Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

Bien que plus de 40 millions d'individus aient été infectés depuis la description du virus en 1983, aucun vaccin efficace n'a encore été développé contre l'agent étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Les échecs encourus lors des essais cliniques antérieurs résultent, entre autres, de la présence de réservoirs viraux, de la grande diversité du virus de l'immunodéficience de type 1 (VIH-1) et de sa capacité à s'évader de la réponse immunitaire. Mon projet de recherche vise à analyser la capacité d'une nouvelle préparation vaccinale à générer une réponse humorale anti-VIH. Cette stratégie est basée sur l'utilisation de pseudoparticules virales (VLPs, Virus-like particles) du VIH-1 constituées des polyprotéines virales Gag et Pol, de la protéine d'enveloppe virale, la gpl20 et de la protéine d'origine humaine CD40 ligand (CD40L). Le concept de cette nouvelle stratégie vaccinale est fondé sur des études antérieures démontrant l'efficacité de la molécule CD40L, lorsqu'additionnée au virus de l'immunodéficience simienne, à stimuler la production d'anticorps neutralisants et la sécrétion d'interleukine-12 (IL-12) laquelle induit l'activation des cellules dendritiques. L'hypothèse principale de ce projet est que l'incorporation de la molécule CD40L à la surface des VLPs du VIH-1 induit une réponse immunitaire spécifique plus forte contre le virus que les préparations vaccinales utilisant des pseudoparticules virales classiques. Les objectifs sont de produire efficacement des VLPs de VIH-1 ayant incorporées, ou non, le CD40L et d'analyser la capacité de ces différents types de pseudoparticules virales à stimuler les lymphocytes B. Malgré que la théorie sur laquelle est basé le projet supporte l'idée que les VLPs porteuses de CD40L stimulent efficacement la voie humorale de l'immunité en activant les lymphocytes B, les résultats obtenus n'ont pas permis de supporter cette hypothèse. En effet, les VLPs produites par transfection calcium-phosphate en cellules 293T n'ont pas incorporé de façon optimale la molécule CD40L à leur surface vu un assemblage intracellulaire déficient probable et n'ont subséquemment pas permis une stimulation efficace des lymphocytes B.

Ce mémoire présente la mise en place des techniques de fluorescence en milieu biologique pour mieux comprendre le principe des interactions entre macromolécules biologiques ainsi que leurs mécanismes catalytiques. Dans ce contexte, nous avons appliqué trois méthodes d'analyse de la fluorescence. Une première technique d'analyse dynamique, la spectroscopie de cross-corrélation de fluorescence, basée sur des mesures en micro-volume et sur une faible concentration moléculaire, a essentiellement été appliquée à étudier l'activité hélicase en mesurant la corrélation croisée des fluctuations de fluorescence entre deux molécules d'ADN complémentaires. En particulier, l'activité d'hélicase de la protéine E.Coli RecQ et l'activité d'annealing pour la protéine RecQ5 humaine ont été étudiées. Les performances de la technique FCCS pour appréhender l'étude des activités enzymatiques de la famille des hélicases RecQ ont été validées par nos résultats. Une deuxième technique d'analyse dynamique qui nous permet de mesurer l'anisotropie de fluorescence statique a été appliquée pour comprendre l'effet de deux voies de résistances au Raltégravir (N155H et G140S/Q148H) sur la réplication virale du virus VIH-1 et sur les propriétés enzymatiques de l'intégrase du VIH (INs). Les applications de cette technique nous ont permis de démontrer la mutation Q148H joue un rôle prépondérant pour la résistance au Raltegravir, tandis que la mutation G140S augmente la fitness virale dans le contexte de la double mutation G140S/Q148H. Une troisième technique d'analyse dynamique, le déclin de la photo luminosité résolue en temps de la fluorescence, a été appliquée à caractériser les propriétés de fluorescence de nanocristaux de CdTe couronnés par MPA. Cette approche a confirmé les avantages des nanocristaux et leurs applications pour le marquage de fluorescence. En conclusion, ce mémoire inclus les principes et les applications variées des techniques de fluorescence qui sont engagées à intégrer la domaine différente (lumière, photoniques et biologie) dans la même domaine biophotonique.

Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré 40 années de recherche sur le VIH, il n'existe toujours pas de traitement curatif ou de vaccin contre ce virus. Bien que les traitements antirétroviraux aient transformé la vie des personnes vivant avec le VIH en diminuant la mortalité et la morbidité, et en améliorant la qualité de vie, plusieurs problèmes y sont associés, comme des effets indésirables, une incapacité d'éradiquer les cellules réservoirs et une persistance de l'état inflammatoire. Donc, pour tenter d'atteindre l'objectif fixé par l'ONUSIDA de mettre fin à l'épidémie du SIDA d'ici 2030, il est primordial de développer de nouvelles molécules contre le VIH. Puisque ces nouveaux traitements ne peuvent pas être testés sur des humains pour des considérations éthiques, des modèles animaux doivent être utilisés. Les souris NSG sont des souris immunodéficientes qui peuvent accepter un greffon. L'injection de cellules souches hématopoïétiques humaines à ces souris permet le développement d'un système immunitaire humain. En effet, les souris NSG humanisées développent plusieurs types de cellules hématopoïétiques humaines comme des lymphocytes T, des lymphocytes B et des cellules myéloïdes dans le sang et dans plusieurs organes comme la rate, la moelle osseuse, les poumons et le thymus. Cependant, il y a plusieurs facteurs qui influencent le développement du greffon, comme la source des cellules hématopoïétiques injectées et le sexe des souris. Les souris NSG humanisées peuvent être infectées par le VIH par voie vaginale ou rectale, ce qui permet d'étudier l'efficacité de traitements contre ce virus. Le DCIR est une nouvelle cible proposée pour combattre l'infection par le VIH, puisque ce récepteur joue plusieurs rôles dans l'infection. Des inhibiteurs du DCIR diminuent l'infection par le VIH in vitro, mais pas in vivo chez des souris NSG humanisées infectées. Des études de relation structure-activité seraient nécessaire pour améliorer l'efficacité de ces inhibiteurs in vivo. / Despite 40 years of research on HIV, there are still no cures or vaccines that exist against this virus. Still, some major advancements were made, such as the introduction of antiretroviral therapies, which greatly reduced the mortality and the morbidity associated with the infection. Even though antiretroviral therapies changed the life of people living with HIV for the better, there are still issues with these treatments, such as side effects, inability to eradicate viral reservoirs, viral resistance, and persistence of the inflammatory state. Therefore, in order to reach UNAIDS' objective of ending the AIDS pandemic by 2030, new treatments against HIV must be developed. Since these new treatments cannot be tested on humans for ethical considerations, animal models such as humanized NSG mice must be used. NSG mice are immunodeficient mice that can accept a graft. Hence, the injection of human hematopoietic stem cells to these mice results in the development of a human immune system in these animals. Indeed, multiple human hematopoietic cell types, such as T cells, B cells and myeloid cells, are detected in the blood, the spleen, the bone marrow, the lungs and the thymus of humanized NSG mice. However, there are multiple factors that can influence the development of the human hematopoietic graft in NSG mice, such as the source of hematopoietic stem cell injected and the sex of the mice. Humanized NSG mice can be infected with HIV by vaginal and rectal routes, which allows for the study of treatments against this virus. The DCIR is a new proposed target against HIV infection since this receptor plays multiple roles during HIV infection. DCIR inhibitors limit HIV infection in vitro, but not in vivo in humanized NSG mice. Structure-activity relationship studies must be conducted in order to improve the efficacy of DCIR inhibitors in vivo.

Le DCIR, une lectine de type C, a été identifié comme un facteur facilitant le transfert des virus des cellules dendritiques vers les lymphocytes TCD4 lors de l’infection au VIH-1. Cinq isoformes différentes du DCIR existent. L’expression de certaines isoformes peut être modulée de façon indépendante dans certaines pathologies. L’hypothèse qui a été posée est que les isoformes du DCIR sont modulées au cours de l’infection au VIH-1 et qu’il est possible de générer des cellules déficientes en DCIR par la technique de CRISPR/Cas9. Les objectifs étaient de développer une PCR quantitative spécifique pour chaque isoforme du DCIR, de quantifier l’expression des isoformes du DCIR dans des cellules immunitaires de patients infectés par le VIH-1, de déterminer s’il existe des corrélations entre le patron d’expression de chaque isoforme et les données cliniques des patients VIH-1 et, finalement, de développer un outil CRISPR/Cas9 permettant le knock-out du gène du DCIR dans des cellules souches hématopoïétiques. Les résultats montrent que l’expression des isoformes 1 à 4 n’est pas modulée par l’infection au VIH-1. Cependant, une corrélation existe entre le ratio CD4/CD8 des patients traités et l’expression de l’isoforme 1 du DCIR dans les cellules polynucléées. De plus, dans les cellules mononucléées sanguines périphériques, les isoformes 1 et 3 du DCIR sont les plus exprimées et, dans les cellules sanguines polynucléées, l’isoforme 1 du DCIR est la plus exprimée. Finalement, un outil CRISPR/Cas9, permettant d’inactiver le gène du DCIR dans des cellules souches hématopoïétiques par infection lentivirale, a été développé. Ces données permettront de mieux caractériser les rôles des isoformes du DCIR, contribuant ainsi au développement de stratégies thérapeutiques ciblant cette lectine. / The C type lectin DCIR was identified as viral transfer factor from dendritic cells to CD4 T cells during HIV-1 infection. There are five known isoforms of the DCIR protein. The expression of some of these isoforms can be modulated independently in some pathologies. The hypothesis of this project is that DCIR isoforms can be modulated during HIV-1 infection and that it is possible to generate DCIR deficient cells with CRISPR/Cas9 technology. Our objectives were: to develop a specific quantitative PCR for each isoforms of DCIR; to quantify the expression of DCIR isoforms in immune cells of HIV-1 infected patients; to determine if there are correlations between the expression pattern of each isoform and the patients’ clinical data and; to develop a CRISPR/Cas9 tool allowing the knock out of the DCIR gene in hematopoietic stem cells. The results show that the expression of DCIR isoforms 1 to 4 is not modulated by HIV-1 infection. However, a positive correlation exists between the CD4/CD8 T cell ratio of treated HIV-1 patients and the expression of DCIR isoform 1 in polymorphonuclear cells. Furthermore, the DCIR isoforms 1 and 3 are the most expressed isoforms in the patients’ peripheral blood mononuclear cells, while the DCIR isoform 1 is the most expressed isoform in the patients’ polymorphonuclear cells. Finally, our CRISPR/Cas9 tool, allowing the inactivation of the DCIR gene in hematopoietic stem cells by lentiviral infection, has been developed. These results will allow us to better characterize the roles of DCIR isoforms, contributing so to the development of therapeutic strategies targeting this lectin.

Malgré l'introduction de traitements antirétroviraux efficaces, l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un problème de santé publique majeur. Le foie a été identifié parmi les organes cibles du VIH, ayant pour conséquence des altérations hépatiques associées à des comorbidités chez les individus infectés. Cet organe est composé de nombreux types cellulaires. Parmi ceux-ci, on retrouve des cellules de l'immunité adaptative, les lymphocytes T, tout comme des cellules de l'immunité innée, les cellules iNKT qui représentent d'ailleurs une sous-population de cellules T CD4. Il a été proposé que les cellules iNKT jouent un rôle de pont entre l'immunité innée et adaptative et constituent le foie lors d'une lésion hépatique. De plus, il a été démontré que ces cellules sont infectées par le VIH. Dans ce contexte, nous avons analysé la dynamique d'infection des cellules iNKT du foie et des lymphocytes T CD4 conventionnels, à titre de comparaison, dans le but d'évaluer leurs contributions au cours de l'infection virale dans notre modèle de macaque rhésus infecté par le VIS. Nos résultats ont mis en évidence la présence de cellules iNKT (*invariant natural killer T cells*), se distinguant des lymphocytes T CD4 conventionnels par l'expression des molécules CXCR6, CD161, CCR6 et CD16. Nous avons également démontré que les cellules iNKT hépatiques possèdent un phénotype TCM tandis que les lymphocytes T CD4 possèdent un phénotype TEM. De plus, notre étude montre la présence d'ADN viral au sein de ces cellules en plus des LT CD4, suggérant que les cellules iNKT du foie pourraient représenter des réservoirs viraux du VIS. / Despite the introduction of highly active antiretroviral therapy, human immunodeficiency virus (HIV) infection continues to be a major global public health issue. The liver has been identified as a target organ for HIV causing liver injuries associated with comorbidities in infected individuals. Many cellular types compose this organ. These include adaptive immunity cells, such as CD4 T lymphocytes, as well as innate immunity cells, such as iNKT cells, which also represent a subset of CD4 T cells. iNKT cells have been proposed to act as a bridge between innate and adaptive immunity and constitute the liver during liver injury. Furthermore, it has been demonstrated that these cells are infected by HIV. In this context, we analyzed the infection dynamics of iNKT cells and CD4 T conventional cells, for comparison, to evaluate their contribution during viral infection in our rhesus macaque model infected with SIV. Our results showed the presence of iNKT cells (*invariant natural killer T cells*), differing from CD4 T conventional cells by the expression of CXCR6, CCR6, CD161 and CD16 molecules. We also demonstrated that iNKT liver cells harbor a TCM phenotype whereas CD4 T cells harbor a TEM phenotype. Moreover, our data show the presence of viral DNA within these cells in addition to CD4 T cells, suggesting that iNKT cells from the liver could represent SIV viral reservoir.

Malgré 40 ans de recherche, il n'existe toujours pas de traitement pour éradiquer le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Des traitements antirétroviraux (TAR) permettent de contrôler la charge virale des personnes vivants avec le VIH-1 (PVVIH). Ces traitements améliorent la longévité et la qualité de vie des PVVIH. Cependant, l'activation immunitaire et l'inflammation chronique persistent malgré les TAR. C'est pourquoi la recherche de nouvelle cible thérapeutique ayant une action immunomodulatrice pour compléter le traitement des PVVIH est toujours d'actualité. La cellule dendritique participe aux premières étapes de l'infection et à l'orchestration de la réponse immunitaire contre le VIH-1. La cellule dendritique peut lier le VIH-1 par des récepteurs de lectines de type C dont le *dendritic cell immunoreceptor* (DCIR). La présence du DCIR permet d'augmenter l'entrée, la réplication virale ainsi que la transmission du virus sur des cellules dendritiques dérivées de monocytes et sur des lymphocytes T CD4. On sait que la liaison du VIH-1 au DCIR cause la libération de vésicules extracellulaires (VE) enrichies en protéines apoptotiques qui favorise l'apoptose des lymphocytes T CD4. Les VE sont des nanoparticules qui participent à la communication entre les cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les trois types de VE principalement étudiés sont les vésicules apoptotiques, les microvésicules et les exosomes, qui ont tous des caractéristiques différentes. Ces observations ont mené à l'hypothèse suivante : L'interaction entre le VIH-1 et le DCIR modifie la composition des VE afin de favoriser la réplication du virus et d'inhiber la réponse immunitaire. Ce projet a permis de mettre en place les modèles d'études afin de répondre à cette hypothèse, notamment l'amélioration des conditions d'infection des cellules *in vitro*, la séparation et la caractérisation des VE ainsi que l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques du DCIR et de lignées cellulaires portant un DCIR muté. / Despite 40 years of research, there is still no treatment able to eradicate the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Antiretroviral treatments (ART) make it possible to control the viral load of people living with HIV-1 (PLWH). These treatments improve longevity as well as the quality of life of PLWH. However, immune activation and chronic inflammation persist despite ART. This is why the research of new therapeutic target having an immunomodulatory action to complete the treatment of PLWH is still relevant. The dendritic cell participates in the early stages of infection and in orchestrating the immune response against HIV-1. The dendritic cell can bind HIV-1 through C-type lectin receptors like dendritic cell immunoreceptor (DCIR). The presence of DCIR increase virus entry, viral replication and viral transmission on dendritic cells derived from monocytes and on CD4 T lymphocytes. It is known that binding of HIV-1 to the receptor causes the release of extracellular vesicles (EV) enriched in apoptotic proteins that promotes apoptosis of CD4 T lymphocytes. EVs are nanoparticles that participate in communication between cells in physiological and pathological conditions. The three types of EV mainly studied are the apoptotic vesicles, the microvesicles and the exosomes which all have different characteristics. These observations led to the following hypothesis: the interaction between HIV-1 and DCIR modifies the composition of EVs to promote virus replication and inhibit the immune response. This project made it possible to set up study models in order to respond to this hypothesis, in particular the improvement of the conditions of infection of cells *in vitro*, the separation and characterization of EVs as well as the use of pharmacological inhibitors of DCIR and cell lines carrying a mutated DCIR.

L’immunopathogenèse de l’infection au VIH-1 est principalement causée par la déplétion des LT CD4 (lymphocytes T-CD4). Cette mort des LT CD4 dépend de plusieurs facteurs comme la lyse des LT CD4 infectés et la présence de vésicules extracellulaires et d’exosomes libérées par les cellules dendritiques et les LT CD4 infectés au VIH-1. L’analyse protéomique des exosomes issus des cellules dendritiques mises en culture avec le VIH-1 a révélé la présence de molécules pro-apoptotiques comme le Dap-3 (Death Associated Protein 3). Nous avons proposé comme hypothèse que le Dap-3 puisse être contenu dans d’autres types de vésicules extracellulaires et que le Dap-3 vésiculaire contribue à la déplétion des LT CD4. Après avoir optimisé l’immunobuvardage avec l’anti-Dap-3, nous avons déterminé la présence de Dap-3 dans les vésicules extracellulaires issues des cellules RAJI-CD4-DCIR infectées au VIH-1. L’utilisation de gradients de vélocité nous a permis d’observer la présence de Dap-3 dans les fractions du gradient contenant les exosomes issus des cellules RAJI-CD4-DCIR infectées, mais également dans d’autres fractions du gradient de vélocité encore non caractérisées. Chez les patients, nous avons montré une hétérogénéité des vésicules extracellulaires dans les fractions du gradient de vélocité issues des plasmas des patients VIH-1+. Ces résultats indiquent la présence de plusieurs populations de vésicules extracellulaires séparées par la méthode du gradient de vélocité. Enfin, la transfection des cellules RAJI-CD4-DCIR et des cellules dendritiques a été mise au point avec les ARN anti-sens de Dap-3 afin de produire éventuellement des vésicules Dap-3 négatives. Ce projet de recherche aura permis de valider les outils nécessaires à la poursuite de l’étude du rôle de Dap-3 dans la pathogenèse de l’infection au VIH-1.

Les Toll-Like Receptors (TLRs) jouent un rôle majeur dans la réponse immunitaire innée, en reconnaissant des motifs moléculaires précis retrouvés exclusivement chez différents pathogènes (lipopolysaccharides (LPS), peptidoglycane, flagelline, ...). Le LPS est reconnu pour favoriser la production de cytokines pro-inflammatoires (ex. IL-1, IL-8, et TNF-ot) par les monocytes/macrophages via l'induction du facteur de transcription NK-KB par le TLR4. D'autre part, le virus d'immunodéficience humaine de type I (VIH-1) possède deux sites de liaison pour NF-KB dans sa région promotrice. L'objectif de cette étude était de vérifier l'effet de la stimulation au LPS sur la réplication et la production du VIH-1 dans une lignée cellulaire macrophagique ainsi que dans les macrophages primaires humains. L'ensemble des résultats obtenus montre que le LPS augmente l'activation de la transcription dans la lignée THP89GFP, alors que le contraire est observé dans les macrophages primaires humains et ce même si l'activation de NF-KB et la production de TNF-a sont observées dans ces cellules suite à un traitement au LPS. Cette étude révèle que les conclusions faites à partir d'une lignée cellulaire bien établie ne peuvent directement être appliquées à une un modèle plus physiologique. Ainsi, la réponse aux ligands des TLR devrait être étudiée dans un système de culture cellulaire beaucoup plus proche de la situation in vivo. / Toll-Like Receptors (TLRs) play a major role in the innate immune response, by recognizing precise molecular patterns found exclusively on different pathogens (lipopolysaccharides/LPS, peptidoglycans, flagellin, etc.). LPS is known to induce the production of pro-inflammatory cytokines (e.g. IL-1, IL-8, and TNF-a) by monocytes/macrophages through TLR4-mediated induction of the transcription factor NFKB. Interestingly, HIV-1 carries two consensus NF-KB binding sequences within its promoter region. The main goal of this study is a comparison of the modulatory effect of LPS treatment on HFV-1 transcription and virus production in a promonocytic cell line and primary monocyte-derived macrophages (MDM). We found that LPS increases virus gene expression in THP89GFP cells by activation of NF-KB, which is in sharp contrast with what is seen in primary MDM even though NF-KB and TNF-a were both stimulated upon treatment of the latter cell type by LPS. More importantly, our findings reveals that conclusions made with established human-derived cell lines cannot be directly applied to the situation prevailing in a more natural cellular setting. Thus, the response to TLR ligands should be studied in an appropriate cell culture System to more closely parallel the in vivo situations.