A pouca solubilidade do ferro impõe desafios para sua captação por bactérias e outros organismos. Uma solução eficaz para este problema é a utilização de sideróforos próprios ou exógenos para solubilizar o ferro do ambiente ou de proteínas do hospedeiro e transportá-lo para o interior da célula bacteriana. Neste trabalho, identificamos vias de produção e captação de ferro por sideróforos e definimos o papel destas moléculas na virulência da bactéria Chromobacterium violaceum, um abundante componente da microbiota de solo e água que ocasionalmente causa graves infecções em humanos. Por meio de análises in silico, vários genes relacionados com a síntese e captação de sideróforos foram encontrados no genoma de C. violaceum ATCC 12472 em dois clusters de síntese de metabólitos secundários. Obtenção de linhagens mutantes de vários destes genes e caracterização destas linhagens por ensaios de CAS, curvas de crescimento em carência de ferro e ensaios de estimulação de crescimento revelaram que C. violaceum produz sideróforos endógenos. Essa produção mostrou-se dependente do percursor comum 2,3-DHBA produzido pelas enzimas codificadas pelos genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) e de duas enzimas sintetases de peptídeo não ribossomais (NRPSs CV_1486 e CV_2233), as quais provavelmente montam dois sideróforos distintos do tipo catecolato. Cada sideróforo foi captado por um receptor dependente de TonB (RDTB) específico, com o sideróforo produzido via NRPS CV_1486 sendo captado pelo RDTB CV_1491, e o sideróforo produzido via NRPS CV_2233 sendo captado pelo RDTB CV_2230, uma vez que mutantes sem esses RDTBs acumularam sideróforos no meio externo no ensaio de CAS. Além de seus sideróforos endógenos, C. violaceum foi capaz de utilizar xenosideróforos do tipo catecolato de outras bactérias via o RDTB CV_1491. Ensaios de infecção em camundongos revelaram que tanto a síntese quanto a captação de seus sideróforos endógenos são importantes para a virulência de C. violaceum, pois as linhagens mutantes que não produzem sideróforos (?CV_1485-84- 83-82, ?CV_1485-84-83-82/1486::pNPT e ?CV_1486/2233::pNPT) ou são incapazes8 de captá-los (?CV_2230/1491) tiveram sua virulência diminuída em relação a linhagem selvagem. Os dados mostrando que o mutante que não capta ambos sideróforos de C. violaceum teve atenuação mais acentuada da virulência e induziu menor produção de NET em ensaios com neutrófilos in vitro sugerem que o acúmulo de sideróforos na infecção pode ser benéfico para o hospedeiro. Por fim, demonstramos a possibilidade de gerar mutantes de transposon em C. violaceum e ao realizarmos varredura de uma coleção destes mutantes identificamos ao menos um potencial novo fator de transcrição envolvido na regulação da síntese de sideróforo nesta bactéria. Portanto, os dados obtidos neste trabalho revelaram que C. violaceum utiliza-se de diferentes sideróforos endógenos para captação de ferro e que estas moléculas são importantes para seu estabelecimento no hospedeiro. / The low solubility of iron imposes challenges for its uptake by bacteria and other organisms. An effective solution to this problem is the use of own or exogenous siderophores to solubilize the iron from environmental or host sources and transport it into the bacterial cell. In this work, we identified pathways for production and uptake of siderophores, and we defined the role of these molecules in virulence of the bacterium Chromobacterium violaceum, an abundant component of the microbiota of soil and water, which occasionally causes serious infections in humans. By performing an in silico analysis, we found several genes related with synthesis and uptake of siderophores in the genome of C. violaceum ATCC 12472 within two secondary metabolite biosynthesis gene clusters. Obtaining mutant strains from several of these genes and characterizing these strains by CAS assays, growth curves under iron deficiency and growth stimulation assays revealed that C. violaceum produces endogenous siderophores. This production was shown to be dependent on the common precursor 2,3-DHBA produced by the enzymes encoded by the genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) and on two non-ribosomal peptide synthetase enzymes (NRPSs CV_1486 and CV_2233), which probably build two distinct catecholate siderophores. Each siderophore was picked up by a specific TonB-dependent receptor (RDTB), with the siderophore produced via NRPS CV_1486 being picked up by RDTB CV_1491, and the siderophore produced via NRPS CV_2233 being picked up by RDTB CV_2230, since mutants without those RDTBs accumulated siderophores in the external environment in the CAS assays. In addition to its endogenous siderophores, C. violaceum was able to use catecholate-type xenosiderophores from other bacteria via the RDTB CV_1491. Infection assays in mice revealed that both the synthesis and the uptake of its endogenous siderophores are important for the virulence of C. violaceum, since mutant strains that do not produce siderophores (?CV_1485-84-83- 82, ?CV_1485-84-83- 82/1486 :: pNPT and ?CV_1486/2233 :: pNPT) or are unable to uptake them (?CV_2230/1491) had their virulence decreased relative to the wild type strain. The data showing that the mutant strain unable to uptake both siderophores of10 C. violaceum had more pronounced attenuation of virulence and induced lower NET production in in vitro neutrophil assays suggest that the accumulation of siderophores in the infection may be beneficial to the host. Finally, we demonstrated the possibility of generating transposon mutants in C. violaceum, and by screening a collection of these mutants we identified at least one potential novel transcription factor involved in the regulation of siderophore synthesis in this bacterium. Therefore, the data obtained in this work revealed that C. violaceum uses different endogenous siderophores for iron uptake and that these molecules are important for its establishment in the host.

Os fatores de transcrição da família MarR atuam como sensores diretos de sinais intracelulares e regulam vários processos em bactérias, incluindo virulência e degradação de compostos aromáticos. Neste trabalho, identificamos de modo global os fatores de transcrição da família MarR envolvidos na virulência do patógeno oportunista de humanos Chromobacterium violaceum. Usando mutagênese por troca alélica, geramos mutantes nulos não polares para doze dos quinze reguladores da família MarR encontrados no genoma de C. violaceum. Em ensaios de virulência, quando injetados por via intraperitoneal em camundongos BALB/c, os mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 e ?CV_2726 foram menos virulentos, enquanto o mutante ?CV_1776 foi mais virulento, quando comparados à linhagem selvagem. Para os demais nove mutantes MarR não houve diferença na virulência. Para definir o regulon de alguns destes reguladores da família MarR, os perfis de expressão gênica foram determinados por ensaios de microarranjo de DNA e Northern blot para as linhagens mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 e ?CV_2726, para a linhagem selvagem superexpressando CV_2726 e para a linhagem selvagem em estresse oxidativo com hidroperóxido de cumeno (CHP). O regulon do repressor CV_1810 compreendeu dois operons divergentes, que codificam enzimas que possivelmente metabolizam compostos aromáticos, mas produtos do catabolismo destes compostos não funcionaram como ligantes capazes de antagonizar a repressão de CV_1810 no gene CV_1801. O regulon do ativador CV_2726, definido como quatorze genes comuns diferencialmente expressos em ensaios na ausência e na condição de superexpressão do gene CV_2726, revelou poucos genes (cstA) com potencial de estar envolvidos no fenótipo de menor virulência do mutante ?CV_2726. Os reguladores CV_0577 e CV_1776 foram alocados na subfamília UrtR de resposta a urato e provavelmente influenciam a virulência de C. violaceum com regulons sobrepostos. O regulon de CV_1776 abrangeu dezenas de genes, muitos deles relacionados ao catabolismo de aminoácidos, mas há poucos candidatos a fatores de 10 virulência clássicos (pecM, escU). Alguns genes do catabolismo/utilização de purinas (CV_0578 e CV_3771) foram regulados tanto por CV_1776 quanto por CV_0577 e responderam a presença de urato. O perfil transcricional da resposta adaptativa de C. violaceum a CHP, um ligante que oxida o regulador OhrR, revelou aumento na expressão de genes relacionados à detoxificação de peróxidos (enzimas antioxidantes e sistemas redutores de tiol), degradação da porção aromática do CHP (oxigenases) e proteção contra estresses secundários (reparo de DNA, choque térmico, limitação de ferro e nitrogênio). O regulon de OhrR revelou-se pequeno, incluindo dois genes com expressão aumentada, CV_0209 (ohrA) e CV_0208 (possível diguanilato ciclase), e três genes com expressão diminuída (hemolisina, quitinase e colagenase) no mutante ?ohrR. Assim, a virulência atenuada do mutante ?ohrR deve estar relacionada ao aumento da produção do segundo mensageiro cíclico di-GMP (c-diGMP) e à diminuição da expressão de enzimas degradativas extracelulares. Em conclusão, definimos a resposta transcricional à CHP, identificamos potenciais fatores de virulência, como a diguanilato ciclase, no regulon OhrR, e mostramos que C. violaceum utiliza os fatores de transcrição da família MarR CV_0577, CV_1776, CV_2726 e OhrR para modular sua virulência. / Transcription factors belonging to the MarR family act as direct intracellular sensors of signals and control many processes in bacteria, including virulence and degradation of aromatic compounds. In this work, we identify and characterize MarR family transcription factors controlling virulence in Chromobacterium violaceum, an opportunistic pathogen of humans. Using allelic exchange mutagenesis, we generate non-polar null mutants for twelve of the fifteen MarR family regulators found in the C. violaceum genome. In virulence tests, when introduced by intraperitoneal injection in BALB/c mice, the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 and ?CV_2726 mutant strains were less virulent, while the ?CV_1776 was more virulent, when compared to the wild-type strain. The other nine MarR mutants showed no difference in virulence tests. To define the regulon of some MarR family transcription factors, the gene expression profiles were determined by DNA microarray analysis and Northern blot assays for the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 and ?CV_2726 mutant strains, for the wild-type strain overexpressing CV_2726 and for the wild-type strain exposed to oxidative stress generated by cumene hydroperoxide (CHP). The CV_1810 is a repressor of a regulon that comprised two divergent operons encoding enzymes that possibly metabolize aromatic compounds, but catabolic products of these compounds did not function as ligands capable of antagonizing the repression of CV_1810 on the CV_1801 gene. The regulon of the activator CV_2726, defined as fourteen differentially expressed genes commonly found in assays in the absence and overexpression of the CV_2726 gene, revealed few genes (cstA) with potential to be involved in the phenotype of lower virulence of the ?CV_2726 mutant strain. Regulators CV_0577 and CV_1776 were allocated in the urate-responsive UrtR subfamily and probably afect the virulence of C. violaceum with overlapping regulons. The CV_1776 regulon contains dozens of genes, many of them related to amino acid catabolism, but there are few candidates for classical virulence factors (pecM, escU). Some genes related to catabolism/utilization of purine (CV_0578 and CV_3771) were 12 regulated by both CV_1776 and CV_0577 and responded to the presence of urate. The transcriptional profile of the adaptive response of C. violaceum to CHP, a ligand that oxidizes the OhrR regulator, revealed the upregulation of genes related to the detoxification of peroxides (antioxidant enzymes and thiol-reducing systems), degradation of the aromatic moiety of CHP (oxygenases), and protection against other secondary stresses (DNA repair, heat shock, iron limitation, and nitrogen starvation responses). The OhrR regulon was shown to be small, including two upregulated genes, CV_0209 (ohrA) and CV_0208 (putative diguanylate cyclase), and three downregulated genes (hemolysin, chitinase, and collagenase) in the ?ohrR mutant. Thus, the attenuated virulence of the ?ohrR mutant might be related to the increased production of the second messenger cyclic di-GMP (c-di-GMP) and the decreased expression of extracellular enzymes required for tissue dissemination, in this mutant strain. In conclusion, we have defined the transcriptional response to CHP, identified potential virulence factors such as diguanylate cyclase as members of the OhrR regulon, and shown that C. violaceum uses the transcription factors of the MarR family CV_0577, CV_1776, CV_2726 and OhrR to modulate its virulence.

O grupo de estafilococos não-aureus (SNA), frequentemente isolados de quartos mamários com mastite subclínica, ápice do teto e ambiente, possue variabilidade ecológica que desafia a compreensão da patogenia a estes atribuída. Os fatores espécie-específicos associados à essa infecção ainda não foram identificados e a susceptibilidade difere entre vacas e quartos e promove diferentes perfis de infecção. Com o objetivo de avaliar a resistência à fagocitose e atividade microbicida, comparou-se a viabilidade, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a fagocitose de neutrófilos sanguíneos de vacas primíparas e multíparas frente a distintos isolados viáveis de estafilococos. Utilizou-se doze vacas sadias (seis primíparas e seis multíparas) em terço médio de lactação e SO isolados viáveis de estafilococos (38 SNA e 12 Staphylococcus aureus) de diferentes nichos ecológicos. A viabilidade de neutrófilos (P = 0,55), produção de ERO (P = 0,12) e atividade funcional dos fagócitos (P = 0,33) foram semelhantes entre as primíparas e multíparas testadas . Contudo, foram observadas diferenças (P &le;0,05) entre os distintos grupos de espécies e estirpes de estafilococos quanto ao estímulo da produção intracelular de ERO pelos neutrófilos e à fagocitose. S. chromogenes de origens distintas, ápice do teto (P = 0,01), infecção intramamária transiente (P < 0,01) e infecção intramamárias persistente (P < 0,01) estimularam mais a produção de ERO pelos neutrófilos do que as outras espécies. Todos isolados foram fagocitados pelos neutrófilos, mas S. chromogenes resistiram mais eficientemente que as outras espécies de SNA, principalmente, S. chromogenes isolados do ápice do teto (P < 0,01). S. haemolyticus isolados do ápice do teta (P = 0,02) e infecção intramamária transiente (P < 0,01), assim como, S. fleurettii (P < 0,01), foram substancialmente fagocitados do mesmo modo que S. aureus isolado de suabe nasa\\ (P = 0,03). Mais evidente do que possíveis variações entre as respostas mamárias de primíparas e multíparas é a variação entre os SNA. Quanto mais adaptado à mama, maior resistência à fagocitose. / The group of non-aureus staphylococci (NAS), often isolated from mammary quarters with subclinical mastitis, teat apex and environment, has ecological variability that challenges the understanding of the pathogenesis attributed to them. The species-specific factors associated with this infection have not yet been identified and the susceptibility differs between cows and quarters and promotes different infection profiles. In order to evaluate the resistance to phagocytosis and I or microbicidal activity of these pathogens, the viability , intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and blood neutrophil phagocytosis of primiparous and multiparous cows were compared to different viable isolates of staphylococci. Twelve healthy cows (six primiparous and six multiparous) were used in the middle third of lactation and 50 viable isolates of staphylococci (38 SNA and 12 Staphylococcus aureus) from different ecological niches. Neutrophil viability (P = 0.55), ROS production (P = 0.12) and phagocyte functional activity (P = 0.33) were similar among the primiparous and multiparous groups tested. However, differences (P &lt;0.05) between the different groups of species and strains of staphylococci were observed for the stimulation of intracellular ROS production by neutrophils and phagocytosis. S. chromogenes of different origins, ceiling apex (P =0.01), transient intramammary infection (P &lt;0.01) and persistent intramammary infection (P &lt;0 .01) further stimulated the production of ROS by neutrophils than species. All isolates were phagocytosed by neutrophils, but S. chromogenes resisted more efficiently than the other SNA species, especially S. chromogenes isolated from the apex of the ceiling (P &lt;0.01). S. haemolyticus isolated from apex to ceiling (P =0.02) and transient (P &lt;0.01) intramammary infection, as well as S. fleurettii (P &lt;0.01), were substantially phagocytosed in the same manner as S. aureus isolated from nasal swab (P = 0.03). More evident than possible variations between mammary responses of primiparous and multiparous is the variation between ANS. The more adapted to the breast, the greater resistance to phagocytosis.

A pouca solubilidade do ferro impõe desafios para sua captação por bactérias e outros organismos. Uma solução eficaz para este problema é a utilização de sideróforos próprios ou exógenos para solubilizar o ferro do ambiente ou de proteínas do hospedeiro e transportá-lo para o interior da célula bacteriana. Neste trabalho, identificamos vias de produção e captação de ferro por sideróforos e definimos o papel destas moléculas na virulência da bactéria Chromobacterium violaceum, um abundante componente da microbiota de solo e água que ocasionalmente causa graves infecções em humanos. Por meio de análises in silico, vários genes relacionados com a síntese e captação de sideróforos foram encontrados no genoma de C. violaceum ATCC 12472 em dois clusters de síntese de metabólitos secundários. Obtenção de linhagens mutantes de vários destes genes e caracterização destas linhagens por ensaios de CAS, curvas de crescimento em carência de ferro e ensaios de estimulação de crescimento revelaram que C. violaceum produz sideróforos endógenos. Essa produção mostrou-se dependente do percursor comum 2,3-DHBA produzido pelas enzimas codificadas pelos genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) e de duas enzimas sintetases de peptídeo não ribossomais (NRPSs CV_1486 e CV_2233), as quais provavelmente montam dois sideróforos distintos do tipo catecolato. Cada sideróforo foi captado por um receptor dependente de TonB (RDTB) específico, com o sideróforo produzido via NRPS CV_1486 sendo captado pelo RDTB CV_1491, e o sideróforo produzido via NRPS CV_2233 sendo captado pelo RDTB CV_2230, uma vez que mutantes sem esses RDTBs acumularam sideróforos no meio externo no ensaio de CAS. Além de seus sideróforos endógenos, C. violaceum foi capaz de utilizar xenosideróforos do tipo catecolato de outras bactérias via o RDTB CV_1491. Ensaios de infecção em camundongos revelaram que tanto a síntese quanto a captação de seus sideróforos endógenos são importantes para a virulência de C. violaceum, pois as linhagens mutantes que não produzem sideróforos (?CV_1485-84- 83-82, ?CV_1485-84-83-82/1486::pNPT e ?CV_1486/2233::pNPT) ou são incapazes8 de captá-los (?CV_2230/1491) tiveram sua virulência diminuída em relação a linhagem selvagem. Os dados mostrando que o mutante que não capta ambos sideróforos de C. violaceum teve atenuação mais acentuada da virulência e induziu menor produção de NET em ensaios com neutrófilos in vitro sugerem que o acúmulo de sideróforos na infecção pode ser benéfico para o hospedeiro. Por fim, demonstramos a possibilidade de gerar mutantes de transposon em C. violaceum e ao realizarmos varredura de uma coleção destes mutantes identificamos ao menos um potencial novo fator de transcrição envolvido na regulação da síntese de sideróforo nesta bactéria. Portanto, os dados obtidos neste trabalho revelaram que C. violaceum utiliza-se de diferentes sideróforos endógenos para captação de ferro e que estas moléculas são importantes para seu estabelecimento no hospedeiro. / The low solubility of iron imposes challenges for its uptake by bacteria and other organisms. An effective solution to this problem is the use of own or exogenous siderophores to solubilize the iron from environmental or host sources and transport it into the bacterial cell. In this work, we identified pathways for production and uptake of siderophores, and we defined the role of these molecules in virulence of the bacterium Chromobacterium violaceum, an abundant component of the microbiota of soil and water, which occasionally causes serious infections in humans. By performing an in silico analysis, we found several genes related with synthesis and uptake of siderophores in the genome of C. violaceum ATCC 12472 within two secondary metabolite biosynthesis gene clusters. Obtaining mutant strains from several of these genes and characterizing these strains by CAS assays, growth curves under iron deficiency and growth stimulation assays revealed that C. violaceum produces endogenous siderophores. This production was shown to be dependent on the common precursor 2,3-DHBA produced by the enzymes encoded by the genes entCEBA (CV_1485-84-83-82) and on two non-ribosomal peptide synthetase enzymes (NRPSs CV_1486 and CV_2233), which probably build two distinct catecholate siderophores. Each siderophore was picked up by a specific TonB-dependent receptor (RDTB), with the siderophore produced via NRPS CV_1486 being picked up by RDTB CV_1491, and the siderophore produced via NRPS CV_2233 being picked up by RDTB CV_2230, since mutants without those RDTBs accumulated siderophores in the external environment in the CAS assays. In addition to its endogenous siderophores, C. violaceum was able to use catecholate-type xenosiderophores from other bacteria via the RDTB CV_1491. Infection assays in mice revealed that both the synthesis and the uptake of its endogenous siderophores are important for the virulence of C. violaceum, since mutant strains that do not produce siderophores (?CV_1485-84-83- 82, ?CV_1485-84-83- 82/1486 :: pNPT and ?CV_1486/2233 :: pNPT) or are unable to uptake them (?CV_2230/1491) had their virulence decreased relative to the wild type strain. The data showing that the mutant strain unable to uptake both siderophores of10 C. violaceum had more pronounced attenuation of virulence and induced lower NET production in in vitro neutrophil assays suggest that the accumulation of siderophores in the infection may be beneficial to the host. Finally, we demonstrated the possibility of generating transposon mutants in C. violaceum, and by screening a collection of these mutants we identified at least one potential novel transcription factor involved in the regulation of siderophore synthesis in this bacterium. Therefore, the data obtained in this work revealed that C. violaceum uses different endogenous siderophores for iron uptake and that these molecules are important for its establishment in the host.

O grupo de estafilococos não-aureus (SNA), frequentemente isolados de quartos mamários com mastite subclínica, ápice do teto e ambiente, possue variabilidade ecológica que desafia a compreensão da patogenia a estes atribuída. Os fatores espécie-específicos associados à essa infecção ainda não foram identificados e a susceptibilidade difere entre vacas e quartos e promove diferentes perfis de infecção. Com o objetivo de avaliar a resistência à fagocitose e atividade microbicida, comparou-se a viabilidade, a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a fagocitose de neutrófilos sanguíneos de vacas primíparas e multíparas frente a distintos isolados viáveis de estafilococos. Utilizou-se doze vacas sadias (seis primíparas e seis multíparas) em terço médio de lactação e SO isolados viáveis de estafilococos (38 SNA e 12 Staphylococcus aureus) de diferentes nichos ecológicos. A viabilidade de neutrófilos (P = 0,55), produção de ERO (P = 0,12) e atividade funcional dos fagócitos (P = 0,33) foram semelhantes entre as primíparas e multíparas testadas . Contudo, foram observadas diferenças (P &le;0,05) entre os distintos grupos de espécies e estirpes de estafilococos quanto ao estímulo da produção intracelular de ERO pelos neutrófilos e à fagocitose. S. chromogenes de origens distintas, ápice do teto (P = 0,01), infecção intramamária transiente (P < 0,01) e infecção intramamárias persistente (P < 0,01) estimularam mais a produção de ERO pelos neutrófilos do que as outras espécies. Todos isolados foram fagocitados pelos neutrófilos, mas S. chromogenes resistiram mais eficientemente que as outras espécies de SNA, principalmente, S. chromogenes isolados do ápice do teto (P < 0,01). S. haemolyticus isolados do ápice do teta (P = 0,02) e infecção intramamária transiente (P < 0,01), assim como, S. fleurettii (P < 0,01), foram substancialmente fagocitados do mesmo modo que S. aureus isolado de suabe nasa\\ (P = 0,03). Mais evidente do que possíveis variações entre as respostas mamárias de primíparas e multíparas é a variação entre os SNA. Quanto mais adaptado à mama, maior resistência à fagocitose. / The group of non-aureus staphylococci (NAS), often isolated from mammary quarters with subclinical mastitis, teat apex and environment, has ecological variability that challenges the understanding of the pathogenesis attributed to them. The species-specific factors associated with this infection have not yet been identified and the susceptibility differs between cows and quarters and promotes different infection profiles. In order to evaluate the resistance to phagocytosis and I or microbicidal activity of these pathogens, the viability , intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and blood neutrophil phagocytosis of primiparous and multiparous cows were compared to different viable isolates of staphylococci. Twelve healthy cows (six primiparous and six multiparous) were used in the middle third of lactation and 50 viable isolates of staphylococci (38 SNA and 12 Staphylococcus aureus) from different ecological niches. Neutrophil viability (P = 0.55), ROS production (P = 0.12) and phagocyte functional activity (P = 0.33) were similar among the primiparous and multiparous groups tested. However, differences (P &lt;0.05) between the different groups of species and strains of staphylococci were observed for the stimulation of intracellular ROS production by neutrophils and phagocytosis. S. chromogenes of different origins, ceiling apex (P =0.01), transient intramammary infection (P &lt;0.01) and persistent intramammary infection (P &lt;0 .01) further stimulated the production of ROS by neutrophils than species. All isolates were phagocytosed by neutrophils, but S. chromogenes resisted more efficiently than the other SNA species, especially S. chromogenes isolated from the apex of the ceiling (P &lt;0.01). S. haemolyticus isolated from apex to ceiling (P =0.02) and transient (P &lt;0.01) intramammary infection, as well as S. fleurettii (P &lt;0.01), were substantially phagocytosed in the same manner as S. aureus isolated from nasal swab (P = 0.03). More evident than possible variations between mammary responses of primiparous and multiparous is the variation between ANS. The more adapted to the breast, the greater resistance to phagocytosis.

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Agradecemos a compreensão. on 2017-07-26T13:34:20Z (GMT) / Submitted by DIEGO FELIPE ALVES BATISTA null (diegofelipe_vet@hotmail.com) on 2017-07-26T14:07:28Z No. of bitstreams: 1 Tese_Diego_Felipe_Alves_Batista.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T19:26:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 batista_dfa_dr_jabo.pdf: 4004591 bytes, checksum: 1de74c2da3ba5ba3e56c6bcf6f9ba6f2 (MD5) Previous issue date: 2017-07-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O tifo aviário, causado por Salmonella Gallinarum biotipo Gallinarum, é uma infecção caracterizada pela alta mortalidade nos lotes de aves suscetíveis acometidos, enquanto S. Gallinarum biotipo Pullorum, o agente da pulorose, infecta as aves de produção industrial com as quais desenvolve relação mais branda. Ainda é escasso o conhecimento sobre os mecanismos moleculares que sustentam essas diferentes interações patógeno-hospedeiro. Nesse estudo, objetivou-se investigar o efeito de deleção parcial das sequências codificantes dos genes idnT (transportador de L-idonato ou D-gluconato), idnO (5-cetogluconato redutase) e ccmH (heme liase necessária na montagem de citocromos do tipo C) sobre a patogenicidade de S. Gallinarum 287/91 (SG287/91), uma vez que seus ortólogos são pseudogenes conservados em S. Pullorum. Os clones mutantes SG∆idnTO, SG∆ccmH e SG∆ccmHidnTO foram obtidos por meio da técnica de mutação sítio-dirigida, denominada de recombinação Lambda-Red e testados em dois experimentos independentes com aves comerciais semipesadas de postura suscetíveis ao tifo aviário. No 1º experimento não se observou alteração da patogenicidade dos clones mutantes após inoculação oral, pois todos os animais infectados desenvolveram sinais clínicos típicos do tifo aviário e vieram a óbito ao longo de 12 dias pós-infecção (dpi). Apesar dos 100% de mortalidade, as infecções desenvolvidas pelos clones SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO levaram os animais a óbito dentro de 48 horas desde o aparecimento dos sinais clínicos, enquanto SG287/91 o fez em 6 dias, sugerindo aumento da virulência dos clones mutantes. No 2º experimento observou-se que as mutantes invadiram o hospedeiro a partir do intestino, embora as quantidades recuperadas de SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO nos fígados e de SG∆idnTO nos baços, no 5º dpi, foram superiores a de SG287/91, reforçando a hipótese de aumento da virulência dos clones contendo a alteração idnTO. Apesar disso, os níveis de transcrição das citocinas CXCLi2 e IL6 produzidos à infecção por SG∆idnTO e SG∆ccmHidnTO não diferiram nas tonsilas cecais nos 1º e 3º dpi e nos baços no 3º dpi em relação à infecção por SG287/91. Somente SG∆ccmH inclinou-se a estimular a transcrição de CXCLi2 e IL6 nas tonsilas cecais no 1° dpi em relação ao grupo controle, enquanto SG287/91 tendeu a suprimi-la. Porém, não houve suporte estatístico para essa observação. Os níveis de mRNA do IFNγ estavam aumentados para todas as estirpes de S. Gallinarum, mutantes ou não, porém sem diferença estatística entre eles. Os resultados do presente estudo indicam que a ruptura nos genes idnTO, e em menor grau do gene ccmH, poderiam levar a perda de “fitness” em S. Gallinarum, lhes justificando a permanência no genoma desse micro-organismo, ao contrário do que ocorre com S. Pullorum. O estudo da patogenicidade de estirpe de S. Pullorum tendo reconstituídos os genes idnTO e ccmH no seu genoma poderia esclarecer os motivos pelos quais esses foram negativamente selecionados por esse micro-organismo. / Fowl typhoid, caused by Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum, is an infectious disease which elicits high mortality into a flock of susceptible birds whereas S. Gallinarum biovar Pullorum, the aetiological agent of pullorum disease, infects poultry of commercial importance with which such a bacterium sets off a more permissive host-pathogen interaction. Little is known about the molecular mechanisms driving these distinct interplays with the host. Herein, we aimed at investigating the effect of partial deletions in the idnT (L-idonate / D-gluconate transporter), idnO (5-ketogluconase reductase) and ccmH (heme liase involved in the c-type cytochrome maturation) coding sequences on S. Gallinarum 287/91 (SG287/91) pathogenicity since they are conserved pseudogenes in S. Pullorum genomes. SG∆idnTO, SG∆ccmH and SG∆ccmHidnTO mutant strains were constructed through a one-step inactivation technique, known as Lambda-Red-mediated recombination, and tested on two independent experiments by using a commercial brown egg-producing layer line susceptible to fowl typhoid. On the experiment 1, no changing was observed in the pathogenicity of the mutant strains upon oral inoculation as the infected animals developed typical fowl typhoid clinical signs and died along 12 days post-infection (dpi). In spite of causing 100% mortality, SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO killed all the animals within 48 hours since the clinical signs appearance while SG287/91 did so in 6 days, indicating an increased virulence by these mutant strains. On the experiment 2 every mutant strain were able to invade the host system from the intestine albeit SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were recovered from livers and SG∆idnTO alone from spleens at higher numbers than was SG287/91, supporting the hypothesis of increased virulence for those clones harbouring the idnTO mutation. Despite the results above, CXCLi2 and IL6 transcription levels during infection by SG∆idnTO and SG∆ccmHidnTO were similar to that induced by SG287/91 in caecal tonsils at 1 and 3 dpi and in spleens at 3 dpi. In contrast, SG∆ccmH trended to stimulate CXCLi2 and IL6 transcription in caecal tonsils at 1 dpi when compared to the negative, control group whereas SG287/91 tended to suppress it, but no statistical significance was found for such an observation. IFNγ mRNA were augmented for all S. Gallinarum strains, mutant or not, but without statistical difference amongst them. These findings indicate that gene decay into idnTO, and at a lesser extent, into ccmH sequences might lead to the loss of fitness by S. Gallinarum, raising an explanation for their maintenance on this bacterium chromosome when the opposite happens to S. Pullorum. Studying the pathogenicity of a S. Pullorum strain possessing both the idnTO and ccmH genes in its genome could bring to light the reasons whereby such genes were negatively selected by this microorganism. / FAPESP: 2013/22920-4 / FAPESP: 2013/26127-7

Os fatores de transcrição da família MarR atuam como sensores diretos de sinais intracelulares e regulam vários processos em bactérias, incluindo virulência e degradação de compostos aromáticos. Neste trabalho, identificamos de modo global os fatores de transcrição da família MarR envolvidos na virulência do patógeno oportunista de humanos Chromobacterium violaceum. Usando mutagênese por troca alélica, geramos mutantes nulos não polares para doze dos quinze reguladores da família MarR encontrados no genoma de C. violaceum. Em ensaios de virulência, quando injetados por via intraperitoneal em camundongos BALB/c, os mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 e ?CV_2726 foram menos virulentos, enquanto o mutante ?CV_1776 foi mais virulento, quando comparados à linhagem selvagem. Para os demais nove mutantes MarR não houve diferença na virulência. Para definir o regulon de alguns destes reguladores da família MarR, os perfis de expressão gênica foram determinados por ensaios de microarranjo de DNA e Northern blot para as linhagens mutantes ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 e ?CV_2726, para a linhagem selvagem superexpressando CV_2726 e para a linhagem selvagem em estresse oxidativo com hidroperóxido de cumeno (CHP). O regulon do repressor CV_1810 compreendeu dois operons divergentes, que codificam enzimas que possivelmente metabolizam compostos aromáticos, mas produtos do catabolismo destes compostos não funcionaram como ligantes capazes de antagonizar a repressão de CV_1810 no gene CV_1801. O regulon do ativador CV_2726, definido como quatorze genes comuns diferencialmente expressos em ensaios na ausência e na condição de superexpressão do gene CV_2726, revelou poucos genes (cstA) com potencial de estar envolvidos no fenótipo de menor virulência do mutante ?CV_2726. Os reguladores CV_0577 e CV_1776 foram alocados na subfamília UrtR de resposta a urato e provavelmente influenciam a virulência de C. violaceum com regulons sobrepostos. O regulon de CV_1776 abrangeu dezenas de genes, muitos deles relacionados ao catabolismo de aminoácidos, mas há poucos candidatos a fatores de 10 virulência clássicos (pecM, escU). Alguns genes do catabolismo/utilização de purinas (CV_0578 e CV_3771) foram regulados tanto por CV_1776 quanto por CV_0577 e responderam a presença de urato. O perfil transcricional da resposta adaptativa de C. violaceum a CHP, um ligante que oxida o regulador OhrR, revelou aumento na expressão de genes relacionados à detoxificação de peróxidos (enzimas antioxidantes e sistemas redutores de tiol), degradação da porção aromática do CHP (oxigenases) e proteção contra estresses secundários (reparo de DNA, choque térmico, limitação de ferro e nitrogênio). O regulon de OhrR revelou-se pequeno, incluindo dois genes com expressão aumentada, CV_0209 (ohrA) e CV_0208 (possível diguanilato ciclase), e três genes com expressão diminuída (hemolisina, quitinase e colagenase) no mutante ?ohrR. Assim, a virulência atenuada do mutante ?ohrR deve estar relacionada ao aumento da produção do segundo mensageiro cíclico di-GMP (c-diGMP) e à diminuição da expressão de enzimas degradativas extracelulares. Em conclusão, definimos a resposta transcricional à CHP, identificamos potenciais fatores de virulência, como a diguanilato ciclase, no regulon OhrR, e mostramos que C. violaceum utiliza os fatores de transcrição da família MarR CV_0577, CV_1776, CV_2726 e OhrR para modular sua virulência. / Transcription factors belonging to the MarR family act as direct intracellular sensors of signals and control many processes in bacteria, including virulence and degradation of aromatic compounds. In this work, we identify and characterize MarR family transcription factors controlling virulence in Chromobacterium violaceum, an opportunistic pathogen of humans. Using allelic exchange mutagenesis, we generate non-polar null mutants for twelve of the fifteen MarR family regulators found in the C. violaceum genome. In virulence tests, when introduced by intraperitoneal injection in BALB/c mice, the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_0577 and ?CV_2726 mutant strains were less virulent, while the ?CV_1776 was more virulent, when compared to the wild-type strain. The other nine MarR mutants showed no difference in virulence tests. To define the regulon of some MarR family transcription factors, the gene expression profiles were determined by DNA microarray analysis and Northern blot assays for the ?CV_0210 (?ohrR), ?CV_1776, ?CV_1810 and ?CV_2726 mutant strains, for the wild-type strain overexpressing CV_2726 and for the wild-type strain exposed to oxidative stress generated by cumene hydroperoxide (CHP). The CV_1810 is a repressor of a regulon that comprised two divergent operons encoding enzymes that possibly metabolize aromatic compounds, but catabolic products of these compounds did not function as ligands capable of antagonizing the repression of CV_1810 on the CV_1801 gene. The regulon of the activator CV_2726, defined as fourteen differentially expressed genes commonly found in assays in the absence and overexpression of the CV_2726 gene, revealed few genes (cstA) with potential to be involved in the phenotype of lower virulence of the ?CV_2726 mutant strain. Regulators CV_0577 and CV_1776 were allocated in the urate-responsive UrtR subfamily and probably afect the virulence of C. violaceum with overlapping regulons. The CV_1776 regulon contains dozens of genes, many of them related to amino acid catabolism, but there are few candidates for classical virulence factors (pecM, escU). Some genes related to catabolism/utilization of purine (CV_0578 and CV_3771) were 12 regulated by both CV_1776 and CV_0577 and responded to the presence of urate. The transcriptional profile of the adaptive response of C. violaceum to CHP, a ligand that oxidizes the OhrR regulator, revealed the upregulation of genes related to the detoxification of peroxides (antioxidant enzymes and thiol-reducing systems), degradation of the aromatic moiety of CHP (oxygenases), and protection against other secondary stresses (DNA repair, heat shock, iron limitation, and nitrogen starvation responses). The OhrR regulon was shown to be small, including two upregulated genes, CV_0209 (ohrA) and CV_0208 (putative diguanylate cyclase), and three downregulated genes (hemolysin, chitinase, and collagenase) in the ?ohrR mutant. Thus, the attenuated virulence of the ?ohrR mutant might be related to the increased production of the second messenger cyclic di-GMP (c-di-GMP) and the decreased expression of extracellular enzymes required for tissue dissemination, in this mutant strain. In conclusion, we have defined the transcriptional response to CHP, identified potential virulence factors such as diguanylate cyclase as members of the OhrR regulon, and shown that C. violaceum uses the transcription factors of the MarR family CV_0577, CV_1776, CV_2726 and OhrR to modulate its virulence.