Includes bibliographical references. The aim of this work is the further characterisation of the citrus exocortis viroid (CEV) replication complex in a tomato host system. The study employed three approaches. i. To raise polyclonal antiserum against a putative catalytic component of the CEV replication complex, the second largest subunit of tomato RNA polymerase II--ii. To develop a cell-free system for CEV RNA synthesis--iii. To use the polyclonal antiserum to the second largest subunit of RNA polymerase II, and a commercially available monoclonal antibody to the largest subunit, for antibody inhibition and immunoprecipitation experiments using the cell-free system.

Includes bibliographical references. / vi, 86, [56] leaves, [10] leaves of plates : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / The aim of this work is the further characterisation of the citrus exocortis viroid (CEV) replication complex in a tomato host system. The study employed three approaches. i. To raise polyclonal antiserum against a putative catalytic component of the CEV replication complex, the second largest subunit of tomato RNA polymerase II--ii. To develop a cell-free system for CEV RNA synthesis--iii. To use the polyclonal antiserum to the second largest subunit of RNA polymerase II, and a commercially available monoclonal antibody to the largest subunit, for antibody inhibition and immunoprecipitation experiments using the cell-free system. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Plant Science, 1997

Includes bibliography / 1 v. (various pagings) : ill ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1988

Bibliography: leaves 78-90. / x, 90, [16] leaves, [14] leaves of plates : ill. (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Designed to localize viroids at the histological and subcellular level and to determine with which cellular compartments the different viroids are associated. The majority of the work, in both the viroid and the phytoplasma studies involved the development of different methods and techniques. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Plant Science, 1998

Los viroides, los agentes infecciosos más simples de la escala biológica, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario de aproximadamente 250-400 nucleótios (nt) que no codifica proteína alguna. A pesar de esta simplicidad estructural, los viroides son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y en muchos casos causar enfermedades en sus plantas huéspedes. Las infecciones producidas por viroides representativos generan la acumulación de pequeños RNAs viroidales (vd-sRNAs) de 21-24 nt con características similares a los pequeños RNA interferentes (siRNAs), la huella dactilar del silenciamiento mediado por RNA. La identificación de los vd-sRNAs implica que los viroides son diana de la primera barrera de silenciamiento mediado por RNA, formada por las RNasas ‘Dicer-like’ (DCLs). Para examinar si los vd-sRNAs se unen a las proteínas AGOs —el componente clave del complejo RISC (‘RNAinduced silencing complex’) que constituye la segunda barrera del silenciamiento mediado por RNA— hojas de Nicotiana benthamiana infectadas por el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) se agroinfiltraron con nueve de las diez proteínas AGOs de Arabidopsis thaliana. Inmunoprecipitaciones a partir de los halos agroinfiltrados y análisis ‘Western-’ y ‘Northern-blot’ han mostrado que todas las AGOs se expresaron y, a excepción de AGO6, AGO7 y AGO10, unieron vd-sRNAs: AGO1, AGO2 y AGO3 los de 21 y 22 nt, mientras que AGO4, AGO5 y AGO9 también mostraron afinidad por los de 24 nt. La secuenciación masiva mostró que las AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 agroexpresadas unen los PSTVd-sRNAs en función de su tamaño y nucleótido 5’-terminal, y que los perfiles de los correspondientes vd-sRNAs cargados en las AGOs adoptan una distribución específica a lo largo del genoma viroidal. La agroexpresión de AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 en hojas de N. benthamiana infectadas con PSTVd atenuó la acumulación de los RNAs genómico viroidales, indicando que éstos, o sus precursores, también son diana de RISC. En contraste con los ribovirus, la infección de PSTVd en N. benthamiana no afectó de forma significativa la regulación mediada por miR168 de la AGO1 endógena, que carga vd-sRNAs con especificidad similar a su homóloga de A. thaliana. Mientras se conoce bien la biogénesis de los RNA viroidales, su degradación está restringida a algunos datos que implican al silenciamiento mediado por RNA. En el curso de nuestros estudios sobre el PSTVd, hemos observado consistentemente un patrón de 6-7 RNAs subgénomicos (sgRNAs) de polaridad (+) que aparecen junto con los RNAs monoméricos circulares y lineares en berenjena, un huésped experimental de este viroide. Hibridaciones ‘Northern-blot’ con sondas de tamaño parcial y completo, mostraron que los sgRNAs (+) de PSTVd derivan de diferentes regiones del RNA genómico y que algunos son parcialmente solapantes. Parte de los sgRNAs (+) de PSTVd se observaron también en N. benthamiana y tomate, donde han pasado desapercibidos a causa de su menor acumulación. El análisis por extensión de cebador de sgRNAs (+) de PSTVd representativos excluye que sean productos de terminaciones prematuras de la transcripción, pues carecen del extremo 5’ común que cabría esperar si ésta empezara en una posición específica. Ulteriores análisis mediante 5’- y 3’-RACE indican que los sgRNAs (+) de PSTVd tienen extremos 5’-OH y 3’-P, que probablemente resultan de cortes endonucleolíticos de precursores más largos catalizados por RNasas típicas que generan este tipo de extremos. Análisis de sgRNA (-) de PSTVd, que también se acumulan en berenjena infectada, mostraron que presentan características estructurales muy similares a los sgRNA (+). Nuestros resultados proporcionan una nueva visión de cómo ocurre la degradación in vivo de los RNAs viroidales, posiblemente durante su replicación, y sugieren que síntesis y degradación de las cadenas de PSTVd están conectadas, como se ha observado en los mRNAs. / Minoia, S. (2015). Degradación in vivo de un viroide de replicación nuclear: rutas catalizadas por proteínas Argonauta cargadas con pequeños RNAs viroidales y por otras ribonucleasas que generan RNAs subgenómicos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48553 / TESIS

Bibliography : leaves 92-99. / v, 99, [37] leaves, [14] leaves of plates : ill. ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Biochemistry, 1992

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-04Bitstream added on 2014-06-13T18:45:43Z : No. of bitstreams: 1 silva_sr_dr_jabo.pdf: 2004552 bytes, checksum: 9add4746708701cae05ee9a28f001bfe (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estacao Experimental de Bebedouro / Fundecitrus / Objetivando caracterizar sanitariamente a lima ácida ‘Tahiti’ clone Quebra-galho [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] e selecionar plantas candidatas a matrizes, 80 plantas foram avaliadas quanto aos sintomas de tristeza, exocorte, sorose e pelo estado nutricional, desenvolvimento, produção e qualidade de frutos e por testes biológicos para as viroses citadas e xiloporose. Para viróides, empregou-se também RT-PCR. Todos os testes biológicos foram positivos para tristeza e negativos para xiloporose. Para exocorte, 82,5% dos testes foram positivos. No caso da sorose, 11,2% dos testes foram positivos apesar das plantas de campo não apresentarem sintomas. Quanto à tristeza, a reação em ‘Galego’ foi fraca (58,8%), média (40%) e forte (1,2%), sem caneluras nos ramos das plantas no campo. Os viróides Hop stunt viroid (HSVd), Citrus dwarfing viroid (CVd-III) e o Citrus exocortis viroid (CEVd) foram encontrados em 31,3%, 82,5% e 100,0% das plantas, respectivamente. Todas as plantas estudadas estavam infectadas com o CTV e com o CEVd, que foi encontrado isoladamente ou em combinação com outros viróides. Diferenças observadas na expressão dos sintomas de exocorte e tristeza na copa e no porta-enxerto podem ser atribuídas a interferências entre os viróides e a seleção pela multiplicação de gemas de árvores contaminadas por variantes pouco virulentas. O estado nutricional, o desenvolvimento, a produção e a qualidade dos frutos não apresentaram associação com o tipo de contaminação por viróides, o que também ocorreu com as plantas selecionadas como candidatas a matrizes em função da produção e qualidade física dos frutos. / Aiming at to characterize sanitarily the acid lime ‘Tahiti’ clone “Quebragalho” [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] and select applicant mother plants, 80 plants were evaluated about the symptoms of tristeza disease, exocortis, psorosis and nutritional state, development, production and quality of the fruits, and by biological tests for the cited viruses and xyloporosis. For the viroids, was used RT-PCR too. All the biological tests were positive for tristeza disease and negative for xyloporosis. For exocortis, 82.5% of the tests were positive. In the case of the psorosis, 11.2% of the tests were positive although the plants in the field do not present symptoms. To the tristeza disease, the reaction in 'Galego' was of weak (58.8%), middle (40.0%) and strong (1.2%), without pittings in the branches of the plants in the field. The viroids Hop stunt viroid (HSVd), Citrus dwarfing viroid (CVd-III) and the Citrus exocortis viroid (CEVd) were found, respectively, in 31.3%, 82.5% and 100.0% of the plants. All of the plants in study were infected with the CTV and the CEVd, that was found isolately or in combinations with other viroids. Differences observed in the expression of the exocortis symptoms and tristeza disease in the cup and in the rootstock can be attributed to interferences between the viroids and the selection by the multiplication through cuttings of infected trees by strains few virulent. The nutritional state, development, production and quality of the fruits, did not presented association with the type of contamination by viroids, what also occurred with the applicant mother plants selected in function of the production and physical quality of the fruits.

Resumo: Objetivando caracterizar sanitariamente a lima ácida 'Tahiti' clone Quebra-galho [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] e selecionar plantas candidatas a matrizes, 80 plantas foram avaliadas quanto aos sintomas de tristeza, exocorte, sorose e pelo estado nutricional, desenvolvimento, produção e qualidade de frutos e por testes biológicos para as viroses citadas e xiloporose. Para viróides, empregou-se também RT-PCR. Todos os testes biológicos foram positivos para tristeza e negativos para xiloporose. Para exocorte, 82,5% dos testes foram positivos. No caso da sorose, 11,2% dos testes foram positivos apesar das plantas de campo não apresentarem sintomas. Quanto à tristeza, a reação em 'Galego' foi fraca (58,8%), média (40%) e forte (1,2%), sem caneluras nos ramos das plantas no campo. Os viróides Hop stunt viroid (HSVd), Citrus dwarfing viroid (CVd-III) e o Citrus exocortis viroid (CEVd) foram encontrados em 31,3%, 82,5% e 100,0% das plantas, respectivamente. Todas as plantas estudadas estavam infectadas com o CTV e com o CEVd, que foi encontrado isoladamente ou em combinação com outros viróides. Diferenças observadas na expressão dos sintomas de exocorte e tristeza na copa e no porta-enxerto podem ser atribuídas a interferências entre os viróides e a seleção pela multiplicação de gemas de árvores contaminadas por variantes pouco virulentas. O estado nutricional, o desenvolvimento, a produção e a qualidade dos frutos não apresentaram associação com o tipo de contaminação por viróides, o que também ocorreu com as plantas selecionadas como candidatas a matrizes em função da produção e qualidade física dos frutos. / Abstract: Aiming at to characterize sanitarily the acid lime 'Tahiti' clone "Quebragalho" [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] and select applicant mother plants, 80 plants were evaluated about the symptoms of tristeza disease, exocortis, psorosis and nutritional state, development, production and quality of the fruits, and by biological tests for the cited viruses and xyloporosis. For the viroids, was used RT-PCR too. All the biological tests were positive for tristeza disease and negative for xyloporosis. For exocortis, 82.5% of the tests were positive. In the case of the psorosis, 11.2% of the tests were positive although the plants in the field do not present symptoms. To the tristeza disease, the reaction in 'Galego' was of weak (58.8%), middle (40.0%) and strong (1.2%), without pittings in the branches of the plants in the field. The viroids Hop stunt viroid (HSVd), Citrus dwarfing viroid (CVd-III) and the Citrus exocortis viroid (CEVd) were found, respectively, in 31.3%, 82.5% and 100.0% of the plants. All of the plants in study were infected with the CTV and the CEVd, that was found isolately or in combinations with other viroids. Differences observed in the expression of the exocortis symptoms and tristeza disease in the cup and in the rootstock can be attributed to interferences between the viroids and the selection by the multiplication through cuttings of infected trees by strains few virulent. The nutritional state, development, production and quality of the fruits, did not presented association with the type of contamination by viroids, what also occurred with the applicant mother plants selected in function of the production and physical quality of the fruits. / Orientador: Antonio Baldo Geraldo Martins / Coorientador: Eduardo Sanches Stuchi / Banca: José Orlando de Figueiredo / Banca: Maria Luísa Penteado Natividade Targon / Banca: José Carlos Barbosa / Banca: Antonio de Goes / Doutor

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ e V. labrusca ‘Niagara Rosada’, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and V. labrusca ‘Niagara Rosada’, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ e V. labrusca ‘Niagara Rosada’, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’ and V. labrusca ‘Niagara Rosada’, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.