O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-05-10T20:18:37Z No. of bitstreams: 1 AdrianaLeal.pdf: 1605345 bytes, checksum: 700a558a6725b2db9159b45c403c2cbb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T20:18:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdrianaLeal.pdf: 1605345 bytes, checksum: 700a558a6725b2db9159b45c403c2cbb (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / Objectives: To evaluate the effect of airborne-particle abrasion with niobium phosphate bioglass (NbG) microparticles on the bond strength (µTBS) and longevity of an adhesive system to different dentin substrates. Methods and Materials: Caries-free molars were used in this study. The dentin surfaces were evaluated in three groups: (1) Control – Healthy Dentin; (2) Partial removal of carious tissue; (3) complete removal of carious tissue. Half the teeth in each group were submitted to airborne-particle abrasion with NbG microparticles (15s/1cm/5bar). After this, the adhesive Clearfil S3 was applied and composite buildups were constructed incrementally; and specimens were longitudinally sectioned to obtain bonded sticks (1.0 mm2) to be tested in tension (0.5 mm/min) immediately or after 6 months of storage in water. The fracture patterns were evaluated by stereomicroscope (40x) and then by scanning electron microscopy (SEM). The data were analyzed by the Kruskal-Wallis (post-hoc Dunn) and Mann-Whitney tests (α=0.05). Results: Healthy dentin showed the highest bond strength (µTBS). Airborne-particle abrasion with NbG increased the µTBS values in the complete caries removal group. The bond strength values in the 24-hr period were higher than those at 6 months. In the majority of the specimens the fracture mode was adhesive/ mixed. Conclusion: The authors concluded that airborne-particle abrasion on dentin with NbG particles increased the µTBS in the group in which carious dentin was completely removed. / Objetivo: Avaliar o efeito do jateamento de micropartículas de vidro niobofosfato (NbG) na resistência de união (RU) e na longevidade de um sistema adesivo em diferentes substratos dentinários. Dezoito molares extraídos livres de cárie foram usados. As superfícies de dentina foram avaliadas em três grupos: (1) Controle – Dentina Sadia; (2) Remoção parcial do tecido cariado; (3) Remoção total do tecido cariado. Metade dos dentes de cada grupo sofreu um jateamento com partículas de NbG (15s/1cm/5bar). Em seguida o adesivo Clearfil S3 Bond Plus foi aplicado e uma coroa de resina composta foi construída. Os dentes foram seccionados para obtenção dos espécimes (1,0 mm2) e submetidos ao teste de microtração (0,5 mm/min) imediatamente e após 6 meses de estocagem em água. Os padrões de fratura foram avaliados usando estereomicroscópio (40x) e levados ao microscópio eletrônico de varredura (SEM). Os dados foram analisados pelos testes Kruskal-Wallis (pos-hoc Dunn) e Mann-Whitney (α=0.05). Resultados: A dentina sadia apresentou os maiores valores de RU. O jateamento com NbG aumentou os valores de RU no grupo remoção total. Os valores de RU no período de 24h foram superiores ao de 6 meses. A maioria das fraturas dos espécimes foi adesiva/mista. Conclusão: Os autores concluíram que o jateamento à dentina com partículas NbG aumentou a RU no grupo onde a dentina cariada foi totalmente removida.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2016-09-14T14:47:04Z No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T13:55:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T13:56:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T13:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TesePRGA.pdf: 5283158 bytes, checksum: c57ad9ff767d07147f784d369b1084cf (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Millions of bone fractures occur annually worldwide and the consequent bone repair process is complex, involving many biological events until it reaches the restoration of the tissue integrity. During that process some problems can occur due to delays in the bone healing, which does not allow the proper joining of the tissue. Thus, it is necessary to search for new technologies that work in restoring the integrity of the bone tissue and that promote the osteoconduction and the osteoinduction. In this sense, the use of bioactive materials in the bone repair process is a promising alternative. Following this, two studies (I and II) were developed in order to investigate a new fibrous glassy scaffold, and these studies were based in three lines of research: (i) the characterization of the new fibrous glassy scaffold; (ii) the biocompatibility evaluation of this bioactive material; (iii) the analysis of the biological performance of this new scaffold in the bone repair. More specifically, in the study I the developed scaffolds were characterized in terms of porosity, mineralization and morphological features. Additionally, fibroblast and osteoblast cells were seeded in contact with extracts of the scaffolds to assess cell proliferation and genotoxicity after 24, 72 and 144 h. Finally, scaffolds were placed subcutaneously in rats for 15, 30 and 60 days. In regards to study II, the morphological structure of the scaffolds upon incubation in phosphate buffered saline (PBS) (via scanning electron microscope) was assessed after 1, 7 and 14 days and, also, the in vivo tissue response to the new biomaterial was evaluated using implantation in rat tibial defects. The histopathological, immunohistochemistry and biomechanical analyzes after 15, 30 and 60 days of implantation were performed to investigate the effects of the material on bone repair. The scaffolds presented interconnected porous structures (porosity of ~75%), and the precursor bioglass could mineralize a hydroxycarbonate apatite (HCA) layer in SBF after only 12 h. The PBS incubation indicated that the fibers of the glassy scaffold degraded over time. With regards to the biological investigations, the biomaterial elicited increased fibroblast and osteoblast cell proliferation, and no DNA damage was observed. The in vivo experiment showed degradation of the biomaterial over time, with soft tissue ingrowth into the degraded area and the presence of multi-nucleated giant cells around the implant. At day 60, the scaffolds were almost completely degraded, and an organized granulation tissue filled the area. Additionally, the histological analysis of the implants in the bone defects revealed a progressive degradation of the material with increasing implantation time and also its substitution by granulation tissue and woven bone. Histomorphometry showed a higher amount of newly formed bone area in the control group (CG) compared to the biomaterial group (BG) 15 days post-surgery. After 30 and 60 days, CG and BG showed a similar amount of newly formed bone. The novel biomaterial enhanced the expression of RUNX-2 and RANK-L, and also improved the mechanical properties of the tibial callus at day 15 after surgery. These results indicate that the new fibrous glassy scaffold is bioactive, non-cytotoxic, biocompatible and promising for using in bone tissue engineering. / Milhões de fraturas ósseas ocorrem anualmente no mundo todo e o processo de reparo é complexo, envolvendo muitos eventos biológicos até que se atinja a restauração da integridade do tecido. Problemas nessa regeneração podem ocorrer, levando a não união óssea. Assim, faz-se necessária a busca por novas tecnologias que atuem na restauração da integridade do tecido ósseo e promovam a osteocondução e a osteoindução. Para tanto, uma alternativa promissora é a utilização de materiais bioativos para o reparo ósseo. Seguindo essa linha, foram realizados dois estudos (I e II) acerca de um novo scaffold vítreo fibroso, sendo estes estudos baseados em três linhas de investigação: (i) caracterização do novo scaffold vítreo fibroso; (ii) avaliação da biocompatibilidade desse material bioativo e (iii) análise do desempenho biológico desse novo scaffold no reparo ósseo. Mais especificamente, no estudo I foi feita a caracterização dos scaffolds em termos de porosidade, mineralização e características morfológicas. Adicionalmente, fibroblastos e osteoblastos foram cultivados em contato com extratos dos scaffolds para avaliação da proliferação celular e genotoxicidade após 24, 72 e 144 h. Finalmente, nesse mesmo estudo, os scaffolds foram implantados subcutaneamente em ratos por 15, 30 e 60 dias. No que se refere ao estudo II, foram feitas avaliações da estrutura morfológica dos scaffolds (via microscopia eletrônica de varredura) imersos em tampão fosfato salino (PBS) após 1, 7 e 14 dias, além de investigações do efeito no reparo ósseo do novo scaffold utilizando implantação do mesmo em defeitos ósseos tibiais em ratos. Análises histopatológicas, imunohistoquímicas e biomecânicas foram realizadas 15, 30 e 60 dias após a implantação. Os scaffolds apresentaram estruturas altamente porosas (porosidade de ~75%) e interconectadas, e o biovidro precursor mineralizou uma camada de hidroxicarbonatoapatita (HCA) em SBF (simulated body fluid) após o curto período de 12 h. A incubação em PBS indicou que as fibras do scaffold apresentaram sinais de degradação com o passar do tempo. Sobre os testes biológicos, o novo biomaterial levou a um aumento da proliferação de fibroblastos e osteoblastos, e nenhum dano ao DNA foi observado. Os experimentos de implantação do material no subcutâneo indicaram degradação do biomaterial acompanhada do crescimento interno de tecido mole e presença de células gigantes multinucleadas ao redor do implante. Após 60 dias, os scaffolds estavam quase completamente absorvidos e um tecido de granulação organizado preenchia a área de implantação. Adicionalmente, as análises histológicas dos scaffolds em defeitos ósseos revelaram uma degradação progressiva do biomaterial e substituição do mesmo por tecido de granulação e tecido ósseo neoformado. A histomorfometria mostrou uma maior quantidade de osso neoformado no grupo controle (CG) comparado ao grupo biomaterial (BG) 15 dias após a cirurgia. No entanto, depois de 30 e 60 dias, CG e BG apresentaram quantidades similares de osso neoformado. Além disso, o novo biomaterial aumentou a expressão de RUNX-2 e RANK-L, e também melhorou as propriedades mecânicas do calo tibial 15 dias após a cirurgia. Os resultados indicam que o novo scaffold vítreo fibroso é bioativo, não-citotóxico, biocompatível e promissor para utilização na engenharia do reparo ósseo.

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

Dentre as opções de terapias dessensibilizantes, a proposta mais recente para o tratamento da Hipersensibilidade Dentinária é o uso do biovidro. Esse novo material apresenta a capacidade de promover a formação de hidroxiapatita na superfície da dentina, representando uma união química mais estável e duradoura sobre os túbulos dentinários. Este trabalho comparou o efeito de uma nova formulação de biovidro disperso em ácido fosfórico 30%, associado ao laser de Nd:YAG e ao laser de CO2 na obliteração de túbulos dentinários expostos. Foram obtidas 96 amostras de dentina humana que foram divididas em 6 grupos experimentais (n=16) e distribuídas como a seguir: G1 -­ controle negativo (nenhum tratamento adicional);? G2 -­ laser de Nd:YAG;? G3 -­ laser de CO2;? G4 -­ pasta de biovidro (biovidro + ácido fosfórico 30%);? G5 -­ pasta de biovidro + laser de Nd:YAG;? G6 -­ pasta de biovidro + laser de CO2. Os grupos G5 e G6 foram irradiados com laser de Nd:YAG e laser de CO2, respectivamente, após tratamento com a pasta de biovidro disperso em ácido fosfórico. Ao final do experimento, os grupos foram analisados qualitativamente por Espectroscopia de Infravermelho na Transformada de Fourier (FTIR), Difração de Raios X (DRX), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Dispersão de Energia de Raios X (EDS). As análises evidenciaram que a dipersão do biovidro em ácido fosfórico 30% é capaz de formar cristais de hidrogenofosfato de cálcio e, quando a pasta formulada é aplicada sobre a dentina, ocorrem reações químicas com a estrutura dental, formando cristais de monetita. Ao irradiar os cristais formados com laser de Nd:YAG e CO2, ocorreu a desidratação desses cristais, levando à formação de hidroxiapatita. As imagens de MEV demonstram a formação de precipitados cristalinos e amorfos de dimensões variadas sobre a superfície de dentina e na entrada dos túbulos dentinários em todos os grupos que receberam o tratamento com a formulação de biovidro. O laser de CO2 foi capaz de promover alterações na morfologia do material formado de maneira ainda mais evidente especialmente nas dimensões e disposição dos cristais de hidroxiapatita formado sobre a superfície. A análise de EDS evidenciou presença de silício, composto que não está presente naturalmente na estrutura dentária, mas somente na composição do biovidro. Dessa forma, pode-­se concluir que a associação do pó de biovidro com ácido fosfórico 30% permitiu a formação de uma camada de cristais na superfície e entrada dos túbulos dentinários, evidenciando que a pasta formulada viabiliza a aplicação e manutenção do biovidro sobre a superfície dentinária. Sua associação com o laser de Nd:YAG e CO2 parece melhorar a interação desses cristais com a dentina, formando cristais de hidroxiapatita. Nesse estudo, o laser de CO2 promoveu a melhor distribuição e conformação dos cristais sobre a dentina. / Among desensitizing therapies options, the most recent proposal for Dentin Hypersensitivity treatment is the use of bioglass. This new material presents the ability to promote the formation of hydroxyapatite on dentin surface, representing a more stable and lasting chemical bond on dentin tubules. This work compared the effect of a new formulation of bioglass dispersed in 30% phosphoric acid, associated with Nd: YAG laser and CO2 laser in the obliteration of exposed dentin tubules. 96 human dentin samples were obtained, divided into 6 experimental groups (n = 16) and distributed as follows: G1 -­ negative control (no additional treatment);? G2-­ Nd: YAG laser;? G3 - CO2 laser;? G4 -­ bioglass paste (bioglass + 30% phosphoric acid);? G5 -­ bioglass paste + Nd: YAG laser;? G6 -­ bioglass paste + CO2 laser. Groups G5 and G6 were irradiated with Nd:YAG laser and CO2 laser, respectively, after treatment with the slurry dispersed in phosphoric acid. At the end of the experiment, all groups were qualitatively analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-­ray Diffraction (XRD), Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-­ray Energy Dispersion Spectroscopy (EDS). The analysis showed that the dispersion of bioglass in 30% phosphoric acid forms calcium hydrogen phosphate crystals and when the formulated paste is applied on dentin surface, chemical reactions occur with the dental structure, forming monetite crystals. When irradiating these crystals with Nd: YAG and CO2 laser, dehydration of these crystals occurred leading to the formation of hydroxyapatite. MEV images demonstrate the formation of crystalline and amorphous precipitates of varying dimensions on the dentin surface and at the entrance of dentinal tubules in all groups receiving treatment with the bioglass formulation. The CO2 laser was able to promote changes in the morphology of the formed material even more evident especially in the dimension and arrangement of hydroxyapatite crystals formed on the surface. The analysis of EDS showed the presence of silicon, a compound that is not naturally present in the tooth structure, but only in the bioglass composition. Thus, it can be concluded that the association of bioglass powder with 30% phosphoric acid allowed the formation of a layer of crystals on the surface and its entrance of the dentinal tubules, evidencing that the formulated paste enables the application and maintenance of bioglass on dentin surface. Its association with the Nd:YAG and CO2 laser seems to improve the interaction of these crystals with dentin, forming hydroxyapatite crystals. In this study. CO2 laser promoted better crystals distribution and conformation on dentin surface.

Dentre as opções de terapias dessensibilizantes, a proposta mais recente para o tratamento da Hipersensibilidade Dentinária é o uso do biovidro. Esse novo material apresenta a capacidade de promover a formação de hidroxiapatita na superfície da dentina, representando uma união química mais estável e duradoura sobre os túbulos dentinários. Este trabalho comparou o efeito de uma nova formulação de biovidro disperso em ácido fosfórico 30%, associado ao laser de Nd:YAG e ao laser de CO2 na obliteração de túbulos dentinários expostos. Foram obtidas 96 amostras de dentina humana que foram divididas em 6 grupos experimentais (n=16) e distribuídas como a seguir: G1 -­ controle negativo (nenhum tratamento adicional);? G2 -­ laser de Nd:YAG;? G3 -­ laser de CO2;? G4 -­ pasta de biovidro (biovidro + ácido fosfórico 30%);? G5 -­ pasta de biovidro + laser de Nd:YAG;? G6 -­ pasta de biovidro + laser de CO2. Os grupos G5 e G6 foram irradiados com laser de Nd:YAG e laser de CO2, respectivamente, após tratamento com a pasta de biovidro disperso em ácido fosfórico. Ao final do experimento, os grupos foram analisados qualitativamente por Espectroscopia de Infravermelho na Transformada de Fourier (FTIR), Difração de Raios X (DRX), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Espectroscopia de Dispersão de Energia de Raios X (EDS). As análises evidenciaram que a dipersão do biovidro em ácido fosfórico 30% é capaz de formar cristais de hidrogenofosfato de cálcio e, quando a pasta formulada é aplicada sobre a dentina, ocorrem reações químicas com a estrutura dental, formando cristais de monetita. Ao irradiar os cristais formados com laser de Nd:YAG e CO2, ocorreu a desidratação desses cristais, levando à formação de hidroxiapatita. As imagens de MEV demonstram a formação de precipitados cristalinos e amorfos de dimensões variadas sobre a superfície de dentina e na entrada dos túbulos dentinários em todos os grupos que receberam o tratamento com a formulação de biovidro. O laser de CO2 foi capaz de promover alterações na morfologia do material formado de maneira ainda mais evidente especialmente nas dimensões e disposição dos cristais de hidroxiapatita formado sobre a superfície. A análise de EDS evidenciou presença de silício, composto que não está presente naturalmente na estrutura dentária, mas somente na composição do biovidro. Dessa forma, pode-­se concluir que a associação do pó de biovidro com ácido fosfórico 30% permitiu a formação de uma camada de cristais na superfície e entrada dos túbulos dentinários, evidenciando que a pasta formulada viabiliza a aplicação e manutenção do biovidro sobre a superfície dentinária. Sua associação com o laser de Nd:YAG e CO2 parece melhorar a interação desses cristais com a dentina, formando cristais de hidroxiapatita. Nesse estudo, o laser de CO2 promoveu a melhor distribuição e conformação dos cristais sobre a dentina. / Among desensitizing therapies options, the most recent proposal for Dentin Hypersensitivity treatment is the use of bioglass. This new material presents the ability to promote the formation of hydroxyapatite on dentin surface, representing a more stable and lasting chemical bond on dentin tubules. This work compared the effect of a new formulation of bioglass dispersed in 30% phosphoric acid, associated with Nd: YAG laser and CO2 laser in the obliteration of exposed dentin tubules. 96 human dentin samples were obtained, divided into 6 experimental groups (n = 16) and distributed as follows: G1 -­ negative control (no additional treatment);? G2-­ Nd: YAG laser;? G3 - CO2 laser;? G4 -­ bioglass paste (bioglass + 30% phosphoric acid);? G5 -­ bioglass paste + Nd: YAG laser;? G6 -­ bioglass paste + CO2 laser. Groups G5 and G6 were irradiated with Nd:YAG laser and CO2 laser, respectively, after treatment with the slurry dispersed in phosphoric acid. At the end of the experiment, all groups were qualitatively analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-­ray Diffraction (XRD), Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-­ray Energy Dispersion Spectroscopy (EDS). The analysis showed that the dispersion of bioglass in 30% phosphoric acid forms calcium hydrogen phosphate crystals and when the formulated paste is applied on dentin surface, chemical reactions occur with the dental structure, forming monetite crystals. When irradiating these crystals with Nd: YAG and CO2 laser, dehydration of these crystals occurred leading to the formation of hydroxyapatite. MEV images demonstrate the formation of crystalline and amorphous precipitates of varying dimensions on the dentin surface and at the entrance of dentinal tubules in all groups receiving treatment with the bioglass formulation. The CO2 laser was able to promote changes in the morphology of the formed material even more evident especially in the dimension and arrangement of hydroxyapatite crystals formed on the surface. The analysis of EDS showed the presence of silicon, a compound that is not naturally present in the tooth structure, but only in the bioglass composition. Thus, it can be concluded that the association of bioglass powder with 30% phosphoric acid allowed the formation of a layer of crystals on the surface and its entrance of the dentinal tubules, evidencing that the formulated paste enables the application and maintenance of bioglass on dentin surface. Its association with the Nd:YAG and CO2 laser seems to improve the interaction of these crystals with dentin, forming hydroxyapatite crystals. In this study. CO2 laser promoted better crystals distribution and conformation on dentin surface.