Les tauopathies sont des maladies neurodégénératives caractérisées par l’agrégation de protéine Tau. Mis à part ce marqueur pathologique commun, les tauo-pathies présentent une grande diversité, tant sur le plan clinique qu’anatomo-pathologique, qui pourrait résulter de mécanismes pathologiques différents. Un mécanisme commun pourrait impliquer de petits agrégats de type oligomériques comme étant l’espèce toxique dans les tauopathies.L’objectif de ce projet est de déveloper plusieurs modèles de tauopathies, génétiques ou sporadiques, par transfer de gène de la protéine Tau humaine à l’aide de vecteurs adéno-associés. Trois vecteurs sont utilisés, chacun induisant un phénotype spécifique. Tout d’abord, la surexpression de hTAUWT induit une hyperphosphorylation de la protéine associée à une forte mort neuronale, mais en absence d’agrégation.Sa co-expression avec le peptide pro-agrégant TauRD-ΔK280 dans le groupe hTAUProAggr promeut son agrégation, ce qui est associé à des effets neuroprotecteurs. La construction hTAUP301L induit à la fois la formation d’agrégats solubles et matures, associée à un niveau intermédiaire de toxicité. Ces résultats supportent l’idée que les formes solubles oligomériques jouent un rôle crucial dans la pathologie associée à Tau.Ces modèles rapides, obtenus après expression de Tau à des niveaux similaires, récapitulent donc la variabilité phénotypique observée dans les tauopathies humaines. Ils devraient servir dans le futur pour étudier les mécanismes sous-tendant la toxicité des différentes espèces de Tau. Ils pourraient aussi être utiles pour étudier la spécificité et la sélectivité de composés développés pour l’imagerie de Tau par tomographie par émission de positon. / Tauopathies are neurodegenerative diseases characterized by the aggregation of Tau protein. Despite this common hallmark, tauopathies exhibit a wide variety of clinical and anatomo-pathological presentations, which may possibly result from different pathological mechanisms. One hypothesized common mechanism, however, implicates small oligomeric aggregates as drivers of Tau-induced toxicity.The aim of this project was to develop models of sporadic and genetic tauopathies, using adeno-associated viruses to mediate gene transfer of human Tau to the rat brain. Three different constructs were used, each giving rise to a specific phenotype. First, hTAUWT overexpression led to a strong hyperphosphorylation of the protein which was associated with neurotoxicity in absence of any significant aggregation. Its co-expression with the pro-aggregation peptide TauRD-ΔK280 in the hTAUProAggr group strongly promoted its aggregation, with neuroprotective effects. hTAUP301L construct led to aggregation into soluble species as well as mature aggregates accompanied with an intermediate toxicity. Those results support the hypothesis that soluble oligomeric species are key players of Tau-induced neurodegeneration.Those fast developing models, obtained through similar overexpression of human Tau, thus recapitulated the phenotypic variability observed in human tauopathies. Those should prove useful in the future to study mechanisms underlying the toxicity of various Tau species. Those could also serve to study the specificity and selectivity of Tau-directed tracers for positon emission tomography (PET) imaging.

Les Tauopathies sont un ensemble de maladies neurodégénératives caractérisées par l’agrégation de la protéine Tau dans les neurones, astrocytes et autres types cellulaires. Toutefois, les mécanismes sous-tendant la présence de Tau dans les astrocytes et les conséquences de Tau sur les astrocytes restent peu connus. L’objectif de ce projet a été d’étudier l’interaction entre les neurones porteurs de Tau soluble et/ou agrégée et les astrocytes avoisinants. Nous avons généré trois modèles de Tauopathie par transfert de gènes et avons caractérisé la pathologie Tau neuronale et astrocytaire par histologie et biologie moléculaire. Dans l’hippocampe, la surexpression de l’isoforme mutante hTAUP301L ou d’une forme pro-agrégeante hTAUProAggr, mais pas celle de la protéine sauvage hTAUWT, a entraîné la formation progressive d’agrégats aussi bien dans les neurones que dans les astrocytes. Nous avons montré que les inclusions astrocytaires de Tau étaient secondaires à une pathologie neuronale par différents schémas expérimentaux. En utilisant des vecteurs spécifiques de types cellulaires, nous avons également démontré le transfert bi-directionnel d’espèces de Tau entre neurones et astrocytes. Curieusement, nous avons observé une perte astrocytaire uniquement dans le subiculum du groupe hTAUWT qui ne présente pas d’inclusions astrocytaires de Tau. Nos données ont montré que, dans nos modèles, la tauopathie astrocytaire est secondaire à la présence de dégénérescences neurofibrillaires et ne résulte pas d’une agrégation liée à une surexpression réactionnelle de Tau endogène dans l’astrocyte. De plus, des amorces de Tau neuronales peuvent promouvoir l’agrégation de Tau astrocytaire et la Tau astrocytaire peut être transférée aux neurones. Par ailleurs, si les agrégats de Tau paraissent plutôt bénins pour les astrocytes, les conséquences fonctionnelles d’une telle astrogliopathie restent encore à évaluer. / Tauopathies are neurodegenerative diseases characterized by the aggregation of Tau protein in neurons, astrocytes and other cell types. However, the mechanisms leading to the presence of Tau aggregates in astrocytes and the consequences of Tau on astrocytes are poorly understood. The aim of this project was to study the relationship between neurons bearing soluble and/or aggregated Tau species and their neighboring astrocytes.We thus generated three gene transfer-based Tauopathy models and used immunohistological and molecular biology methods to characterize Tau pathology in neurons and astrocytes.In the hippocampus, overexpression of mutant hTAUP301L or that of a pro-aggregating variant hTAUProAggr, but not that of wild-type Tau hTAUWT, led to a gradual increase in the formation of aggregates not only in neurons but also in astrocytes. Using different experimental paradigms, we showed that astrocytic Tau was secondary to neuronal pathology. Using cell type-specific AAV- Tau vectors, we further demonstrated the bi-directional transfer of Tau species between neurons and astrocytes. Interestingly, we observed astrocyte loss in the subiculum only in the hTauWT group in the absence of any astrocytic Tau inclusions.Our data show that astroglial tauopathy is secondary to the presence of neurofibrillary tangles in our models and does not result from aggregation of overexpressed endogenous Tau in astrocytes. In addition, neuronal Tau seeds can promote the aggregation of astrocytic Tau and astrocytic Tau can be transferred to neurons. Furthermore, if Tau aggregates appear fairly innocuous for astrocytes, the functional consequences of such astroglial tauopathy still remain to be further assessed.

Les avancées récentes dans la technique de transgénèse utilisant l’approche AAV ont permis de générer de nouveaux modèles animaux. Depuis quelques années, le développement des modèles de la maladie de Parkinson (MP) a amélioré la compréhension des mécanismes physiopathologiques de ce trouble dégénératif. Cependant, aucun modèle mammifère ne reproduit à ce jour la neurodégénérescence liée à l’âge associée à la pathologie synucléine et la symptomatologie motrice et non motrice. L’objectif de mon travail de thèse fut de développer de nouvelles stratégies de transgénèse chez le rat en utilisant ces vecteurs viraux pour la modélisation de la MP. Le challenge est de parvenir à une infection virale la plus précoce possible afin de transduire un maximum de neurones dopaminergiques. Pour cela, différentes voies d’approche ont été testées pour améliorer le processus de transgénèse : 1) l’injection de vecteurs viraux dans le rete testis de jeunes mâles pour transduire les cellules de la lignée germinale, 2) l’injection dans les embryons pré-implantatoires, 3) l’injection in utero intracérébroventriculaire et enfin 4) l’injection intracardiaque au premier jour de vie des animaux. Parmi elles, les injections in utero et intracardiaques ont permis d’aboutir à une transduction importante d’un grand nombre de structures cérébrales avec un tropisme neuronal. Ces techniques ouvrent la voie à la génération de nouveaux modèles animaux de maladies à composante génétique et à la thérapie génique. / Recent advances in the transgenesis technique using the AAV approach have led to the generation of new animal models. In recent years, the development of models of Parkinson's disease (PD) has improved understanding of the pathophysiological mechanisms of this degenerative pathology. However, no mammalian model recapitulates the required age-dependant parkinsonian degeneration, the α-synuclein inclusion pathology and motor and non-motor symptoms. The objective of my Ph.D work was to develop new transgenesis strategies in rats using these viral vectors for modeling PD. The challenge is to achieve a viral infection as early as possible in order to transduce as many dopaminergic neurons as possible. To this end, different strategies have been tested to improve transgenesis efficacy : i) injection in rete testis in young male to transduce germinal cells, ii) injection into early stage embryos, iii) in utero intracerebroventricular injection and iv) intracardiac injection in one day-old animals. Among them, in utero and intracardiac injections led to neuronal transgene expression in most regions of the brain. These techniques pave the way for the generation of new animal models of genetic diseases and offer unique opportunities for gene therapy.

Les astrocytes sont des éléments clés de la physiologie cérébrale. Dans les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (MA), les astrocytes deviennent réactifs. Cette réactivité astrocytaire (RA) est essentiellement caractérisée par des changements morphologiques. En revanche, les effets de la réactivité sur les fonctions de support des astrocytes sont mal connus. De plus, les cascades de signalisation qui conduisent à la RA restent à déterminer. Les objectifs de ce projet étaient de : 1/ démontrer que la voie JAK2-STAT3 (Janus Kinase 2 - Signal Transducer and Activator of Transcription 3) joue un rôle central dans le contrôle de la RA au cours des maladies neurodégénératives ; 2/ comprendre quelle est l’implication de la RA dans les altérations moléculaires, cellulaires et fonctionnelles observées dans la MA. Nous avons montré que la voie JAK2-STAT3 est une cascade de signalisation centrale dans la RA (Ben Haim et al., 2015). Dans ce projet, nous démontrons en utilisant de nouveaux outils moléculaires basés sur des vecteurs viraux, que cette voie est nécessaire et suffisante à la RA. Nos résultats montrent également que la modulation de la RA dans deux modèles murins de la MA (souris APP/PS1dE9 et 3xTg-AD) influence certains index pathologiques, mais de façon contexte-dépendante. L’ensemble de ce travail a permis de valider de nouveaux outils pour étudier les astrocytes réactifs in situ et souligne l’importance et la complexité de leur fonctions au cours des maladies neurodégénératives. / Astrocytes are emerging as key players in brain physiology. In Alzheimer’s disease (AD), astrocytes become reactive. Astrocyte reactivity (AR) is essentially characterized by morphological changes. But how the normal supportive functions of astrocytes are changed by their reactive state is unclear. Moreover, signaling cascades leading to AR are not yet determined. In this study, we aim to: 1/ demonstrate the JAK2-STAT3 pathway (Janus Kinase 2 - Signal Transducer and Activator of Transcription 3) is responsible for AR in neurodegenerative diseases ; 2/ understand the contribution of reactive astrocytes to molecular, cellular and functional alterations in AD. We already reported that the JAK2- STAT3 pathway is a central cascade for AR (Ben Haim et al., 2015). Here, we demonstrate, with new molecular tools based on viral vectors, that this pathway is necessary and sufficient to AR. Our results also show that the modulation of AR in two AD mouse models (APP/PS1dE9 and 3xTg-AD mice) influence several pathological hallmarks, but in a context-dependent manner. Overall, this work has generated new original tools to study reactive astrocytes in situ and it underlines the importance and complexity of their functions in neurodegenerative diseases.

La formation et l’intégrité de la barrière hémato-rétinienne (BHR) sont nécessaires au maintien d’une bonne vision et la violation de cette barrière contribue à l’apparition d’un grand nombre de pathologies rétiniennes tel que la rétinopathie diabétique (RD) ou l’occlusion de la veine centrale de la rétine (OVCR). La dystrophine Dp71 est une protéine du cytosquelette associée à la membrane qui s’exprime majoritairement dans les cellules gliales de Müller. Son absence a été associée à une augmentation de la perméabilité vasculaire liée à la délocalisation et à la diminution de l’expression des canaux AQP4 et Kir4.1. La souris Dp71-null est donc un excellent modèle d’étude des pathologies rétiniennes présentant une rupture de la BHR. L’ensemble de nos résultats démontrent que chez la souris déficiente en Dp71 ayant une rupture de la BHR, il est possible de restaurer une perméabilité et une homéostasie rétinienne normale grâce à la surexpression de la Dp71 via les virus adéno-associés. Cette étude est à la base du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement de pathologies associées à une rupture de la BHR et à un œdème maculaire, comme la RD ou l’OVCR. / Formation and maintenance of the blood-retinal barrier (BRB) is required for proper vision and breaching of this barrier contributes to the pathology in a wide variety of retinal conditions such as diabetic retinopathy (DR) or Central retinal vein occlusion (CRVO). Dystrophin Dp71 being a key membrane cytoskeletal protein, expressed mainly in Müller glial cells, its absence has been related to BRB permeability through delocalization and down-regulation of the AQP4 and Kir4.1 channels. Dp71-null mouse is thus an excellent model to approach the study of retinal pathologies showing blood-retinal barrier permeability. Our results collectively demonstrated that in Dp71 deficient mouse with compromised barriers, normal BRB permeability and retinal homeostasis can be restored through over-expression of Dp71 via adeno-associated virus. This study is the basis for development of new therapeutic strategies in dealing with diseases with BRB breakdown and macular edema such as DR or CRVO.

La myopathie myotubulaire est une maladie musculaire congénitale très sévère. Le laboratoire d’accueil a démontré que les échantillons de muscle de patients atteints de cette maladie ainsi que le modèle murin présentent une surexpression de DNM2, alors que sa réduction par croisement génétique améliore les signes cliniques et histologiques de la maladie. Le but de ce travail consistait à développer, tester et valider des composés injectables qui ciblent DNM2 et diminuent son niveau. Deux approches thérapeutiques ont été développées l’une basée sur l’utilisation de virus adéno-associés (AAV) exprimant des shRNA, l’autre sur les oligonucleotides antisens (ASO). L’injection des vecteurs AAV-shDnm2 ou bien les ASO-Dnm2 pouvait corriger les défauts histologiques et fonctionnels des muscles des souris myopathes.Les résultats obtenus montrent le potentiel thérapeutique de la réduction de DNM2, et présente une nouvelle approche pour le traitement de la myopathie myotubulaire. / Myotubular myopathy is a severe muscle disease. We previously have shown that muscle specimens of both patients and the mouse model presented an overexpression of DNM2, while its genetic reduction prevents the development of the muscle phenotypes. The aim of this work was to develop, test and validate deliverable compounds. Two therapeutic approaches were used. Injection of antisense oligonucleotide or adeno-associated virus expressing shRNA restores a normal lifespan with improved muscle structure and function of the myopathic mice. These results demonstrate that therapeutic potential of reduction of DNM2 level and provides an attractive therapeutic strategy that could be applied to treat myotubular myopathy.

L’expression d’un transgène grâce au vecteur AAV offre une perspective thérapeutique très prometteuse dans le traitement de maladies monogéniques. Malheureusement, il apparait souvent que des réponses immunes contre le vecteur et le transgène conduisent à un rejet des cellules transduites ainsi qu’à la mise en place d’une mémoire immunitaire spécifique empêchant un nouveau traitement ultérieur. Avec la perspective d’éviter tout rejet immun des cellules transduites, j’ai développé deux approches distinctes. D’une part, nous avons développé un système dans lequel l’expression du transgène est déstabilisée dans les cellules présentatrices de l’antigène grâce à l’ajout de cibles du miRNA 142.3p qui est spécifiquement exprimé dans le système hématopoïétique. Nous avons ainsi montré que la réponse immunitaire contre le transgène était favorisée par la transduction des cellules présentatrices de l’antigène par le vecteur, conduisant à la présentation directe du produit du transgène. En comparant l’initiation des réponses immunes contre plusieurs transgènes modèles, nous avons montré que la réponse immune dirigée contre le transgène pouvait être contrôlée mais que celle-ci dépendait étroitement de l’immunogénicité intrinsèque du transgène en question, c'est-à-dire de la présence d’épitopes reconnus par des lymphocytes T CD4 auxiliaires ainsi que par les lymphocytes B. Une autre approche a concerné l’utilisation de lymphocytes T régulateurs exprimant le facteur de transcription Foxp3 (Treg) et plus particulièrement l’étude de leur mode d’induction in vivo. La présence de Treg conférant une tolérance immunitaire spécifique du transgène a été décrite dans diverses situations et les Treg induits à partir de CD4+ matures (pTreg/iTreg) semblent avoir un potentiel thérapeutique important. Cependant, la population précise de lymphocytes CD4+ à même d’être convertie en Treg n’avait pas été identifiée auparavant. Au cours de mes travaux, analysant la capacité de conversion de cellules naïves, mémoires ou de récents émigrants thymiques, j’ai mis en évidence que le potentiel de conversion des lymphocytes CD4 naïfs issus de souris âgées était diminué et que ceci était dû à une caractéristique intrinsèque des lymphocytes T CD4+ provenant de telles souris. Enfin, nous avons montré que cette faible capacité de conversion des lymphocytes CD4 naïfs en Treg était associée à un rejet de greffe accru dans un modèle de transplantation de peau, montrant que la sénescence peut impacter négativement des protocoles d’induction de tolérance faisant appel à l’induction de Treg en périphérie. / Transgene expression through AAVvectors offers a very promising therapeutic perspective in the treatment of monogenic disorders. Unfortunately, it often appears that the immune responses against the transgene and the vector lead to the rejection of transduced cells and to an establishment of a specific immune memory preventing further processing. With a view to avoid immune rejection of transduced cells, I developed two distinct approaches.First, we have developed a system where the transgene expression is destabilized in the antigen presenting cells by addition of the target miRNA 142.3p which is specifically expressed in the hematopoietic system. We have shown that the immune response against the transgene was favored by transduction of antigen presenting cells with the vector, leading to the direct presentation of the transgene product. Comparing the initiation of immune responses against more transgenes models, we showed that the immune response against the transgene could be controlled but it depended greatly on the intrinsic immunogenicity of the transgène: the presence of epitopes recognized by T helper cells and CD4 by B lymphocytes. Another approach has involved the use of regulatory T cells expressing the transcription factor Foxp3 ( Treg ) and more specifically the study of their mode of induction in vivo. The presence of Treg conferring transgene -specific immune tolerance has been described in various situations and induced Treg from CD4 + mature ( pTreg / iTreg ) appear to have a significant therapeutic potential . However, the precise population of CD4 + lymphocytes capable of being converted into Treg was not identified previously. During my work, analyzing the conversion capacity naive, memory cells or thymic recent emigrants, I highlighted that the potential of conversion of naive CD4 lymphocytes from old mice was decreased and this was due to an intrinsic defect of CD4 + T cells from such mice. Finally, we showed that low conversion ability of CD4 naive Treg was associated with an increased graft rejection in a model of skin transplantation, showing that senescence may negatively impact protocols of tolerance induction using induction of Treg in the periphery.

Mon projet de thèse a porté sur les mécanismes neurodégénératifs dans le contexte de la maladie de Parkinson (MP). Cette maladie est caractérisée notamment par la présence d’inclusions intracytoplasmiques appelées corps de Lewy, dont le composant protéique principal est l’α-synucléine. L’absence de traitements curatifs à ce jour renforce la nécessité de comprendre les processus neurodégénératifs. L’objectif de mon travail de thèse fut de proposer une approche multifactorielle, translationnelle, basée sur trois axes complémentaires: modélisation, thérapeutique et mécanistique. Premièrement, nous nous sommes intéressés à la modélisation de la MP par l’utilisation de vecteurs viraux. Cette première partie nous a permis de conclure que le vieillissement ne constitue pas un facteur de risque pour les trois espèces étudiées. Ensuite, nous avons étudié deux stratégies pour combattre la dysfonction lysosomale existant chez les patients, premièrement par une approche biotechnologique avec des nanoparticules permettant de restaurer le pH des lysosomes dysfonctionnels, et une stratégie de thérapie génique par surexpression d’un régulateur de la biogénèse lysosomale. Grâce à ce travail, nous avons démontré l’intérêt du lysosome comme cible thérapeutique. Enfin, nous nous sommes focalisés sur l’hypothèse « prion » pour les synucléinopathies. Dans ce projet, nous avons mis en œuvre une approche de modélisation chez le primate non-humain ainsi qu’une une approche thérapeutique anti-agrégative chez le rongeur. Ces travaux mettent en évidence le rôle clé de l’α-synucléine dans l’étiologie de la MP et proposent des pistes d’améliorations des modèles animaux actuels ainsi que des approches thérapeutiques innovantes / The aim of this work was to focus on neurodegenerative mechanisms in the context of synucleinopathies, especially on Parkinson’s disease (PD). PD is characterized by the loss of dopaminergic neurons and the presence of intracytoplasmic proteinaceous inclusions named Lewy Bodies of which α-synuclein (α-syn) is the main protein component. To date, there are no curative treatments. Elucidating mechanisms underlying neurodegeneration in PD will allow the identification of new molecular targets for therapeutic intervention. My Ph.D. work intends multifactorial and translational approaches based on modelling, therapeutic intervention and mechanistic studies. We first focused on the development of new animal models of PD based on the use of viral vector-mediated overexpression of α-syn. This word allowed us to conclude on the absence of additive effect of ageing in α-syn-related toxicity, at least in the three investigated species. Then, we worked on two therapeutic strategies to overcome the lysosomal dysfunction occurring in PD. To do so, we first developed a biotechnological approach based on the use of acidic nanoparticles restoring acidic pH of sick lysosomes, and then we used a gene therapy approach based on the overexpression on a central modulator lysosomal biogenesis. We here demonstrated the interest of restoration of lysosomal physiology. Finally, we tested the “prion-like” hypothesis in a cohort of nonhuman primates and assessed the efficacy of a therapeutic approach using an oligomer modulator in mice. This work highlights the central role of α-syn in PD etiology and offers innovative strategies for both modelling and therapeutic intervention.