Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os coliformes termotolerantes tÃm sido descritos como um dos melhores indicadores de contaminaÃÃo de ambientes aquÃticos por resÃduos humanos, sendo amplamente utilizado como parÃmetro para classificaÃÃo de Ãreas onde se cultiva ou extrai ostras. Dentre os membros deste grupo, a Escherichia coli se destaca como uma espÃcie potencialmente patogÃnica, representando risco para a saÃde pÃblica quando associada ao consumo de moluscos bivalves crus ou parcialmente cozidos. Entretanto, pouco à sabido sobre a colonizaÃÃo nos tecidos desses moluscos e/ou distribuiÃÃo dessas bactÃrias entÃricas. O presente estudo teve como objetivos:(i) quantificar coliformes termotolerantes do fluido corporal e dos sÃtios anatÃmicos, separadamente;(ii) isolar e identificar E. coli de amostras de ostras comercializadas in natura na Praia do Futuro, Fortaleza-CearÃ;(iii) avaliar o perfil de virulÃncia e resistÃncia a antimicrobianos dos isolados de E. coli. Foram realizadas dez coletas no perÃodo de fevereiro a abril de 2012, sendo analisadas dez ostras por coleta, divididas em um fluido corporal (lÃquido intervalvar) e dois sÃtios anatÃmicos (mÃsculo e trato gastrointestinal). Os resultados apontaram trÃs amostras com contagens de coliformes acima do limite estabelecido pela legislaÃÃo n 12 de 2001 da ANVISA, tendo o lÃquido intervalvar apresentado o NMP mais elevado em seis amostras. Das 137 cepas de E. coli isoladas, verificou-se maior incidÃncia de resistÃncia à tetraciclina e oxitetraciclina (19%), com variaÃÃo do Ãndice de MÃltipla ResistÃncia (MAR) entre 0,250 e 0,625. Observou-se ainda a presenÃa de cepas produtoras de enzimas beta-lactamases de espectro estendido, porÃm nenhuma das cepas testadas apresentou produÃÃo de biofilme. A elevada frequÃncia de resistÃncia à oxitetraciclina sugere uma pressÃo seletiva sobre a microbiota do ecossistema manguezal, que pode ser afetada diretamente pela atividade de carcinicultura, praticada na regiÃo prÃxima à cidade de ParnaÃba, localizada no Estado do PiauÃ, de onde as ostras sÃo extraÃdas. AlÃm disso, a presenÃa de mÃltipla resistÃncia aos antimicrobianos observada pode ser indicativa de risco para os consumidores de ostra in natura. / Fecal coliforms have been described as one of the best indicators of pollution in the aquatic environments by human wastes, and it is widely used as a parameter for classifying areas where oysters are farmed or extracted. Among Enterobacteriaceae members, E. coli stands out as potential pathogenic specie, representing risk for public healthy when associated with consumption of raw or undercooked bivalves. However, little is known about this colonization in the bivalve tissues and/or distribution of these enteric bacteria. The objective of the present study was to: (i) quantify fecal coliforms from body fluid and anatomical sites, separately; (ii) isolate and identify E. coli in oysters commercialized in natura in Praia do Futuro beach, Fortaleza-CearÃ; (iii) evaluate the virulence profile and resistance to antimicrobial agents of E. coli isolates. The study covered ten samples, from February to April 2012, by analyzing twelve oysters for sample, divided into a body fluid (intervalvar liquor) and two anatomical sites (mantle and gastrointestinal tract). Fecal coliforms concentration was higher than allowed by legislation n 12/2001 of ANVISA in three samples, and intervalvar liquor presented higher MPN in six samples. Out of 137 E. coli strains isolated, 19% was resistant to both tetracycline and oxytetracycline, and MAR ranged from 0,250 to 0,625. It is further noted producing expended spectrum beta lactamases strains, however none showed biofilm production. The major frequency resistance to oxytetracycline suggests a selective pressure to mangrove ecosystem microbiota that could be directly affected by farming shrimp activity, practiced in a region next to ParnaÃba city, located in Piauà state, where oysters are extracted. In addition, the presence of multiple resistance can be a risk for in natura oyster consumers.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) à um patÃtipo de E. coli que tem sido cada vez mais identificado como agente etiolÃgico das doenÃas diarrÃicas. Esse trabalho teve como objetivos determinar a prevalÃncia de EAEC e investigar a importÃncia de alguns genes associados à virulÃncia no grau de severidade das doenÃas diarrÃicas causadas pelo microorganismo, alÃm de avaliar o impacto dessas infecÃÃes na inflamaÃÃo intestinal e no estado nutricional de crianÃas carentes de Fortaleza, CearÃ. CrianÃas na faixa etÃria entre 2 e 36 meses, com histÃrico ou nÃo de diarrÃia nos Ãltimos 14 dias, tiveram suas medidas antropomÃtricas avaliadas e suas amostras fecais coletadas. O diagnÃstico de EAEC foi realizado por reaÃÃo de polimerase em cadeia (PCR) dos genes aaiC (cromossomal) e aatA (plasmidial). Amostras positivas foram pesquisadas quanto à presenÃa dos genes de virulÃncia aggR (regulador transcricional), aap (dispersina), pic (enterotoxina), pet (enterotoxina) e astA (enterotoxina). A sequÃncia nucleotÃdica do gene aggR foi analisada atravÃs de seqÃenciamento. AlÃquotas fecais foram submetidas à quantificaÃÃo de lactoferrina (LFF) e citocinas (IL-4, IL-10, TNF-α e IFN-γ) atravÃs de reaÃÃo imunoenzimÃtica (ELISA). Esse estudo analisou 83 crianÃas com diarrÃia (casos) e 83 crianÃas sem diarrÃia (controles). EAEC foi encontrada na mesma proporÃÃo entre ambos os grupos (41,0%). CrianÃas com diarrÃia apresentaram reduÃÃo significativa na espessura da prega cutÃnea, Ãndice de massa corporal e escores-z peso-por-idade (WAZ) e peso-por-altura (WHZ), mas a presenÃa da bactÃria nÃo foi associada com alteraÃÃes nos Ãndices antropomÃtricos analisados. Entre as amostras positivas para EAEC, nÃo houve diferenÃa quanto à presenÃa isolada dos fatores de virulÃncia pesquisados nas crianÃas que desenvolveram ou nÃo diarrÃia. Avaliando as freqÃÃncias desses genes em combinaÃÃo, cepas de EAEC expressando os genes aggR, aap, pic, pet e astA foram isoladas em freqÃÃncia superior significativa de crianÃas doentes quando comparadas com cepas de EAEC expressando somente aggR, aap, pic e astA (excluindo o gene pet). A anÃlise da seqÃÃncia codificadora do gene aggR apresentou 27 polimorfismos em um Ãnico nucleotÃdeo (SNPs), distribuÃdos entre cinco amostras caso e trÃs controles. Mais de 80,0% das crianÃas estudadas apresentaram inflamaÃÃo intestinal caracterizada por elevados nÃveis de LFF, independente da presenÃa de diarrÃia e EAEC. Todas as crianÃas com diarrÃia associada com EAEC apresentaram altas concentraÃÃes de LFF. NÃveis basais de citocinas fecais foram observados entre crianÃas de ambos os grupos. A variabilidade na presenÃa dos fatores de virulÃncia pesquisados ratifica a heterogeneidade das cepas de EAEC. A combinaÃÃo de genes codificadores de fatores de virulÃncia mostrou que a presenÃa do pet està associada com a doenÃa causada por EAEC. A infecÃÃo pela bactÃria nÃo causou impacto significativo nos Ãndices antropomÃtricos analisados. As elevadas concentraÃÃes observadas de LFF sugerem a existÃncia de fatores adicionais desencadeadores do processo inflamatÃrio. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is a pathotype of diarrheagenic E. coli, which has increasingly been identified as an etiological agent of diarrheal disease. This purpose of this study is to determine the prevalence of EAEC and examine the importance of some virulence-related genes in the severity of the diarrheal disease caused by this microorganism, and further evaluate the impact of these infections on intestinal inflammation and the nutritional status of poor children from Fortaleza, Ceara. Children aged 2 to 36 months, with and without an occurrence of diarrhea in the previous 14 days, had their anthropometric data evaluated and their stools collected. Diagnosis of EAEC was done by polymerase chain reaction (PCR) of the aaiC (chromosomal) and aatA (plasmidial) genes. Positive samples were further analyzed for the presence of the virulence genes aggR (transcription regulator), aap (dispersin), pic (enterotoxin), pet (enterotoxin) and astA (enterotoxin). The nucleotide sequence of aggR gene was also analyzed by sequencing. Aliquots of stool samples were quantified for lactoferrin (LFF) and cytokines (IL-4, IL-10, TNF-α e IFN-γ) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This study analyzed 83 children with diarrhea (cases) and 83 children without diarrhea (controls). EAEC was found in the same proportion in both groups (41.0%). Children with diarrhea presented with significantly reduced skin thickness, body mass index and weight-for-age (WAZ) and weight-for-height (WHZ) z-scores. However, the presence of the bacteria was not associated with changes in the analyzed anthropometric measures. Among the positive samples for EAEC, there was no difference in the presence of the isolated virulence genes in the children with or without diarrhea. Observing the frequencies of these genes in combination, EAEC strains carrying the aggR, aap, pic, pet and astA genes together were isolated in significantly higher frequencies from sick children when compared to EAEC strains expressing only aggR, aap, pic, and astA (excluding pet). Nucleotide sequence analysis of the aggR gene presented 27 polymorphisms of a single nucleotide (SNPs), distributed among five case samples and three control samples. More than 80.0% of studied children had intestinal inflammation characterized by elevated levels of LFF, regardless of the presence of illness and EAEC. All children with diarrhea associated with EAEC presented with high concentrations of LFF. Basal levels of fecal cytokines were observed among children from both groups. Variability in the presence of the evaluated virulence factors confirms the heterogeneity of EAEC strains. The combination of the virulence related genes expressed showed that pet has an association with illness caused by EAEC. The infection by this bacterium did not cause significant impact on the anthropometric index analyzed. The high concentrations of LFF observed suggest that there may be additional factors triggering the inflammatory process.

Universidade Federal do Cearà / A busca por novas bactÃrias com propriedades funcionais tem sido foco de intensa pesquisa nas Ãltimas dÃcadas. Diversas espÃcies do gÃnero Lactobacillus jà sÃo conhecidas como probiÃticas e sÃo adicionadas em alimentos. Para uma cultura bactÃriana ser selecionada como probiÃtica à preciso apresentar determinadas caracterÃsticas, como a capacidade de sobreviver Ãs condiÃÃes gastrointestinais e ser livre de patogenicidade. O objetivo desse estudo foi isolar, selecionar e identificar cepas de lactobacilos a partir de leite e queijo de cabra, e avaliar seu potencial probiÃtico e sua inocuidade atravÃs da identificaÃÃo de genes relacionados Ãs caracterÃsticas benÃficas e de riscos para o consumo humano, verificando sua expressÃo in vitro. Foram identificados vinte e trÃs cepas diferentes de Lactobacillus plantarum e adicionadas ao estudo outras quatro cepas de L. plantarum e trÃs Lactobacillus mucosae previamente isoladas. As vinte e nove cepas foram avaliadas quanto à presenÃa de genes relacionados a propriedades probiÃticas como o gene bsh, codificante para a enzima hidrolase de sais biliares, msa, relacionado à capacidade de adesÃo ao epitÃlio intestinal induzido por manose e outros trÃs genes, map, mub e ef-tu associados Ãs propriedades de adesÃo ao muco. Os genes bsh e msa tiveram sua expressÃo avaliada in vitro, por meio de testes bioquÃmicos de desconjugaÃÃo de sais biliares e agregaÃÃo de leveduras, respectivamente. Os resultados mostraram que 80% das cepas testadas foram capazes de sobreviver em presenÃa dos sais biliares e 76% foram capazes de desconjugar pelo menos um dos quatro sais testados. Quanto à capacidade de adesÃo, quatro cepas apresentaram resultado positivo, sendo para trÃs delas confirmada interaÃÃo via manose. Ainda com relaÃÃo Ãs propriedades de adesÃo, apenas duas cepas apresentaram um alto valor de hidrofobicidade da superfÃcie celular, propriedade que tem sido associada indiretamente a essa capacidade, e 90% das cepas estudadas mostraram um perfil genÃtico favorÃvel à ligaÃÃo à mucosa intestinal, apresentando trÃs dos quatro genes de adesÃo avaliados. A inocuidade desses microrganismos tambÃm foi avaliada quanto à presenÃa e expressÃo de doze genes relacionados a fatores de virulÃncia, incluindo a resistÃncia a antimicrobianos e produÃÃo de aminas biogÃnicas. A expressÃo de genes associados à produÃÃo de gelatinase (gelE), e das aminas tirosina (tdc) e histamina (hdc1 e hdc2), bem como à resistÃncia à vancomicina (vanA e vanB) foi investigada por meio de testes bioquÃmicos. Apesar de algumas cepas amplificarem o gene gelE, este nÃo apresentou expressÃo in vitro. Foi constatada in vitro resistÃncia à vancomicina, muito comum entre lactobacilos, sendo observado tambÃm em cepas que nÃo amplificaram os genes vanA e vanB. Com relaÃÃo à produÃÃo de aminas biogÃnicas, apenas o gene tdc para tirosina foi detectado nas cepas, sendo um dos genes com maior frequÃncia de amplificaÃÃo entre as cepas. No entanto, apenas uma cepa que apresentou o gene teve sua expressÃo confirmada no teste in vitro utilizando meio de descarboxilaÃÃo, enquanto que algumas cepas que nÃo amplificaram o gene obtiveram resultado positivo in vitro. Quatorze isolados nÃo amplificaram genes relacionados à virulÃncia. Destas, apenas a cepa Lactobacillus plantarum Q24 nÃo apresentou expressÃo in vitro relacionada a fator de virulÃncia, alÃm de amplificar trÃs dos genes relacionados à adesÃo ao muco, e de ter sobrevivido e desconjugado dois dos sais biliares avaliados, mostrando ser a mais promissora para se prosseguir com os estudos de investigaÃÃo do potencial probiÃtico. / The search for new bacteria with functional properties has been the focus of intense research in recent decades. Several species of Lactobacillus gender are known as probiotic and are added in foods. To be selected as a probiotic bacteria, it need to present certain characteristics, as capacity to survive the gastrointestinal conditions and be free of pathogenic. The aim of this study was to isolate, identify and select strains of Lactobacillus from goat milk and cheese, and evaluate its potential probiotic and its safety through the identification of related genes with beneficial characteristics and risks for human consumption, checking its in vitro expression. Were identified twenty-three different strains of Lactobacillus plantarum and added to study other four strains of L. plantarum and three Lactobacillus mucosae. The thirty strains were evaluated for the presence of genes related to probiotic properties as bsh gene, coding for the enzyme bile salt hydrolase, the msa, related to capacity of adhesion to intestinal epithelium induced by mannose, three other genes map, mub and ef-tu associated the mucus adhesion properties. The bsh and msa gene had their expression evaluated in vitro, by means of biochemical tests deconjugation of bile salts and addition of yeast, respectively. The results show that 80% of the strains were able to survive in the presence of bile salts and 76% were able to deconjugate at least one of the four salts tested. As for the adhesion capacity, four strains show a positive result, and three of them confirmed interactinon via mannose. Still evaluating adhesion properties, only two strains have a high hydrophobicity value in the cell suface, property that has been linked indirectly to the ability to adhere to the intestinal mucosa, and 90% from these strains have a genetic profile favorable for binding to the intestinal mucosa, with three of the four genes adherence evaluated. The safety of the microorganisms was also evaluated for the presence and expression of the thirteen genes related to virulence factors, including resistance to antibiotics and production of biogenic amines. The expression of genes associated with the production of gelatinase (gelE), and tyrosine amines (TDC) and histamine (hdc1 and hdc2) and resistance to vancomycin (vanA and vanB) was investigated by means of biochemical tests. Although some strains amplify the gelE gene it did not show in vitro expression. Was verified in vitro resistance to vancomycin, very common among lactobacilli, also observed in strains that did not amplify the genes vanA and vanB. With respect to production of biogenic amines, only the tdc gene for tyrosine was detected in strains, one of the genes with the greatest percentage of amplification. However, only one strain that presented the gene had its expression confirmed in vitro test using descarboxilaÃÃo medium, while some strains that do not amplify the gene had positive results in vitro. Fourteen isolated did not amplified genes related to virulence. Of these, only the Lactobacillus plantarum Q24 strain showed no expression in vitro related to virulence factor, in addition to amplify three of the genes related to adherence to mucus, and have survived and disconjugate two of bile salts evaluated, showing be the most promising to pursue studies potential of probiotic research.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Muitas pesquisas tÃm associado contaminaÃÃo aquÃtica ambiental com infecÃÃes de Vibrio em humanos, sugerindo que a importÃncia do monitoramento sistemÃtico das cepas ambientais se faz necessÃrio para definir seu possÃvel potencial patogÃnico e sua significÃncia clÃnica. O objetivo dessa pesquisa foi estudar a diversidade do gÃnero Vibrio isolado de quatro regiÃes estuarinas no Estado do CearÃ, (Pacoti, ChorÃ, Pirangi e Jaguaribe). As coletas realizadas resultaram num total de 32 amostras de Ãgua e 32 de sedimento, durante os meses de janeiro a abril de 2009. Foram catalogadas 19 espÃcies de bactÃrias pertencentes ao gÃnero Vibrio, das quais Vibrio parahaemolyticus e Vibrio alginolyticus foram as mais abundantes nos quatro estuÃrios: V. parahaemolyticus no Rio Chorà e V. alginolyticus no Rio Pacoti. As cepas identificadas foram submetidas a testes de susceptibilidade a quinze antimicrobianos. Todas as cepas analisadas (197) apresentaram susceptibilidade a sulfazotrim, ciprofloxacin, Ãcido nalidÃxico e cloranfenicol, sendo que cento e sessenta e trÃs (82%) apresentaram resistÃncia a penicilina G, cento e oito (54%) a ampicilina, quinze (7%) a cefalotina, trÃs (1%) a aztreonam, uma (0,5%) a gentamicina, a cefotaxima e a ceftriaxona. Cinquenta e uma cepas (25%) apresentaram comportamento intermediÃrio frente à cefalotina, vinte e oito cepas (14%) a ampicilina, dez (5%) a aztreonam, oito (4%) a tetracilina, duas (1%) a oxitetraciclina e uma (0,5%) a florfenicol, a cefotaxima, a ceftriaxona, a estreptomicina e a gentamicina. Foram escolhidas cinco espÃcies patÃgenas ao homem para verificaÃÃo de seus fatores de patogenicidade. As cepas identificadas como V. parahaemolyticus (64) e V. cholerae (9) foram analisadas atravÃs de tÃcnicas de biologia molecular, usando genes que confirmam as espÃcies e genes que indicam virulÃncia. Das 64 amostras de V. parahaemolyticus analisadas, 63 foram positivas para o gene tl, especÃfico para espÃcie, 57 para o gene tdh e 20 para o trh, genes que indicam patogenicidade. Das nove cepas de V. cholerae, cinco foram positivas para o gene ompW, gene especÃfico para espÃcie, porÃm, nenhuma amostra apresentou os genes de virulÃncia ctxA, zot, tcp e rfbO1. Com isso conclui-se que os estuÃrios dos rios analisados apresentam uma elevada abundÃncia de espÃcies, tendo V. parahaemolyticus e V. alginolyticus como as mais abundantes. O antibiograma das cepas isoladas mostrou uma elevada resistÃncia à penicilina e a ampicilina. Foram encontradas elevada positividade para a presenÃa dos fatores de virulÃncia nas cepas pertencentes Ãs espÃcies de Vibrio patÃgenas a humanos. As cepas de V. parahaemolyticus apresentaram genes de virulÃncia indicando que as cepas podem acarretar danos à saÃde pÃblica. A presenÃa do V. cholerae foi confirmada nas Ãguas e sedimento dos estuÃrios / The frequent association of environmental aquatic contamination with vibriosis in humans suggests the need for systematic monitoring and study of environmental vibrio strains and their pathogenic potential and clinical significance. The objective of this study was to evaluate the diversity of vibrio species in four estuaries (Pacoti, ChorÃ, Pirangi and Jaguaribe) in CearÃ, Northeastern Brazil. Nineteen vibrio species were identified in 32 water samples and 32 sediment samples collected between January and April 2009. Overall, V. parahaemolyticus and V. alginolyticus were the most abundant (the former in ChorÃ, the latter in Pacoti). The isolated strains were submitted to antibiogram testing with 15 antibiotics. All strains (n=197) were susceptible to sulfametoxazol-trimetoprim, ciprofloxacin, nalidixic acid and chloramphenicol. Resistance was observed to penicillin G (n=163; 82%), ampicillin (n=108; 54%), cephalothin (n=15; 7%), aztreonam (n=3; 1%), gentamicin, cefotaxime, ceftriaxone (1 each; 0.5%). Partial resistance was observed to cefalotin (n=52; 25%), ampicillin (n=28; 14%), aztreonam (n=10; 5%), tetracycline (n=8; 4%), oxytetracycline (n=2; 1%), and florfenicol, cefotaxime, ceftriaxone, streptomycin and gentamicin (1 each; 0.5%). Five species known to be pathogenic to humans were chosen for analysis of factors of pathogenicity. Strains belonging to the species V. parahaemolyticus (n=64) and V. cholerae (n=9) were submitted to molecular analysis using genes to confirm the species and indicate virulence. Sixty-three strains of V. parahaemolyticus were positive for species-specific tl, 57 were positive for tdh and 20 for trh. Five strains of V. cholerae were positive for species-specific ompW, but no strains presented the genes ctxA, zot, tcp or rfbO1. In conclusion, the estuaries surveyed presented a great diversity of vibrio species, the most abundant of which were V. parahaemolyticus and V. alginolyticus. Resistance to penicillin and ampicillin was elevated and positivity for virulence factors was considerable among strains of species pathogenic to humans. V. parahaemolyticus strains presented virulence genes indicating risk to public health. V. cholerae was identified in samples of both water and sediment