de ácaros provenientes tanto de colônias novas quanto de colônias velhas. Trabalhos de dispersão em condições de campo mediante a utilização de armadilhas adesivas também comprovaram que a dispersão de B. phoenicis é bastante limitada quando comparada a de outras espécies de ácaros que ocorrem nos pomares de citros. De um total 2.420 e 661 ácaros coletados em dois talhões de citros na região de Descalvado-SP, apenas 0,45 e 11,80% dos ácaros pertenciam à família Tenuipalpidae, respectivamente. Para verificar a efetividade de outras plantas hospedeiras de B. phoenicis como refúgio de indivíduos suscetíveis, a variabilidade genética em populações de B. phoenicis provenientes de cercas-vivas de sansão-de-campo (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) localizadas próximas aos pomares de citros foi avaliada mediante estimativa da freqüência de resistência ao dicofol e análise molecular. Em geral, a freqüência de resistência em populações de B. phoenicis provenientes de sansão-de-campo foi inferior a de citros em um mesmo pomar. No entanto, a análise da variabilidade genética através da técnica de RAPD - PCR mostrou que as populações de B. phoenicis provenientes de sansão-do-campo são geneticamente diferentes das populações provenientes de citros. Portanto, baseado nos resultados obtidos conclui-se que o restabelecimento da suscetibilidade de B. phoenicis ao dicofol é bastante variável e a imigração de indivíduos suscetíveis de áreas não tratadas ou de hospedeiros alternativos é bastante limitada. / The knowledge of dynamics of pest resistance to pesticides is crucial for the implementation of resistance management strategies. Therefore, the main objective of this research was to study the dynamics of the resistance of Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) to the acaricide dicofol in commercial citrus groves during a 3-year period. Studies to evaluate the selection response to dicofol were conducted in populations of B. phoenicis with different initial resistance frequencies. The frequency of resistance was also estimated in the absence of selection pressure. Some factors that influence the resistance dynamics of B. phoenicis such as the dispersal capacity and the effectiveness of alternative hosts as refuges for susceptible individuals were also evaluated in this study. There was a significant increase in the frequency of dicofol resistance with applications of dicofol in some citrus field plots. The rate of reset to susceptibility in the absence of selection pressure varied from field to field. In some fields, the reset to susceptibility was observed within approximately 12-month period. On the other hand, the reset to susceptibility was not observed even after 29 months without using dicofol. Dispersal studies of B. phoenicis on sandy surface conducted under greenhouse conditions showed that dispersal capacity by crawling is limited. After the release of 6,000 mites in one point, only 3% reached distances of 40 to 50 cm from the release point. This mite moved less than 1 cm.day-1. Wind speed of 23 km.h-1 was not enough to carry mites from citrus fruit surface under laboratory conditions; and wind speeds of 30 and 40 km.h-1 were capable to carry less than 1% of mites either from new or old mite colonies on fruits. Mite dispersal studies with the use of sticky traps under field conditions also showed that B. phoenicis dispersal is very limited when compared to other mite species that occur in citrus groves. From a total of 2,420 and 661 mites collected from two citrus fields in Descalvado-SP region, only 0.45 and 11.80% of mites were in the Tenuipalpidae family, respectively. In order to evaluate the effectiveness of other host plants of B. phoenicis as refuges for susceptible individuals, the genetic variability in populations of B. phoenicis from “sansão-de-campo” (Mimosa caesalpiniaefolia Benth.) located near the citrus groves was evaluated by the estimation of resistance frequencies to dicofol and by molecular techniques. In general, the frequency of resistance to dicofol in populations of B. phoenicis from “sansão-de-campo” was lower than that from citrus groves. However, the analysis of genetic variability with RAPD-PCR revealed that B. phoenicis populations from “sansão-de-campo” were genetically different from citrus groves. Based on our results, we concluded that the reset of susceptibility of B. phoenicis to dicofol is very variable and the immigration of susceptible individuals from untreated areas or alternative hosts is very limited.

A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

Os agroecossistemas consistem em complexas relações tróficas entre plantas, herbívoros, e seus inimigos naturais. Sabe-se que a maioria das plantas é capaz de produzir compostos voláteis, utilizados como sinais químicos por diferentes grupos de insetos. Esses voláteis podem ser produzidos de forma constitutiva em plantas sadias, ou seja, sem indução. Por outro lado, a produção de voláteis induzidos se dá a partir do contato de secreções liberadas pelo fitófago com injurias ocasionadas pela alimentação ou oviposição no tecido vegetal. Para os fitófagos esses voláteis podem sinalizar a presença da planta hospedeira, bem como a presença de coespecíficos e do parceiro sexual. Já para os inimigos naturais, predadores e parasitóides, os voláteis induzidos podem sinalizar a presença do inseto fitófago (presa/ hospedeiro) na planta. Nesse contexto as respostas comportamentais de Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), aos voláteis de plantas de murta, Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae), infestadas ou não por coespecíficos, foram estudadas. Também foram investigadas as respostas dos psilídeos aos voláteis de plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck (Rutaceae) infectadas por bactérias causadoras do Huanglongbing ou HLB, uma das mais sérias doenças dos citros. Nos bioensaios visando compostos repelentes a D. citri, foram testados os voláteis de plantas de goiaba, Psidium guajava L.(Myrtaceae) e sua interferência na localização de plantas de Citrus limonia (L.) Osbeck (Rutaceae) pelos psilídeos. As respostas comportamentais foram mensuradas em olfatômetro Y e de quatro vias. Antes de estabelecer os bioensaios de olfatometria foram realizados estudos do comportamento sexual de D. citri. Os resultados obtidos evidenciaram que o início da atividade sexual de D. citri ocorreu entre o segundo e terceiro dia após a emergência, e que os psilídeos foram mais ativos durante a fotofase. Quanto às influências dos voláteis de plantas, machos e fêmeas de D. citri responderam diferentemente aos mesmos estímulos olfativos. Assim, os machos foram atraídos apenas aos odores associados às fêmeas. Já as fêmeas, foram atraídas aos odores das plantas, porém, evitando os odores associados aos machos, inclusive de plantas previamente infestadas por estes. Verificou-se também, que os adultos de D. citri distinguiram os voláteis de citros com HLB dos voláteis de plantas saudáveis. Sendo assim, ficou nítida a atratividade dos voláteis de plantas infectadas, tanto aos psilídeos machos quanto às fêmeas. Na busca por compostos repelentes, também foi possível demonstrar que os voláteis de P. guajava não somente dificultou à localização de plantas de C. limonia por D. citri, como também repeliram os psilídeos. As descobertas aqui apresentadas poderão auxiliar a elaboração de novas táticas para o manejo comportamental de D. citri. / The agro-ecosystems consist of complex trophic relationships between plants, herbivores and their natural enemies. It is known that the majority of plants can produce volatiles compounds used as chemical signals by different groups of insects. These compounds can be produced constitutively in healthy plants, i.e., without induction. In other hand, the production of induced volatiles occurs from the contact of secretions released by phytophagous with injuries caused by feeding or oviposition in plant tissue. For phytophagous, these volatile compounds may signal the presence of the host plant, as well as the presence of conspecifics and the sexual partner. Although, natural enemies, predators and parasitoids, the induced volatiles can signal the presence of phytophagous insects (prey / host) in the plant. In this context, the behavioral responses of Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) to plant volatiles of jasmine, Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae) infested or not by conspecifics, were studied. It was also investigated the responses of psyllids to volatiles of Citrus sinensis infected by bacteria that cause the huanglongbing or HLB, one of the most serious diseases of citrus. Given the studies that aim to identify repellent compounds to D. citri, it was tested plant volatiles of guava, Psidium guajava L. (Myrtaceae) and their impact on plant location of Citrus limonia (L.) Osbeck (Rutaceae) by psyllids. Behavioral responses were measured by Y-tube and four-way olfactometers. Before establishing the olfactometry assays, studies of D. citri sexual behavior were performed. The obtained results showed that the beginning of D. citri sexual activities occurred between the second and third days after emergence, and the psyllids were more active during the photophase. In regard to the effects of plant volatiles, males and females of D. citri differently responded to the same olfactory stimuli. Thus, males were attracted only to odors associated with females. Females were attracted to plant odors, although they avoided odors associated with males, including plants previously infested by them. It was also verified that D. citri adults distinguished volatiles citrus with HLB from volatiles released by healthy plants. Given that, it was clear that volatiles from infected plants were attractive to both males and females psyllids. In search of repellent compounds, also was possible demonstrated that P. guajava volatiles not only hindered the location of plants of C. limonia by D. citri, but also provided repellent effect to psyllids. The findings presented here may help the development of new tactics for the behavioral management of D. citri.